黃河三角洲貝殼堤島濱海濕地沉積物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性特征

趙鳳娟，趙自國(guó)，夏江寶，高春明

(1.濱州學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，山東 濱州 256603；2.山東省黃河三角洲生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濱州 256603；3.山東省黃河三角洲野生植物資源開(kāi)發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，山東 濱州 256603)

貝殼堤是淤泥質(zhì)或粉砂質(zhì)海岸特有的一種灘脊類型，在黃河三角洲地區(qū)分布廣泛.濕地介于水體和陸地之間，兼有水陸特征，被譽(yù)為“自然之腎”[1].濱海濕地位于陸地和海洋生態(tài)系統(tǒng)的交錯(cuò)過(guò)渡地帶[2]，在保護(hù)海岸、防止海水入侵、調(diào)節(jié)氣候和流量、補(bǔ)充地下水、促進(jìn)元素生物地球化學(xué)循環(huán)和維護(hù)生物多樣性等方面發(fā)揮著重要作用[3].黃河三角洲貝殼堤島濱海濕地是具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)與復(fù)雜功能的生態(tài)系統(tǒng)，已經(jīng)被劃入國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū).微生物是濕地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，作為濕地生態(tài)系統(tǒng)的分解者，不僅制約著潮間帶濕地類型的分異和演替[4]，還在維持濕地物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)方面發(fā)揮著不可或缺的作用[5]，因而，在濕地沉積物微環(huán)境中扮演著極為重要的角色，如去除污染物、分解植物殘?bào)w以及促進(jìn)各類營(yíng)養(yǎng)元素的物質(zhì)循環(huán)等.為揭示濕地生物反應(yīng)器這個(gè)“黑匣子”的運(yùn)行機(jī)制，亟須解析濕地沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)特征，為了解濕地環(huán)境中微生物與環(huán)境因子、微生物與植物、微生物之間的相互關(guān)系提供數(shù)據(jù)支撐.

目前，黃河三角洲濱海濕地研究主要集中在景觀格局空間演變或退化[6-7]，土壤有機(jī)質(zhì)儲(chǔ)量估算[8]，水鹽脅迫下植被的C、N循環(huán)[9]，遺傳變異及耐受機(jī)制[10-12]以及生態(tài)地質(zhì)安全評(píng)價(jià)和修復(fù)[13-14]等方面，而對(duì)貝殼砂生境潮間帶沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)的研究還鮮有報(bào)道.貝殼堤島是由潮間帶的死亡貝類殼體及碎屑，通過(guò)波浪搬運(yùn)到高潮帶附近堆積而成，貝殼砂土粗砂粒含量高、土壤孔隙度大，在濱海濕地海陸交互、海岸帶底質(zhì)和物質(zhì)環(huán)境呈梯度變化的特殊環(huán)境中，可能有特色的微生物群落、生態(tài)分布以及功能基因資源[15].因此，本研究應(yīng)用不依賴培養(yǎng)的PCR-DGGE技術(shù)，結(jié)合構(gòu)建16S rDNA文庫(kù)，分析貝殼堤島濱海濕地沉積物微生物遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育多樣性，闡明微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性.本研究對(duì)開(kāi)發(fā)黃河三角洲濱海濕地功能微生物資源和保護(hù)該區(qū)特色濕地生態(tài)系統(tǒng)具有重要意義，也將為針對(duì)該區(qū)濕地的環(huán)境微生物修復(fù)技術(shù)研發(fā)提供參考依據(jù).

1 樣線設(shè)置與研究方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于黃河三角洲腹地山東省濱州市無(wú)棣縣西北部的典型貝殼堤島——棘家堡子島，地理坐標(biāo)為38°13′6″～38°14′8″N，117°56′5″～117°57′14″E.貝殼堤島的整體海拔多在5 m以下；土壤類型以濱海鹽土類和貝殼砂土為主，主要由風(fēng)積物和鈣質(zhì)貝殼土壤化成土；地下水礦化度較高，埋深淺；該區(qū)氣候四季分明，屬暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候，雨熱同期，年降水量為550 mm，年蒸發(fā)量為2 430.6 mm，年平均氣溫為12.36 ℃[16]；植物群落主要是鹽生、旱生灌草叢或少量的水生草本群落.

1.2 樣線設(shè)置及樣品采集

采樣地點(diǎn)為貝殼堤島的典型濱海濕地區(qū)域，沿自陸向海的方向設(shè)置4個(gè)樣線(0，1，3，5)，見(jiàn)圖1，每個(gè)樣線在高潮帶、中潮帶和低潮帶分設(shè)3個(gè)采樣點(diǎn)，共計(jì)12個(gè)采樣點(diǎn).取樣深度0～10 cm，每個(gè)樣點(diǎn)取3次，將其混合為一個(gè)樣品，編號(hào).具體的采樣點(diǎn)坐標(biāo)和樣品編號(hào)見(jiàn)表1.采樣時(shí)使用無(wú)菌鐵鏟，將沉積物樣品鏟入事先處理的無(wú)菌密封塑料袋或EP管中，迅速放入便攜式冰盒中保存.將樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，過(guò)篩(孔徑2 mm)，除去可見(jiàn)動(dòng)物殘?bào)w、貝殼或砂礫等，過(guò)篩后的沉積物多數(shù)自然風(fēng)干后，進(jìn)行理化性質(zhì)測(cè)定；另外各取5 g保存到-40 ℃條件下，用于后續(xù)沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)研究.

1.3 沉積物理化指標(biāo)測(cè)定

沉積物樣品的5個(gè)理化指標(biāo)為pH、鹽度、有機(jī)質(zhì)、總氮(TN)、總磷(TP)，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 供試沉積物樣品理化指標(biāo)

1.4 沉積物微生物總DNA提取

DNA提取利用Fast DNA Spin Kit for Soil 試劑盒(50)(MP公司，美國(guó))完成.量取解凍后的1 mL沉積物樣品，用PBS緩沖液清洗離心(14 000 g)兩次，按照試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書提取總DNA，保存于-20 ℃.通過(guò)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)獲得總DNA樣品質(zhì)量，通過(guò)Nano Drop ND-1000 微型分光光度計(jì)測(cè)定總DNA濃度.

1.5 16S rDNA V3區(qū)片段PCR擴(kuò)增

將所得高質(zhì)量基因組DNA作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)模板，選用對(duì)大多數(shù)細(xì)菌的16S rRNA 基因V3區(qū)具有特異性的引物[16]GC-341F和534R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度約194 bp.總細(xì)菌PCR引物信息見(jiàn)表3.

表3 總細(xì)菌PCR引物信息

所用50 μL PCR 反應(yīng)體系組成：37.75 μL 滅菌高純水，5 μL 10×buffer，4 μL dNTP混合物(各2.5 mmol/L)，正、反向引物(10 pmol/μL)各1 μL，0.25 μL的Taq DNA聚合酶(5 U/μL，TaKaRa)，模板DNA 1 μL.

采用配對(duì)PCR策略，第1次PCR為梯降PCR，擴(kuò)增反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，65 ℃退火1 min，72 ℃復(fù)性2 min，共20個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度下降0.5 ℃；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃復(fù)性2 min，5個(gè)循環(huán)，共25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min.第1次PCR產(chǎn)物稀釋10倍，作為第2次PCR擴(kuò)增模板，進(jìn)行第2次PCR，擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃復(fù)性2 min，共3個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸6 min.PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用于后續(xù)DGGE分析.

1.6 PCR反應(yīng)產(chǎn)物變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析

使用濃度為8%的丙烯酰胺膠(PAGE)對(duì)總細(xì)菌PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行電泳，設(shè)置變性梯度范圍為35%～55%.所用DGGE儀為Bio-Rad DGene system(Bio-Rad，美國(guó))，所用電泳緩沖液為1×TAE，運(yùn)行參數(shù)設(shè)置為60 ℃，50 V，運(yùn)行10 min；130 V運(yùn)行7 h.電泳結(jié)束后，用1∶10 000的Gelred核酸染料(Biotium公司，美國(guó))染色30 min，去離子水漂洗2次；在凝膠成像系統(tǒng)(Molecular Imager Gel DOCTM XR System，Bio-Rad，USA)紫外光(470 nm)照射下觀察并照相.用Quantity One 4.3.6 軟件(Bio-Rad，USA)對(duì)所得DGGE 圖譜進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

選擇香濃-維納多樣性指數(shù)(Shannon-Wiener diversity index，H′)[17]比較各樣品的細(xì)菌多樣性：H′=-∑PilnPi，式中：Pi=ni/N，ni為第i條條帶的多度，N為樣品中所有條帶的總多度.

采用Quantity one 軟件中的非加權(quán)組算術(shù)平均法(UPGMA，unweighted pair-group method with arithmetic means)分析比較不同沉積物樣品微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性.

1.7 DGGE條帶序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

目標(biāo)DGGE條帶回收后，先在紫外燈下將目標(biāo)條帶整體切割，對(duì)應(yīng)放入編號(hào)的EP 管中，用去離子水沖洗兩次，用50 μL TE buffer浸泡，放置于4 ℃過(guò)夜，使DNA溶解于TE buffer中.取回收后的DNA作為PCR模板，用不帶GC夾的DGGE引物(341F和534R)進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件和體系同第1次PCR，然后送往諾賽基因(北京)公司進(jìn)行測(cè)序.所用載體為pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化細(xì)胞為 Trans5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞.若樣品測(cè)序結(jié)果呈現(xiàn)非特異性，則將非特異性條帶進(jìn)行克隆測(cè)序，以便進(jìn)一步分析其群落結(jié)構(gòu).TA克隆由諾賽基因(北京)公司參照pMDTM19-T Vector Cloning Kit說(shuō)明書進(jìn)行.

將所得序列以Blast 程序在GenBank中進(jìn)行相似性比較分析，選擇與數(shù)據(jù)庫(kù)中16S rDNA序列同源性最高的序列作為參照菌株.

將所有序列用標(biāo)準(zhǔn)模式導(dǎo)入，使用Clustalx 1.83軟件進(jìn)行序列對(duì)比，發(fā)現(xiàn)序列方向差異；使用EditSeq軟件將所有序列方向調(diào)整一致；使用Editplus 3進(jìn)行建樹(shù)前的建模和模型計(jì)算分析；使用Mrbayes進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建[18]；使用treeview軟件查看構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù).

1.8 微生物多樣性與環(huán)境因子相關(guān)性分析

運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件PSW Statistics 18.0對(duì)DGGE圖譜量化后的數(shù)據(jù)和環(huán)境理化指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(PCA，Principle Component Analysis)，通過(guò)相關(guān)性分析，檢測(cè)不同樣線沉積物樣品微生物多樣性與其環(huán)境因子的相關(guān)性.

2 結(jié)果與分析

2.1 沉積物樣品總DNA提取及V3 區(qū)擴(kuò)增

通過(guò)FastDNA Spin Kit for Soil 試劑盒提取獲得的沉積物基因組DNA均在23 kb處有明顯的主帶，且無(wú)彌散或拖尾現(xiàn)象；以引物對(duì)(GC-341F和534R)進(jìn)行的V3區(qū)PCR擴(kuò)增均能夠擴(kuò)增出大小約為200 bp的DNA片段，且無(wú)明顯非特異性擴(kuò)增條帶.

2.2 沉積物樣品細(xì)菌群落遺傳多樣性

對(duì)所有沉積物樣品16S rDNA的V3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳檢測(cè)，所得DGGE指紋圖譜見(jiàn)圖2.DGGE圖譜中，電泳條帶的數(shù)量可以直觀地反映出樣品中細(xì)菌群落的遺傳多樣性.其中，不同細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)基因片段通過(guò)不同條帶顯示，條帶亮度反映出每個(gè)泳道中細(xì)菌相對(duì)生物量的大小.

利用Quantity One軟件分析電泳圖譜中每條條帶信息，對(duì)各樣品中的細(xì)菌多樣性指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)圖3.由圖3可見(jiàn)：0號(hào)樣線多樣性指數(shù)相對(duì)較低，且高、中、低潮帶樣品多樣性指數(shù)差異不大，但在1、3、5號(hào)樣線都發(fā)現(xiàn)位于低潮帶的沉積物樣品，其H′較高.

2.3 沉積物樣品細(xì)菌群落相似性

不同沉積物樣品之間細(xì)菌群落相似性比較是通過(guò)Quantity One軟件統(tǒng)計(jì)分析DGGE指紋圖譜中不同樣品之間共有條帶數(shù)目實(shí)現(xiàn)的.沉積物樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性聚類分析結(jié)果見(jiàn)圖4.由圖4可知：從總體聚類來(lái)看，貝殼堤島濱海濕地沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性較為豐富，12個(gè)沉積物樣品聚為兩大簇，5個(gè)類群；位于同一樣線的樣品傾向于越早聚類在一起，比如，J1、J2和J3(0號(hào)樣線)聚類在同一個(gè)類群；J7和J8首先聚類成一個(gè)小分支，然后很快與J9聚類在一起；J10、J11和J12(5號(hào)樣線)位于臨近的類群等.

2.4 沉積物樣品回收條帶序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)沉積物樣品J1～J12的PCR-DGGE 條帶進(jìn)行比較篩選，13條優(yōu)勢(shì)條帶通過(guò)切膠回收(圖2)，對(duì)其進(jìn)行序列測(cè)定.其中，JJ-7、JJ-9呈現(xiàn)較好的特異性，而其余11條測(cè)序呈現(xiàn)非特異性結(jié)果，通過(guò)Ta克隆進(jìn)一步深入檢測(cè)群落結(jié)構(gòu)多樣性.克隆測(cè)序結(jié)果顯示，每條條帶可獲得13～35個(gè)陽(yáng)性克隆，共計(jì)215條不同序列.每條非特異性條帶隨機(jī)選取兩條克隆測(cè)序結(jié)果，例如，JJ-1選擇JJ-1-8和JJ-1-14，加上JJ-7和JJ-9，共計(jì)24條序列，合并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建，見(jiàn)圖5.

利用Blast 程序?qū)λ眯蛄性贕enBank中進(jìn)行相似性比較分析.結(jié)果表明，22條序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中16S rDNA序列的相似性可達(dá)97%～100%，只有2條相似性稍低，為94%，并且發(fā)現(xiàn)，同源性最高的序列多數(shù)為未培養(yǎng)微生物(表4).選擇同源性最高的序列作為鑒定參照菌株，結(jié)果顯示，來(lái)自同一條帶的Ta克隆序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系可以相距很遠(yuǎn)，如JJ-3-3和JJ-3-20；而來(lái)自不同條帶的序列，可能在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上關(guān)系很近，如JJ-7和JJ-3-3.從鑒定水平來(lái)說(shuō)，有些只能鑒別到門，如Bacteroidetes(擬桿菌門)、Sphingobacteria(鞘脂桿菌門)、Chloroflexi(綠彎菌門)，多數(shù)能鑒別到屬，分屬proteobacterium(變形菌屬)、Salegentibacter(需鹽桿菌屬)、Pseudomonas(假單胞菌屬)、Marinobacter(海桿菌屬)、Halomonas(鹽單胞菌屬)、Sulfitobacter(亞硫酸桿菌屬)、Cytophaga(噬細(xì)胞菌屬)、Flavobacterium(黃桿菌屬)、Fusobacteria(梭菌屬)等，還有一類屬于Actinobacteridae(放線菌亞綱).有的(如JJ-11-15)同為DGGE電泳所得序列，為未知種屬未培養(yǎng)的細(xì)菌序列.

表4 部分測(cè)序序列BLAST分析

2.5 環(huán)境因子與樣品微生物群落多樣性關(guān)系

通過(guò)主成分分析提取到兩個(gè)主成分：PC1(39.2%)和PC2(27.0%)，累計(jì)貢獻(xiàn)率為66.2%.以PC1和PC2分別為橫軸和縱軸，以4個(gè)樣線為分組，將12個(gè)樣品做成散點(diǎn)圖，見(jiàn)圖6.由圖6可見(jiàn)：來(lái)自不同樣線的沉積物樣品可以很好地區(qū)分開(kāi).但相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，單個(gè)環(huán)境因子與遺傳多樣性之間的相關(guān)性不強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)均小于0.5.

圖6 環(huán)境變量與DGGE揭示的微生物群落多樣性PCA分析

3 討 論

本研究結(jié)果顯示：濱海濕地沉積物微生物多樣性香濃-維納指數(shù)以5號(hào)樣線低潮帶樣品最高；除0號(hào)樣線高、中、低潮帶的差異不大外，在樣線1、3、5都有發(fā)現(xiàn)，其低潮帶樣品的多樣性指數(shù)更高，說(shuō)明低潮帶的微生物群落相對(duì)更為豐富.分析原因，可能與貝殼堤島潮間帶底質(zhì)由貝砂質(zhì)、泥沙質(zhì)逐漸過(guò)渡至淤泥質(zhì)有關(guān)，更有利于有機(jī)質(zhì)積累，單個(gè)樣線沉積物在潮間帶都呈現(xiàn)出有機(jī)質(zhì)含量自陸向海遞增的趨勢(shì)也與此有關(guān).而有機(jī)碳、氮含量被認(rèn)為是微生物生長(zhǎng)的主要限制因素[19-20].

根據(jù)DGGE指紋圖譜，各沉積物樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性的UPGMA聚類結(jié)果可以反映出位于同一樣線的樣品傾向于更早聚類在一起.耦合沉積物細(xì)菌多樣性與沉積物理化指標(biāo)，通過(guò)主成分分析提取到兩個(gè)主成分：PC1(39.2%)和PC2(27.0%)，累計(jì)貢獻(xiàn)可以解釋各樣線沉積物樣品66.2%的差異，在按照主成分為橫、縱坐標(biāo)所做的PCA散點(diǎn)圖中，可以明顯區(qū)分不同樣線的沉積物樣品分布，反映出與UPGMA聚類圖相同的趨勢(shì).而多重相關(guān)性分析顯示，在多樣性指數(shù)和單個(gè)理化指標(biāo)參數(shù)之間未檢測(cè)到顯著的正或負(fù)相關(guān)關(guān)系，這可能與各采樣地點(diǎn)，尤其是不同樣線之間的環(huán)境指標(biāo)差異較大有關(guān).

DGGE指紋圖譜之所以成為一個(gè)研究細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化趨勢(shì)的常用方法，是因?yàn)樗軌蛑庇^地反映出不同沉積物樣品之間細(xì)菌組成成分的差異，借助對(duì)DGGE條帶進(jìn)行切膠回收測(cè)序便可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性組成檢測(cè)[21].本研究對(duì)不同樣線的沉積物樣品DGGE切膠回收的優(yōu)勢(shì)條帶進(jìn)行測(cè)序，其中，JJ-7和JJ-9兩條回收條帶測(cè)序獲得了特異性結(jié)果，顯示其分別屬γ-變性菌屬和黃桿菌屬.其中，γ-變性菌屬屬于變形菌門，該類群具有很強(qiáng)的適應(yīng)性，具有解磷作用；而黃桿菌屬是以產(chǎn)生黃色素為特征的一個(gè)菌屬，為條件致病菌，可引起肺炎、腦膜炎或敗血癥等，它們?cè)诘?、海水和土?沉積物)等不同環(huán)境中均有分布[22].其余11條回收條帶測(cè)序呈現(xiàn)非特異性擴(kuò)增結(jié)果，因而通過(guò)Ta克隆進(jìn)一步深入檢測(cè)其群落結(jié)構(gòu)多樣性，克隆測(cè)序結(jié)果顯示，每條條帶可獲得13～35個(gè)陽(yáng)性克隆，共計(jì)215條不同序列.盡管從技術(shù)分析精度和深度角度來(lái)看，對(duì)于微生物多樣性較高的環(huán)境樣品，PCR-DGGE技術(shù)與新興的各類高通量測(cè)序技術(shù)平臺(tái)相比，在檢測(cè)的微生物種類，以及門、屬水平的熱度分布等方面不具優(yōu)勢(shì)，但其成本低、用時(shí)少，通過(guò)耦合切膠回收及后續(xù)Ta克隆仍然可以實(shí)現(xiàn)對(duì)來(lái)自不同樣品的微生物群落多樣性進(jìn)行直觀比較，并可對(duì)其微生物的優(yōu)勢(shì)種類實(shí)現(xiàn)有效分類和甄別[23].

通過(guò)在GenBank中進(jìn)行BLAST比較分析可知，所有同源序列均得到了較高的相似性，多數(shù)在97%～100%，最低的同源性為94%.分析其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分布可知，多數(shù)屬于變形菌門，α、β和γ都有分布，屬于解磷菌，這與吳文衛(wèi)等[23]、吳玲[24]的研究結(jié)論一致；也有屬于鞘脂桿菌門，可以降解維生素，在海洋細(xì)菌中占有明顯優(yōu)勢(shì)；綠彎菌門，是一類可以通過(guò)光合作用產(chǎn)生能量的細(xì)菌；而海桿菌屬中的一些種類被報(bào)道為石油降解菌[25]；還有一部分屬于病原菌，例如擬桿菌門，其中有些種類常見(jiàn)于各類糞便；假單胞菌屬的一些桿菌，抗藥性很強(qiáng)，能引起傷口化膿性病變.近年來(lái)的海岸帶開(kāi)發(fā)，如人工養(yǎng)殖及生態(tài)旅游項(xiàng)目等，也給潮間帶微生物群落構(gòu)成帶來(lái)了一定影響.總體來(lái)看，貝殼堤島濱海濕地沉積物中功能微生物資源豐富，且通過(guò)自身代謝功能以及群落之間的協(xié)同或拮抗作用，經(jīng)長(zhǎng)期適應(yīng)濱海濕地的特殊環(huán)境，才能成為優(yōu)勢(shì)菌種.

經(jīng)鑒別的微生物絕大多數(shù)為未培養(yǎng)微生物，要具體了解這些優(yōu)勢(shì)菌群在原位生態(tài)環(huán)境中的生理生化特性及其在貝殼堤濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)中的結(jié)構(gòu)與功能，還需要進(jìn)行更加全面細(xì)致的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用精度更高的檢測(cè)技術(shù)或平臺(tái)，如Illumina等高通量測(cè)序手段[25]，或開(kāi)發(fā)新型微生物培養(yǎng)技術(shù)，并可借助BIOLOG微平板技術(shù)等[26]，對(duì)微生物群落功能開(kāi)展深入研究.本研究借助PCR-DGGE技術(shù)，初步明晰了黃河三角洲貝殼堤島濱海濕地沉積物微生物群落多樣性及其結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該區(qū)存在大量未培養(yǎng)和尚未鑒定出的微生物菌種資源，這對(duì)于貝殼堤島特色微生物資源的開(kāi)發(fā)和黃河三角洲濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)與修復(fù)都具有重要意義.

4 結(jié) 論

1)黃河三角洲貝殼堤島濱海濕地沉積物微生物多樣性指數(shù)在4個(gè)樣線上都以低潮帶微生物群落多樣性更高，與潮間帶底質(zhì)由貝砂質(zhì)、泥沙質(zhì)逐漸過(guò)渡至淤泥質(zhì)有關(guān)；沉積物樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性UPGMA聚類分析結(jié)果與耦合沉積物細(xì)菌多樣性和沉積物理化指標(biāo)所做PCA主成分分析結(jié)果趨勢(shì)相同，即位于同一樣線的樣品傾向于聚類在一起.

2)通過(guò)PCR-DGGE耦合切膠回收及后續(xù)Ta克隆測(cè)序?qū)Σ煌练e物樣品微生物的優(yōu)勢(shì)種類實(shí)現(xiàn)了有效分類和鑒別，成功構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；借助GenBank中BLAST比較，多數(shù)能夠鑒定到屬，優(yōu)勢(shì)種類來(lái)自變形菌門、鞘脂桿菌門、綠彎菌門和海桿菌屬等與解磷、降解纖維素、光合產(chǎn)能或石油烴類降解相關(guān)的菌屬；也有一定的病原菌分布，如擬桿菌門和假單胞菌屬的一些種類.

3)本研究借助PCR-DGGE技術(shù)，初步明晰了黃河三角洲貝殼堤島濱海濕地沉積物微生物群落多樣性及其結(jié)構(gòu)，對(duì)于貝殼堤島特色微生物資源的開(kāi)發(fā)和濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)與修復(fù)都具有重要意義.經(jīng)鑒別的微生物絕大多數(shù)為未培養(yǎng)微生物，需借助精度更高的檢測(cè)技術(shù)或平臺(tái)，開(kāi)發(fā)新型培養(yǎng)技術(shù)，開(kāi)展進(jìn)一步深入研究.