重癥流行性出血熱患者PBMC 中Fas/FasL 表達(dá)及免疫機(jī)制研究*

李珊

（福建省南平市第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 南平 353000）

流行性出血熱（Epidemic Hemorrhagic Fever,EHF）又稱腎綜合征出血熱，具有一定的地域性，山區(qū)多見(jiàn)。南平市地處閩北山區(qū)，各類嚙齒類動(dòng)物比較多見(jiàn)，是漢坦病毒攜帶的宿主[1]。每年我市EHF 發(fā)病率比較高，漢坦病毒由于具有泛嗜性的特點(diǎn)，對(duì)各臟器均有致病力，所以容易導(dǎo)致多臟器功能障礙，如不及時(shí)辨別，極易進(jìn)展為重癥病例[2]。況且本病臨床表現(xiàn)并不特異，容易誤診，往往錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)[3]。免疫損傷機(jī)制是EHF 發(fā)病的重要機(jī)制之一，F(xiàn)as/FasL 是介導(dǎo)各類細(xì)胞凋亡的重要途徑，但關(guān)于Fas 和FasL 在重癥EHF 患者不同階段外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMC）中表達(dá)情況的研究尚較少見(jiàn)[4]。本研究探討Fas/FasL在漢坦病毒感染后機(jī)體中的表達(dá)情況及其免疫反應(yīng)機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年4月至2021年4月在我院重癥監(jiān)護(hù)室住院治療的50例重癥EHF 患者為研究對(duì)象。其中男 29例，女 21例；年齡 23～76 歲。研究對(duì)象嚴(yán)格根據(jù)病情分期進(jìn)行分組，分為以下5組：發(fā)熱期組（Ⅰ期組）、低血壓休克期組（Ⅱ期組）、少尿期組（Ⅲ期組）、多尿期組（Ⅳ期組）和恢復(fù)期組（Ⅴ期組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合1986年全國(guó)流行性出血熱會(huì)議制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)，EHF 抗體IgM 陽(yáng)性，具有典型的5 期經(jīng)過(guò)，同時(shí)排除其他重癥疾病[5]?；颊呒捌浼覍賹?duì)研究?jī)?nèi)容知情并簽署知情同意書。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：2017NO.03）。

1.2 設(shè)備和試劑 高糖DMEM 培養(yǎng)液（Gibco 公司，美國(guó)）；GIS 凝膠成像分析系統(tǒng)（瓦蘭科技有限公司，上海）；高速冷速離心機(jī)（昊諾斯科技有限公司，北京）；二氧化碳培養(yǎng)箱（沃信儀器有限公司，無(wú)錫）；人Fas 單克隆抗體、兔抗人FasL 單克隆抗體（譜析生科有限公司，上海）；PBMC 分離液（益普生物科技有限公司，武漢）；人腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）的ELISA 試劑盒（心語(yǔ)生科有限公司，上海）。

1.3 PBMC 分離采集 分別抽取患者5 期的靜脈血8 ml（肝素抗凝），加入PBS 稀釋2 倍，混勻，將PBMC 分離液加入標(biāo)本中，吸出單核細(xì)胞層，再用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，離心5 min，棄上清液，制成細(xì)胞懸液，采用高糖DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.4 雙重吖啶橙（AO）/溴化乙錠（EB）染色測(cè)PBMC凋亡 將PBMC 進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)不同培養(yǎng)時(shí)間（1 h、6 h、12 h 及24 h）觀察凋亡情況，然后給予AO/EB染色，按操作步驟進(jìn)行固定、染色，最后使用熒光顯微鏡觀察。根據(jù)不同AO/EB 染色的顏色區(qū)別正常細(xì)胞、早期和晚期凋亡細(xì)胞。計(jì)算公式如下：PBMC 凋亡率＝（凋亡早期細(xì)胞+ 凋亡晚期細(xì)胞）/ 細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5 Western Blot 檢測(cè)Fas 和FasL 蛋白表達(dá) 使用分離液得到PBMC，配成細(xì)胞懸液，高糖DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)后加入胰酶吹打消化，離心（1 000 r/min，10 min）獲得 PBMC 細(xì)胞，加入裂解緩沖液，離心（1 200 r/min，15 min）獲得蛋白，同時(shí)檢測(cè)所得蛋白的濃度。根據(jù)Western Blot 操作步驟：取樣、凝膠電泳分離、濕法轉(zhuǎn)膜、移至PVDF 膜上、封閉2 h、洗膜，然后加 Fas、FasL 和 GAPDH 一抗孵育（4℃過(guò)夜），TBST 洗 30 min，重復(fù) 3 次，加入二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記）孵育2 h；最后曝光、顯影、定影；Bandscan 5.0 圖像分析出血熱患者各期蛋白的分子量，以Fas、FasL 與GAPDH 蛋白灰度值比值做結(jié)果。

1.6 RT-PCR 法檢測(cè) Fas 和 FasL mRNA 表達(dá) 每組取 100 μl 的 PBMC 細(xì)胞懸液，加入 Trizol 裂解液（200 μl），提取總 RNA，使用分光光度計(jì)檢測(cè) RNA濃度，按PCR 試劑盒步驟逆轉(zhuǎn)錄cDNA，將Fas 和FasL mRNA 的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，最后用凝膠成像系統(tǒng)分析條帶。Genbank 庫(kù)查詢目標(biāo)基因序列。見(jiàn)表1。

表1 Fas、FasL 和 β-actin 引物序列

1.7 ELISA 法檢測(cè)人 TNF-α 和 IL-6 水平 嚴(yán)格依據(jù)TNF-α 和IL-6 的酶聯(lián)試劑盒說(shuō)明書操作。

1.8 觀察指標(biāo) 比較各組PBMC 細(xì)胞凋亡率，外周血中 TNF-α、IL-6 水平，F(xiàn)as、FasL 基因和蛋白表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。各組計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用t檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重癥EHF 患者5 期PBMC 凋亡率 不同時(shí)間點(diǎn)Ⅰ期組、Ⅱ期組和Ⅲ期組PBMC 細(xì)胞凋亡率與Ⅳ期組、Ⅴ期組比較升高，尤其Ⅰ期組PBMC 凋亡率最高，各時(shí)間點(diǎn)組間比較有差異（1 h：F=29.12，P＜0.001；6 h：F=27.54，P＜0.001；12 h：F=25.23，P=0.003，24 h：F=18.17，P=0.005）。Ⅳ期組和Ⅴ期組比較提示兩組間的PBMC 凋亡率無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 重癥 EHF 患者 5 期 PBMC 凋亡率（%，）

表2 重癥 EHF 患者 5 期 PBMC 凋亡率（%，）

分組 n 1 h 6 h 12 h 24 hⅠ期組Ⅱ期組Ⅲ期組Ⅳ期組Ⅴ期組50 50 50 50 50 28.34±6.76 19.46±4.88 10.54±2.87 4.28±1.12 3.75±0.87 24.25±6.13 17.57±3.93 8.69±2.74 4.03±1.31 3.43±0.61 19.46±4.68 16.11±3.58 6.83±1.39 3.68±0.87 3.23±0.59 15.36±3.18 12.35±3.16 4.81±1.32 3.54±0.68 2.92±0.51

2.2 重癥 EHF 患者 5 期 PBMC 中 Fas 和 FasL 蛋白表達(dá) 重癥EHF 患者前3 期組Fas 和FasL 蛋白表達(dá)水平與Ⅳ期組、Ⅴ期組比較明顯升高，組間差異均有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義 （Fas：F=36.43，P＜0.001；FasL：F=33.65，P＜0.001）；Ⅳ期組和Ⅴ期組的 Fas 和 FasL 蛋白表達(dá)均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖1、表3。

圖1 重癥EHF 患者PBMC 中Fas 和FasL 蛋白表達(dá)

表3 5 期重癥 EHF 患者的 Fas 和 FasL 蛋白表達(dá)情況（ng/ml，）

表3 5 期重癥 EHF 患者的 Fas 和 FasL 蛋白表達(dá)情況（ng/ml，）

分組 n Fas FasLⅠ期組Ⅱ期組Ⅲ期組Ⅳ期組Ⅴ期組50 50 50 50 50 1.23±0.36 0.77±0.18 0.41±0.11 0.26±0.08 0.14±0.05 1.19±0.32 0.81±0.21 0.52±0.13 0.31±0.09 0.19±0.07

2.3 重癥 EHF 患者 5 期 PBMC 中 Fas 和 FasL mRNA 表達(dá) RT-PCR 結(jié)果顯示 Fas 和 FasL mRNA在Ⅰ期組、Ⅱ期組、Ⅲ期組中均呈高表達(dá)，而Ⅳ期組和Ⅴ期組中表達(dá)量比較低，組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Fas：F=15.89，P=0.007；FasL：F=14.54，P=0.011）；Ⅳ期組和Ⅴ期組的Fas 和FasL mRNA 表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

表4 5 期重癥 EHF 患者的 Fas 和 FasLmRNA 表達(dá)情況（ng/ml，）

分組 n Fas FasLⅠ期組Ⅱ期組Ⅲ期組Ⅳ期組Ⅴ期組50 50 50 50 50 9.32±2.34 7.63±1.56 5.24±1.24 2.38±0.39 1.84±0.25 11.67±3.38 9.79±2.53 6.32±1.89 2.67±0.44 1.99±0.41

2.4 重癥 EHF 患者 5 期 PBMC 中 TNF-α 和 IL-6表達(dá) 前3 期組TNF-α 和IL-6 表達(dá)水平與Ⅴ期組比較明顯升高，尤其是Ⅰ期組致炎因子水平最高，Ⅳ期組表達(dá)量水平相對(duì)較低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（TNF-α：F=42.35，P＜0.001；IL-6：F=31.27，P＜0.001）。見(jiàn)表5。

表5 重癥 EHF 患者 PBMC 中 TNF-α 和 IL-6 表達(dá)（μmol/L，）

分組 n TNF-α IL-6Ⅰ期組Ⅱ期組Ⅲ期組Ⅳ期組Ⅴ期組50 50 50 50 50 115.32±21.34 101.63±18.56 93.24±16.74 65.38±14.26 34.64±7.47 123.45±5.67 97.45±24.21 89.45±16.79 67.32±13.47 23.34±4.98

3 討論

南平地區(qū)處于山區(qū)，EHF 實(shí)質(zhì)上是一種地域性疾病，十個(gè)縣市患者臨床特點(diǎn)無(wú)明顯差異，病毒基本來(lái)源同一種屬，病毒致病力相似[6]。大多數(shù)重癥患者具有典型5 期表現(xiàn)，部分患者可出現(xiàn)多期重疊表現(xiàn)，主要的表現(xiàn)是發(fā)熱、充血、出血、腎功能異常、低血壓，甚至少尿、無(wú)尿、休克等[7～8]。漢坦病毒是一種有包膜的負(fù)鏈RNA 病毒（包括L、M 和S 3個(gè)基因組），屬布尼亞病毒科，可以編碼核蛋白、G 糖蛋白、L聚合酶蛋白[9～10]。已經(jīng)證實(shí)病毒的直接致病是主要發(fā)病機(jī)制，腎臟是主要靶器官，在早期階段即會(huì)出現(xiàn)原發(fā)性損傷，但對(duì)免疫損傷機(jī)制仍有待探索。

本研究發(fā)現(xiàn)重癥EHF 患者各期外周血PBMC的Fas 表達(dá)升高，尤其是前期階段，與恢復(fù)期的患者比較具有顯著性，發(fā)熱期患者Fas 表達(dá)明顯最強(qiáng)，隨著病程的推移，表達(dá)也逐漸下降，重癥EHF 患者各期之間存在差異。重癥EHF 患者外周血PBMC 中FasL 的表達(dá)在發(fā)熱期、低血壓休克期、少尿期也明顯增強(qiáng)，而在多尿期、恢復(fù)期患者表達(dá)相對(duì)較低。有研究表明，F(xiàn)asL 在T 淋巴細(xì)胞表達(dá)量明顯[11]，F(xiàn)asL可以與Fas 進(jìn)行結(jié)合，相互結(jié)合后機(jī)體對(duì)Fas+靶細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒的生物活性，從而反饋性引起免疫細(xì)胞凋亡。

重癥EHF 患者病程早期PBMC 凋亡率最高，而且血涂片中會(huì)發(fā)現(xiàn)大量異型淋巴細(xì)胞，實(shí)質(zhì)上也是一種免疫活化的淋巴細(xì)胞，在細(xì)胞免疫中起著重要的作用，參與機(jī)體的免疫損傷[12～13]。我們亦發(fā)現(xiàn)早期外周血PBMC 中Fas 和FasL 的表達(dá)均明顯增強(qiáng)，與漢坦病毒全身血癥的級(jí)聯(lián)爆發(fā)時(shí)間相吻合，隨著病程進(jìn)展，在疾病的多尿期和恢復(fù)期，兩者PBMC細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。重癥EHF 患者不同時(shí)期的TNF-α 和IL-6 表達(dá)水平也有所不同，均較恢復(fù)期的患者炎癥水平高，尤其是發(fā)熱期的患者炎癥指標(biāo)升高最明顯，也提示我們要遵循早診斷、早治療的原則，早期控制本病對(duì)防止重癥化是非常關(guān)鍵的[14～15]。

綜上所述，F(xiàn)as、FasL 濃度高低與機(jī)體損害的程度有關(guān)，該途徑可能介導(dǎo)重癥EHF 患者5 期發(fā)展的致病過(guò)程，對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞具有免疫調(diào)控作用；如果能有效抑制Fas/FasL 途徑，可以減輕免疫損傷，對(duì)改善病毒血癥反應(yīng)具有一定的臨床價(jià)值。