三氮脒通過激活A(yù)CE2減輕光氣誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷

李宏偉，何改花，劉江正，于衛(wèi)華，孔德欽，龍 子，劉 瑞，李文麗

(空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系軍事毒理學(xué)與防化醫(yī)學(xué)教研室，陜西省自由基生物學(xué)與醫(yī)學(xué)重點實驗室，教育部特殊作業(yè)環(huán)境危害評估與防治重點實驗室，陜西 西安 710032)

光氣，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為COCl2，是一種具有爛水果味的無色劇毒氣體，分子量為98.916，比空氣重3.4倍，常作為化學(xué)中間體用于合成農(nóng)藥、塑料和藥品等。我國作為全球最大的化工國家，光氣產(chǎn)量巨大，中毒事件時有發(fā)生。一般而言，光氣對人體的致死濃時積約為41 mg/m3×30 min，其主要靶器官是肺臟，經(jīng)過一段潛伏期后可導(dǎo)致急性肺損傷(acute lung injury，ALI)，進一步引起急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，嚴重者可導(dǎo)致死亡。因此，光氣致死的核心原因是ALI。但光氣中毒后在臨床上沒有特效的救治藥物，主要以呼吸支持和對癥治療為主，但上述臨床干預(yù)的效果有限，迫切需要找到新的、更安全和更有效的救治方法。

光氣誘導(dǎo)的ALI機制十分復(fù)雜，迄今為止仍不明確。目前公認的發(fā)病機制有酸燒傷、氧化應(yīng)激、炎癥作用、肺臟細胞凋亡、肺血氣屏障破壞等[1-2]。研究報道，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)在維持血壓穩(wěn)態(tài)以及水鹽平衡方面起著關(guān)鍵作用。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)和ACE2在發(fā)揮催化作用方面具有較高的同源性。ACE 主要催化血管緊張素(angiotensin，Ang)Ⅰ產(chǎn)生AngⅡ，進而誘導(dǎo)血管收縮。而 ACE2與 ACE 相互拮抗，主要是催化AngⅡ生成Ang-(1-7)，其功能主要是作為RAS的負向調(diào)節(jié)劑發(fā)揮作用。以往的研究表明，RAS 在ALI和ARDS中也發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[3]。目前，ACE2在光氣誘導(dǎo)ALI中的作用還不明確。本研究將探討ACE2激動劑三氮脒(diminazene aceturate，DIZE)對光氣誘導(dǎo)的ALI的保護作用及其機制，為臨床防治光氣中毒策略提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠40只，體質(zhì)量(200±20)g，購于空軍軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心，大鼠在本教研室SPF級動物飼養(yǎng)，自由攝入水和飼料，實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。動物實驗環(huán)境相對濕度(50±10) %，溫度(22±2 ) ℃，12 h/12 h交替晝夜循環(huán)， 每日觀察動物一般情況。

1.1.2 主要試劑 光氣(德國林德公司)；DIZE(Med Chem Express公司)；光氣染毒裝置(德國拜耳公司吸入毒理實驗室饋贈)；雙目生物顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；高速冷凍離心機(美國Du Pont公司)；ACE2、AngⅡ、Ang-(1-7)、IL-6和TNF-α的ELISA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)；無水乙醇、二甲苯(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；一抗ACE2、AngⅡ、Ang-(1-7)(Abcam公司)；8-OH-dG(博奧森公司)；EDTA抗原修復(fù)液(Service-bio公司)；DAPI、熒光二抗、CY3山羊抗小鼠、CY3山羊抗兔(谷歌生物有限公司)。

1.2 方法

SD雄性大鼠隨機分為4組：空氣對照組、DIZE對照組、光氣染毒組、DIZE干預(yù)組，每組10只。光氣暴露為動態(tài)染毒，吸入濃度為41 mg/m3，持續(xù)染毒30 min，對照組采用空氣模擬暴露。DIZE對照組和DIZE干預(yù)組分別在空氣暴露或光氣染毒前8、16、24 h分別三次預(yù)先腹腔注射DIZE，每次劑量為7.5 mg/kg，空氣對照組和光氣染毒組分別注射等體積生理鹽水。

染毒結(jié)束后6 h，使用50 g/L苯巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，開腹后腹主動脈取血，取出肺臟，保存于-80 ℃。將全血在室溫下放置2 h，1 000 g離心20 min，取上清，保存于-80 ℃。

1.2.1 病理組織學(xué)檢測 將右側(cè)肺浸泡于40 g/L多聚甲醛溶液中，對肺組織進行石蠟包埋處理，切片厚度為5 μm，然后進行HE染色，顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)改變。顯微鏡下病理改變主要有4種類型：①肺泡出血；②肺泡壁和血管壁炎細胞浸潤；③肺泡壁增厚；④支氣管上皮細胞脫落。組織病變程度采用五級分法，無病變或損傷范圍極少為0分；有輕度病變或病變范圍<25%為1分；有中度病變或病變范圍在25%～50%為2分；有重度病變或病變范圍在51%～75%為3分；有極重度病變或病變范圍>75%為4分。計算視野中4種病變損傷程度的得分總和；隨機選取每只小鼠右肺組織切片的10個隨機視野，計算平均值為每組最終得分。

1.2.2 組織免疫熒光染色法檢測肺組織8-OH-dG的表達 將各組大鼠的石蠟包埋肺組織切片之后，石蠟切片脫蠟，抗原修復(fù)，人工畫圓圈自發(fā)熒光淬滅，血清封閉，加一抗，盒內(nèi)4 ℃孵育過夜，然后進行洗滌，再加二抗，室溫避光孵育50 min，PBS洗滌，DAPI復(fù)染細胞核，室溫避光孵育10 min，PBS洗滌后進行封片，最后熒光顯微鏡拍照。

1.2.3 ELISA法檢測血清ACE2、AngⅡ、Ang-(1-7)、 IL-6和TNF-α的含量 應(yīng)用商品化ELISA試劑盒測定血清ACE2、AngⅡ、Ang-(1-7)、IL-6和TNF-α含量。具體步驟簡述如下：制定標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔、樣本孔對應(yīng)加樣，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體避光恒溫箱溫育60 min；重復(fù)洗板5次；每孔加入底物A和B，37 ℃避光孵育15 min，加入終止液，測定各孔A450 nm值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按回歸方程計算各個樣本相應(yīng)分子的濃度值。

2 結(jié)果

2.1 DIZE干預(yù)對光氣誘導(dǎo)大鼠ALI的影響

光鏡下觀察肺組織病理切片顯示，空氣對照組的肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔無滲出物，肺泡間質(zhì)無增厚和炎癥細胞浸潤；光氣染毒組出現(xiàn)血管壁和支氣管壁炎細胞浸潤，肺泡壁紊亂，肺泡腔大量嗜酸性物質(zhì)滲出，肺泡間隔增厚伴炎細胞浸潤；但DIZE干預(yù)組病理變化較染毒組輕(圖1)。對肺損傷進行評分，與對照組相比，光氣染毒組的肺損傷評分明顯增加，DIZE干預(yù)組的肺損傷評分顯著降低(P<0.05,圖2)。

A：空氣對照組； B：DIZE對照組； C：光氣染毒組； D：DIZE干預(yù)組。HE ×200。 圖1 大鼠肺組織病理變化

aP<0.05 vs空氣對照組； cP<0.05 vs光氣染毒組(n=8)。 圖2 急性肺損傷評分

2.2 DIZE干預(yù)對大鼠血清ACE2、AngⅡ和Ang-(1-7)含量的影響

我們通過ELISA方法測定了大鼠血清中ACE2、AngⅡ、Ang-(1-7)的含量。與對照組相比，光氣染毒組血清ACE2和Ang-(1-7)含量降低， 而AngⅡ含量顯著升高(P<0.05)；與光氣染毒組相比，DIZE干預(yù)后明顯升高了ACE2和Ang-(1-7)含量，AngⅡ含量降低(P<0.05，圖3)。

aP<0.05 vs空氣對照組; cP<0.05 vs光氣染毒組(n=8)。圖3 DIZE干預(yù)對大鼠血清ACE2、AngⅡ和Ang-(1-7)含量的影響

2.3 DIZE干預(yù)對光氣誘導(dǎo)大鼠肺組織氧化應(yīng)激損傷的影響

我們通過免疫熒光染色測定了大鼠肺臟中8-OH-dG的表達，與對照組相比，光氣染毒組肺組織8-OH-dG的表達顯著升高；與光氣染毒組相比，DIZE干預(yù)組的8-OH-dG表達明顯降低(圖4)。

2.4 DIZE干預(yù)對光氣誘導(dǎo)大鼠血清炎癥反應(yīng)的影響

我們測定了血清中TNF-α和IL-6的含量，結(jié)果顯示，與對照組相比，光氣染毒組大鼠血清中TNF-α和IL-6的水平明顯升高(P<0.05)；與光氣染毒組相比，DIZE干預(yù)組大鼠血清中TNF-α和IL-6的水平顯著下降(P<0.05,圖5)。

A：空氣對照組；B：DIZE對照組；C：光氣染毒組；D：DIZE干預(yù)組。圖4 DIZE干預(yù)對光氣誘導(dǎo)大鼠肺組織8-OH-dG表達的影響

aP<0.05 vs空氣對照組; cP<0.05 vs光氣染毒組(n=8)。圖5 DIZE干預(yù)對光氣誘導(dǎo)大鼠血清炎癥反應(yīng)的影響

3 討論

光氣作為一種重要的窒息性毒劑和化工原料，被廣泛用于戰(zhàn)爭和工業(yè)生產(chǎn)中。我國是光氣生產(chǎn)大國，年均生產(chǎn)量超過300萬噸。光氣泄露導(dǎo)致人員中毒事件在我國時有發(fā)生。光氣中毒后可引發(fā)ALI，導(dǎo)致肺水腫，患者可以死于ARDS。目前光氣所致的ALI機制不清，沒有特效救治藥物。研究表明，亞致死劑量的光氣中毒與氧化損傷、炎癥作用密切相關(guān)。

研究報道，RAS在ALI和ARDS中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。ACE2是RAS系統(tǒng)中一個重要的因子。許多研究已經(jīng)驗證ACE2在多種疾病中的作用，包括治療肺纖維化、心肌梗死、心力衰竭和肝纖維化。肺臟中，ACE2在肺血管內(nèi)皮細胞、支氣管纖毛上皮細胞和Ⅱ型肺泡上皮細胞中表達較多，ACE2主要發(fā)揮分解AngⅡ生成Ang-(1-7)的作用，即ACE2將AngⅡ代謝為 Ang-(1-7)[4]。眾多研究表明[5-6]，在ACE2基因敲除小鼠可以免受SARS-Cov和SARS-Cov-2的感染。此外，在鹽酸吸入以及感染導(dǎo)致ALI模型中，AngⅡ是誘導(dǎo)肺損傷發(fā)生和發(fā)展的致病因子，上調(diào)或激活A(yù)CE2通過拮抗AngⅡ的作用對ALI具有良好的保護作用。DIZE是一種經(jīng)典的ACE2的激活劑，在臨床上主要用來治療伊錐蟲病，安全性較好。DIZE通過激活A(yù)CE2，可將Ang Ⅱ 裂解生成Ang-(1-7)。文獻[7-10]表明，DIZE干預(yù)在心臟、腦、腎臟等方面發(fā)揮著強而有效的抗炎特性，對機體具有保護作用。例如DIZE治療可以通過抑制炎癥和凋亡，減輕LPS引起的暴發(fā)性肝炎。目前為止，DIZE作為ACE2激動劑在光氣誘導(dǎo)ALI中是否具有保護性作用未見報道。

我們的實驗結(jié)果表明，光氣染毒組大鼠血清中ACE2含量降低，發(fā)生了肺損傷； DIZE干預(yù)后，血清中ACE2含量升高，肺損傷減輕，由此說明DIZE具有激動ACE2的功能，可能發(fā)揮保護肺損傷功能。據(jù)報道，Ang-(1-7) 是由天門冬氨酸、精氨酸、纈氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、組氨酸、脯氨酸組成的7肽[11]。Ang-(1-7)除了通過上述途徑生成，也可以通過 ACE的水解直接從Ang-(1-9)生成。Ang-(1-7) 通過與Mas受體特異性結(jié)合拮抗AngⅡ的作用，發(fā)揮舒張血管、抗炎、抗增生、抗纖維化和抗肺泡上皮細胞凋亡的作用。Ang-(1-7)活化可促進一氧化氮釋放、升高超氧化物歧化酶-2表達、減少炎癥因子的產(chǎn)生。作為AngⅡ和Ang-(1-7)之間的橋梁，抑制 ACE2將導(dǎo)致AngⅡ升高和Ang-(1-7)減少。研究證明 AngⅡ水平升高是乳腺癌、COVID-19和PAH的重要危險因素。AngⅡ是RAS中目前已知最強的致炎因子。AngⅡ可以使肺部血管收縮、誘導(dǎo)炎癥因子表達，從而導(dǎo)致血管細胞膜通透性升高及肺泡上皮細胞凋亡。文獻[12]報道甲型H5N1流感病毒、H7N9禽流感病毒等感染引起的小鼠ALI模型中，同樣出現(xiàn)AngⅡ水平顯著升高。AngⅡ可通過活化NF-κB信號通路，誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β等炎癥因子表達，進一步導(dǎo)致ALI。我們觀察到光氣誘導(dǎo)大鼠ALI的血清中 Ang Ⅱ水平升高，Ang-(1-7)水平降低，而DIZE干預(yù)后，染毒大鼠血清中 Ang Ⅱ 水平下降，Ang-(1-7)水平升高，肺組織損傷明顯改善。上述結(jié)果表明，DIZE可以有效激動ACE2，使其含量增加，水解AngⅡ的能力增加，因而水解產(chǎn)物Ang-(1-7)進一步增加，通過該途徑達到保護光氣誘導(dǎo)的肺損傷的作用。

炎癥和氧化應(yīng)激之間是相互作用的，兩者在光氣誘導(dǎo)的ALI 中起到至關(guān)重要的作用[13]。大量文獻報道DIZE具有抗炎和減輕LPS誘導(dǎo)的 ALI 的功效。炎癥細胞在早期階段被激活，過度產(chǎn)生炎癥細胞因子(如TNF-α、IL-6)。這些炎癥因子導(dǎo)致肺泡上皮細胞等其他細胞的破壞，損傷肺泡毛細血管屏障，導(dǎo)致氣體交換異常和肺順應(yīng)性降低。因此，抑制促炎細胞因子產(chǎn)生對于預(yù)防炎癥反應(yīng)至關(guān)重要。8-OH-dG是活性氧(reactive oxygen species, ROS)使DNA氧化損傷的產(chǎn)物[14], 8-OH-dG在實驗和臨床中應(yīng)用普遍，在生化檢測中作為指標(biāo)之一常用來評價氧化損傷。過多的炎癥細胞的激活、促炎因子釋放可以促進ROS生成，ROS進一步使DNA氧化損傷，使8-OH-dG表達升高，導(dǎo)致肺組織進一步損傷。在本研究中，光氣染毒大鼠8-OH-dG 表達顯著升高，血清TNF-α、IL-6含量顯著增加，結(jié)合我們之前的研究結(jié)果，證實氧化應(yīng)激和炎癥作用是光氣導(dǎo)致的ALI的主要機制。DIZE干預(yù)后顯著降低光氣誘導(dǎo)大鼠TNF-α、IL-6這兩種重要促炎因子的血清含量，同時還降低了肺組織的8-OH-dG表達，提示DIZE在光氣誘導(dǎo)的ALI中具有較好的抗炎和抗氧化作用。

綜上所述，DIZE通過激活A(yù)CE2，使AngⅡ水平下降，Ang-(1-7)水平升高，進而減輕炎癥反應(yīng)和氧化損傷，最終減輕光氣誘導(dǎo)的大鼠ALI。上述結(jié)果表明，Ang Ⅱ-ACE2-Ang-(1-7)軸可能是光氣誘導(dǎo)肺水腫的重要藥理學(xué)干預(yù)靶點，ACE2激動劑是一種潛在的光氣救治藥物，其保護機制還待進一步研究。