注射用聚山梨酯80大分子雜質(zhì)參與類過敏反應(yīng)的可能機(jī)制

夏 恒，韓依倫，段金連，段為鋼

(云南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

對于以揮發(fā)油或其他脂溶性物質(zhì)為主要成分的注射劑而言，聚山梨酯80是這類注射劑引起類過敏反應(yīng)的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，典型的是魚腥草注射液[1]。目前國家對含聚山梨酯80較多的中藥注射劑，如魚腥草注射液等一直處于管制狀態(tài)。針對這種情況，在研究聚山梨酯80的雜質(zhì)安全性問題上，必須對聚山梨酯80導(dǎo)致類過敏反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)及類過敏反應(yīng)發(fā)生的可能機(jī)制進(jìn)行深度解析，從固有免疫方面揭示聚山梨酯80誘導(dǎo)類過敏反應(yīng)的可能機(jī)制，從根源上解決我國目前注射劑的窘境。

1 聚山梨酯80及其在注射劑中的作用

聚山梨酯80，化學(xué)名是聚氧乙烯20山梨醇酐單油酸酯，為淡黃色至橙黃色的黏稠液體，是一種非離子型表面活性劑，易溶于水、甲醇、乙醇和醋酸乙酯，因親水性強(qiáng)，廣泛用作難溶性藥物的增溶劑、乳化劑和穩(wěn)定劑[2]。因聚山梨酯80的毒性相對較小，已載入多國藥典中。在國家食品藥品監(jiān)督管理局目前公開的132個(gè)中藥注射劑品種資料中，使用聚山梨酯80的中藥注射劑就有37種，其制劑用量在0.1%～2.0%之間，相較于化藥、生物制劑，用量較大，因此，認(rèn)為這是聚山梨酯80國內(nèi)類過敏反應(yīng)報(bào)道明顯多于國外的主要原因之一。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，臨床上中藥注射劑所導(dǎo)致的不良反應(yīng)以類過敏反應(yīng)為主。類過敏反應(yīng)主要特點(diǎn)是沒有潛伏期和致敏過程，藥物首次進(jìn)入人體后，數(shù)分鐘或30 min內(nèi)出現(xiàn)過敏反應(yīng)，且與使用劑量、濃度顯著相關(guān)[3]，用量越大，反應(yīng)越快，癥狀更明顯，呈現(xiàn)出明顯的“量-時(shí)-效”關(guān)系，且靜脈給藥更敏感[4]，沒有抗體產(chǎn)生或淋巴細(xì)胞的參與，只發(fā)生于接受治療劑量藥物的少數(shù)個(gè)體，并且患者血清中的IgE濃度也未見明顯升高，即可產(chǎn)生過敏樣癥狀，表現(xiàn)為：局部皮膚如頭面胸部及四肢的血管擴(kuò)張、紅斑、水腫等癥狀；消化系統(tǒng)出現(xiàn)流涎、惡心、嘔吐、腹瀉等癥狀；心血管系統(tǒng)出現(xiàn)心悸、血壓升高等癥狀；呼吸系統(tǒng)出現(xiàn)胸悶、呼吸困難等癥狀，嚴(yán)重時(shí)會發(fā)生呼吸衰竭，出現(xiàn)休克，甚至死亡[5]。從免疫和炎癥的角度看，這種類過敏反應(yīng)實(shí)際上是機(jī)體對侵入體內(nèi)的大分子物質(zhì)的共性反應(yīng)。

2 中藥注射劑導(dǎo)致類過敏反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)不清楚

對于中藥注射劑，劉婷等[6]采用Beagle犬動(dòng)物模型靜脈給藥聚山梨酯80和含聚山梨酯80的魚腥草注射液后，均出現(xiàn)了強(qiáng)烈的類過敏反應(yīng)，而注射去除聚山梨酯80的魚腥草注射液則無類過敏反應(yīng)發(fā)生，表明魚腥草注射液所導(dǎo)致的類過敏反應(yīng)與其增溶劑聚山梨酯80存在一定關(guān)系。此外，張美玉等[7]通過對魚腥草注射劑導(dǎo)致Beagle犬發(fā)生不良反應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)聚山梨酯80可能是魚腥草注射劑引起類過敏反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。閆位娟等[8]證明了含聚山梨酯80的中藥注射劑可導(dǎo)致犬的強(qiáng)陽性類過敏反應(yīng)，研究表明聚山梨酯80通過誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生脫顆粒作用，引起組胺等過敏活性物質(zhì)釋放進(jìn)而誘發(fā)類過敏反應(yīng)。各種研究都認(rèn)為含聚山梨酯80的中藥注射劑導(dǎo)致類過敏反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)是輔料聚山梨酯80，但事實(shí)是這樣嗎？其實(shí)不然。

3 聚山梨酯80大分子雜質(zhì)是參與類過敏反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)

3.1 聚山梨酯80中的大分子雜質(zhì)

我們課題組根據(jù)對含聚山梨酯80的注射劑導(dǎo)致的類過敏反應(yīng)的研究，以及通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了注射用輔料聚山梨酯80去除大分子雜質(zhì)后其安全性得到極大的提高，從大分子雜質(zhì)角度回答了注射用聚山梨酯80存在的安全性問題，認(rèn)為類過敏反應(yīng)與大分子雜質(zhì)有關(guān)，創(chuàng)新性提出“大分子雜質(zhì)理論”[9-10]，按照吸收的一般規(guī)律，分子量越大則口服吸收越小，一般認(rèn)為分子量超過3 000的物質(zhì)是極難吸收的，即導(dǎo)致類過敏反應(yīng)的物質(zhì)主要是口服不吸收的物質(zhì)，如果按照大小分子歸類，大分子則屬于口服不能直接吸收的物質(zhì)[11]。聚山梨酯80大分子雜質(zhì)引發(fā)的不良反應(yīng)主要發(fā)生在注射劑，且靜脈注射更為嚴(yán)重，而某些口服藥和皮膚黏膜外用藥(如魚腥草合劑)含有較多的聚山梨酯80，但罕見類過敏反應(yīng)報(bào)道，說明消化道機(jī)械黏膜屏障能阻攔這種引起類過敏反應(yīng)的大分子物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體[11]。

根據(jù)結(jié)構(gòu)通式計(jì)算，聚山梨酯80的Mr為1 309，且無共軛體系，因此聚山梨酯80應(yīng)該為無色物質(zhì)，但在實(shí)際生產(chǎn)加工中聚山梨酯80為黃色黏稠液體，間接說明它是含有其他顏色的雜質(zhì)[12]，我們課題組用超濾管截留實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，注射用聚山梨酯80含有大量Mr超過10 000的雜質(zhì)，占總量的80%以上[13]。

3.2 聚山梨酯80中的小分子物質(zhì)

目前的注射劑(包括注射用輔料)生產(chǎn)工藝會無針對性地去大分子雜質(zhì)(物質(zhì))。對于以聚山梨酯80為增溶劑的中藥注射劑和其他注射劑而言，聚山梨酯80是大分子雜質(zhì)(物質(zhì))的重要來源。課題組在其他中藥注射劑方面的實(shí)驗(yàn)研究證明，去除大分子物質(zhì)能在保障中藥注射劑主要功效和主要物質(zhì)基礎(chǔ)不明顯改變的前提下，顯著提升中藥注射劑的安全性和穩(wěn)定性[14]，也證明了去除聚山梨酯80中的大分子雜質(zhì)，在臨界膠束濃度以下的增溶能力更好，安全性也得到了較大的提高[13,15]。

因此，我們明確提出注射劑導(dǎo)致的不良反應(yīng)是類過敏反應(yīng)，其中導(dǎo)致類過敏反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)是聚山梨酯80中的大分子雜質(zhì)。

4 聚山梨酯80大分子組分(雜質(zhì))參與類過敏反應(yīng)的可能機(jī)制

注射劑的類過敏反應(yīng)可用免疫反應(yīng)來解釋，免疫反應(yīng)分為固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。固有免疫反應(yīng)的特點(diǎn)是首次接觸即可發(fā)生，類過敏反應(yīng)主要屬于一種固有免疫反應(yīng)。根據(jù)機(jī)體處理外源性物質(zhì)的特點(diǎn)，外源物質(zhì)可分為大分子物質(zhì)和小分子物質(zhì)。由于皮膚屏障的存在，在正常情況下，不揮發(fā)的物質(zhì)只能從消化道入侵，由于消化液和腸道屏障的存在，大分子物質(zhì)要么被分解為小分子物質(zhì)，要么被屏障阻止，即使有小分子物質(zhì)入侵，大多能被肝臟代謝滅活最終排出體外，這也是中藥口服不良反應(yīng)遠(yuǎn)小于并少于注射給藥的原因。在正常情況下，大分子物質(zhì)無法進(jìn)入機(jī)體，但注射給藥則突破了相應(yīng)的固有免疫屏障而進(jìn)入機(jī)體，引發(fā)相應(yīng)的安全性問題。

聚山梨酯80大分子組分的入侵必然激活免疫系統(tǒng)(固有免疫)，這些大分子本身無毒害性，但作為外來物質(zhì)，容易被固有免疫系統(tǒng)識別為病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)或損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMP)而引發(fā)過激反應(yīng)，最終導(dǎo)致類過敏反應(yīng)發(fā)生，聚山梨酯80中的大分子雜質(zhì)更符合PAMP[16]。

4.1 聚山梨酯80 PAMP的可能信號通路

PAMP是指一類或一群特定病原菌(及其產(chǎn)物)共有的某些非特異性、高度保守且對病原體生存和致病性必要的分子結(jié)構(gòu)，不存在于人類，可被固有免疫細(xì)胞的模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)所識別。PRR是一類表達(dá)于固有免疫細(xì)胞表面、內(nèi)體、溶酶體、細(xì)胞質(zhì)中可識別PAMP/DAMP的識別分子，PRR與PAMP/DAMP結(jié)合后，可以迅速激活效應(yīng)細(xì)胞，產(chǎn)生快速的生物學(xué)反應(yīng)。

4.1.1 C反應(yīng)蛋白 肝臟合成的急性期蛋白，為五聚體蛋白短分子家族，識別細(xì)菌細(xì)胞壁磷酰膽堿，亦具有調(diào)理作用、參與補(bǔ)體激活及促炎作用。

4.1.2 甘露糖結(jié)合凝集素 主要在肝臟合成，作為急性期反應(yīng)蛋白存在于血漿。這種可溶性受體與病原菌的相互作用可通過調(diào)理作用促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬；活化補(bǔ)體甘露糖結(jié)合凝集素MBL途徑最終消滅病原菌，并誘導(dǎo)其他的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

4.1.3 Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR) 一類跨膜受體，僅識別表達(dá)在病原微生物上的高度保守的結(jié)構(gòu)基序，通過識別并結(jié)合相應(yīng)的PAMP或DAMP，活化細(xì)胞并表達(dá)一系列免疫效應(yīng)分子，在免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[17]。TLR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴于胞漿區(qū)的接頭蛋白分子、蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子。TLR廣泛分布于多種組織和細(xì)胞中，在各種免疫細(xì)胞中都有表達(dá)，可以識別脂類、蛋白類、核酸類的PAMP[18]。當(dāng)TLR通過識別PAMP被活化時(shí)，經(jīng)由TLR傳遞的信號激活NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子，引起多種細(xì)胞因子和趨化因子的合成和分泌，誘發(fā)炎癥反應(yīng)并介導(dǎo)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞向炎癥部位浸潤[19]。

4.1.4 甘露糖受體 C型凝集素受體家族，主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞表面，為單鏈跨膜分子，作為一個(gè)固有的PRR，是一種重要的抗原提呈分子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體?？勺R別并結(jié)合微生物細(xì)胞壁糖蛋白和糖脂組分中的末端甘露糖和巖藻糖殘基，從而介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的吞噬作用[20]。

4.1.5 清道夫受體 一大類結(jié)構(gòu)多樣的跨膜糖蛋白，其主要分布在巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和血管上皮細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面，可通過結(jié)合各種模式配體而促進(jìn)非己成分和自身修飾后成分的清除。可識別氧化的低密度脂蛋白、革蘭陽性菌脂磷壁酸、革蘭陰性菌脂多糖和完整細(xì)菌PAMP，機(jī)體衰老、突變或凋亡的細(xì)胞的DAMP，從而有效清除血液循環(huán)中的細(xì)菌和受損細(xì)胞[21]。

4.1.6 RIG-I樣受體家族 細(xì)胞質(zhì)中的一類RNA解旋酶，屬于固有免疫的PRR，其可以結(jié)合病原相關(guān)分子模式及RNA配體識別非自身的病毒RNA，激活RIG-I信號通路[22]，促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生，激發(fā)機(jī)體抗病毒反應(yīng)，抑制病毒復(fù)制和清除感染細(xì)胞。

4.1.7 NOD樣受體(NOD-like receptor，NLR)家族分布在細(xì)胞質(zhì)中，可識別細(xì)胞質(zhì)中不同的PAMP，是抗細(xì)胞內(nèi)病原菌感染的固有免疫信號通路中重要的受體。NLR的C端為LRR，主要負(fù)責(zé)識別和結(jié)合特異的PAMP和DAMP[23]。

4.1.8 NLRP亞家族與炎癥小體 NLRP是NLR中最大的亞家族，其中以NLRP3研究較多。NLRP3主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞、外周血白細(xì)胞，N末端含有PYD效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，可識別并結(jié)合MDP、細(xì)菌、mRNA等PAMP和細(xì)胞外ATP等DAMP，使NLRP3發(fā)生構(gòu)象改變，暴露NOD結(jié)構(gòu)域，繼而寡聚化，并通過PYD-PYD相互作用募集凋亡相關(guān)微粒蛋白(apoptosis-associated seck-like protein containing CARD，ASC)接頭分子，形成含有NLRP3、ASC、Cardinal和caspase-1的炎癥小體[24]。ASC通過CARD-CARD相互作用募集產(chǎn)生caspase-1，裂解pro-IL-1β和pro-IL-18，產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-18。目前已鑒定的炎癥小體有4種，分別為NLRP1炎癥小體、NLRP3炎癥小體、IPAF炎癥小體和AIM2炎癥小體，它們都含有ASC、caspase蛋白酶以及一種NLR家族蛋白或HIN200家族蛋白，并且最終可激活caspase-1和參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子[25]。

4.1.9 DNA識別受體家族 DNA識別受體包括DNA依賴的干擾素調(diào)節(jié)因子激活物(DNA-dependent activator of interferon regulatory factor，DAI)和DNA依賴性RNA聚合酶Ⅲ(polymerase Ⅲ，PolⅢ)等，可以識別細(xì)菌或病毒的DNA。DAI能夠直接結(jié)合dsDNA，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的分泌，繼而正反饋誘導(dǎo)DAI的表達(dá)[26]。PolⅢ能夠介導(dǎo)胞質(zhì)DNA的識別，并誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-β，最終激活機(jī)體固有免疫應(yīng)答，參與病毒的清除。

4.2 損傷的主要方式

4.2.1 激活補(bǔ)體系統(tǒng) 聚山梨酯80誘發(fā)類過敏反應(yīng)的臨床和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在脂質(zhì)體、靜脈藥物的膠束載體(聚氧乙烯蓖麻油、泊洛沙姆188)、靜脈造影劑這類物質(zhì)引起的類過敏反應(yīng)中，補(bǔ)體系統(tǒng)的激活均起著至關(guān)重要的作用，將其統(tǒng)稱為補(bǔ)體激活相關(guān)類過敏反應(yīng)[27]。

補(bǔ)體系統(tǒng)激活過程依據(jù)其起始順序不同，可分為經(jīng)典途徑、旁路途徑和甘露糖結(jié)合凝集素途徑3條途徑。補(bǔ)體是固有免疫中一類可溶性模式識別分子。補(bǔ)體系統(tǒng)廣泛參與了機(jī)體抗微生物防御反應(yīng)以及免疫調(diào)節(jié)，也可介導(dǎo)免疫病理的損傷性反應(yīng)，是體內(nèi)具有重要生物學(xué)作用的效應(yīng)系統(tǒng)和效應(yīng)放大系統(tǒng)，補(bǔ)體過度激活可引起肥大細(xì)胞脫顆粒，產(chǎn)生過多炎癥介質(zhì)，其介導(dǎo)的類過敏反應(yīng)是過敏性反應(yīng)類型中的重要組成部分[28]。

國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)小鼠Mrgprb2受體和人體同源MRGPRX2受體參與肥大細(xì)胞促分泌活動(dòng)，在類過敏反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[29]。此外，補(bǔ)體系統(tǒng)激活是參與類過敏反應(yīng)發(fā)生的重要機(jī)制。SZEBENI等[30]研究證明SC5b-9是補(bǔ)體系統(tǒng)激活的最終產(chǎn)物。SC5b-9為補(bǔ)體系統(tǒng)的末端復(fù)合物，由補(bǔ)體系統(tǒng)激活過程中產(chǎn)生的C5和C9因子結(jié)合后，再與S蛋白(玻璃體結(jié)合蛋白)結(jié)合而形成。Bb因子為補(bǔ)體B因子水解后的片段，為補(bǔ)體系統(tǒng)旁路激活途徑的產(chǎn)物，而C4d因子為C4水解產(chǎn)物，是補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑的產(chǎn)物。通過測定血清中SC5b-9、Bb因子、C4d，可直觀反映C5因子的裂解和清除過程，并且反映補(bǔ)體系統(tǒng)激活情況。

4.2.2 誘導(dǎo)肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒 在類過敏反應(yīng)中最常見的原因是體內(nèi)藥物刺激肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒產(chǎn)生過敏性介質(zhì)，如組胺、β-氨基己糖苷酶、類胰蛋白酶等。組胺、β-氨基己糖苷酶等過敏性介質(zhì)為預(yù)先在體內(nèi)合成的，貯存在分泌性顆粒中；而白三烯、血小板活化因子、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-8等多種細(xì)胞因子為新合成的介質(zhì)。

組胺被釋放時(shí)，可與不同部位的受體相結(jié)合，引起血管通透性增加、平滑肌收縮和分泌黏液增多等過敏樣癥狀。類胰蛋白酶具有增加血管通透性、誘發(fā)細(xì)胞因子釋放、促進(jìn)炎癥發(fā)生等功能。嗜堿性粒細(xì)胞的主要生物學(xué)功能為參與固有免疫應(yīng)答，在脂多糖或C3a、C5a作用下，可釋放胞內(nèi)活性介質(zhì)，包括促炎細(xì)胞因子IL-4、IL-6、TNF-α等，發(fā)揮趨化、致炎等反應(yīng)。李振虎等[31]通過在RBL-2H3細(xì)胞模型上測定β-氨基己糖苷酶實(shí)驗(yàn)，證實(shí)聚山梨酯80能夠顯著增加β-氨基己糖苷酶釋放，表明聚山梨酯80能夠促進(jìn)過敏性介質(zhì)的釋放，也表明類過敏反應(yīng)可能發(fā)生機(jī)制是通過提高細(xì)胞膜流動(dòng)性、促進(jìn)細(xì)胞脫顆粒釋放過敏性介質(zhì)引起[32]。有研究也證實(shí)QKLI誘導(dǎo)的RBL-2H3細(xì)胞類過敏反應(yīng)可能是基于細(xì)胞膜流動(dòng)性的變化，進(jìn)而通過PI3K-Rac1細(xì)胞運(yùn)動(dòng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)了細(xì)胞骨架的變化，而敲除Rac1則減輕了PI3K的活性和細(xì)胞骨架流動(dòng)性[33]。

5 結(jié)語

盡管注射用輔料聚山梨酯80在注射劑方面發(fā)揮著重要的作用，但在臨床運(yùn)用中也暴露了不少安全性問題。去除輔料聚山梨酯80中大分子雜質(zhì)，提高其安全性，避免聚山梨酯80被盲目替換而增加無謂的研究成本才是目前的重中之重。

我們認(rèn)為聚山梨酯80導(dǎo)致類過敏反應(yīng)屬于固有免疫，可能機(jī)制為大分子物入侵機(jī)體越過固有免疫屏障(由靜脈、肌內(nèi)注射進(jìn)入人體)，激活固有免疫分子(補(bǔ)體、細(xì)胞因子等)和固有免疫細(xì)胞(肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等)，介導(dǎo)固有免疫應(yīng)答，從固有免疫途徑來找出類過敏反應(yīng)發(fā)生的靶點(diǎn)。