高靈敏ECL-RET傳感器的構(gòu)建及其用于血清前列腺特異性抗原檢測的研究

孫瑩瑩，張佳佳，王 丹，王 蔚，郭勝男

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，遼寧 沈陽 110847）

前列腺癌是男性最常見的癌癥之一，作為一種嚴重的泌尿系統(tǒng)疾病，其死亡率在男性癌癥中排第二位，對男性的健康狀況危害極大。早在1980 年，血清前列腺特異性抗原（Prostate specific antigen，PSA）就被認為是前列腺癌早期診斷和治療中最重要的生物標志物［1］。一般認為PSA 正常值小于4 ng/mL，而癌癥患者血清中的PSA 含量高于10 ng/mL［2］。然而，有研究人員發(fā)現(xiàn)，如果人血清中的PSA 含量上升到2 ng/mL 時，患前列腺癌的風(fēng)險就大大增加［3］。目前，許多檢測方法已用于分析血清PSA，如酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）［4］、化學(xué)發(fā)光免疫分析［5］、熒光免疫分析［6］和質(zhì)譜免疫分析［7］。雖然這些方法可提供可靠的測試結(jié)果，但檢測過程復(fù)雜、耗時，價格昂貴，靈敏度不高。因此，快速、靈敏檢測血清中的PSA對前列腺癌的早期診斷具有重要意義。

電化學(xué)發(fā)光法（ECL）作為化學(xué)發(fā)光與電化學(xué)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，具有靈敏度高、背景低、操作簡單、無污染等優(yōu)點，目前被廣泛應(yīng)用于生化分析、食品農(nóng)藥檢測等領(lǐng)域［8-9］。在眾多的ECL 發(fā)光材料中，量子點以其獨特的高量子產(chǎn)率、低光漂白和高穩(wěn)定性等優(yōu)點受到廣泛關(guān)注［10］。然而，一般的二元量子點多由Ⅱ～Ⅵ族（如CdSe、CdTe等）或Ⅳ～Ⅵ族（如PbSe、PbS等）元素組成，但重金屬元素存在毒性，嚴重限制了量子點在生化分析中的應(yīng)用［11］。近年來，有學(xué)者合成出四元Cu-Zn-In-S 半導(dǎo)體納米晶（NCs）［12］。作為一種無鎘型的量子點，四元Cu-Zn-In-S除了具有優(yōu)異的光電性能、可調(diào)節(jié)的帶隙寬度等優(yōu)點外，還具有細胞毒性低、生物相容性好等特點［13-14］。因此，四元Cu-Zn-In-S 納米晶普遍應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域［15］。2018 年本課題組發(fā)現(xiàn)，在共反應(yīng)劑存在的條件下，NCs 具有與二元量子點相似的發(fā)光信號［16］，其發(fā)光信號穩(wěn)定，強度甚至高于傳統(tǒng)量子點，這說明NCs 可在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)并產(chǎn)生激發(fā)態(tài)。

電化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（ECL-RET）是一種基于電化學(xué)發(fā)光體與光譜匹配的能量受體之間的共振能量轉(zhuǎn)移的分析策略。這種分析手段具有靈敏度高、儀器設(shè)備簡單、不受散射光干擾等優(yōu)點，因此在電化學(xué)生化分析領(lǐng)域具有極大潛力［17-19］。ECL-RET 發(fā)生的前提條件是發(fā)光體的發(fā)射光譜需與能量受體的吸收光譜有效重疊［20］。迄今為止，半導(dǎo)體納米晶和貴金屬納米粒子作為發(fā)光體/能量受體對獲得了廣泛的研究。例如，Shan 等［21］報道了Mn 摻雜的CdS 與AuNPs 兩者之間的ECL-RET，并將其用于DNA 的精準檢測。He等［22］基于CdS量子點發(fā)光體與AuNP 能量受體之間的相互作用，構(gòu)建了一種靈敏檢測鉀離子的ECL-RET策略。

本文制備了一種四元Cu-Zn-In-S半導(dǎo)體納米晶，以其為ECL發(fā)光體，金納米星（AuNSs）作為猝滅探針，K2S2O8作為共反應(yīng)劑，發(fā)展了一種基于量子點ECL-RET的免疫傳感器用于PSA檢測的分析方法。在優(yōu)化條件下，該傳感器表現(xiàn)出較好的分析性能，用于人血清樣品中PSA 的檢測，所得結(jié)果與標準的化學(xué)發(fā)光法基本吻合，相對誤差較小，結(jié)果準確度良好，具有極好的臨床應(yīng)用前景。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

紫外可見吸收光譜由UV-2100 型紫外-可見分光光度計（北京瑞利公司）獲得；熒光發(fā)射光譜由日立F-7000 熒光分光光度計（日本）記錄；日立H-7650 透射電子顯微鏡（TEM）用于納米材料的形貌表征；電化學(xué)阻抗譜（EIS）由CHI 660B 電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）記錄，電解質(zhì)溶液由5 mmol/L 的K3［Fe（CN）6］/K4［Fe（CN）6］（1∶1）混合溶液組成，在電位Eo=0.17 V 下進行，頻率范圍從0.01 Hz到100000 Hz；電化學(xué)發(fā)光數(shù)據(jù)在MPI-E型電化學(xué)發(fā)光檢測儀（西安瑞邁分析儀器有限責(zé)任公司）上獲取，PMT為800 V，放大倍數(shù)為3。

Anti-PSA Ab1（PSA 抗體1）、Anti-PSA Ab2（PSA 抗體2）、PSA 抗原、牛血清蛋白（BSA）、甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）購于上海生工生物工程公司；臨床血清樣本由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供；多壁碳納米管（MWNTs，≥99%，直徑10～30 nm）購自深圳納米港有限公司；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺（EDC，98%）和N-羥基丁二酰亞胺（NHS，97%）購自Alfa Aesar 公司；1-十八烯（ODE，90%）、醋酸銦（99.99%）、乙酸亞銅、十二烷基硫醇（DDT，99.99%）、油酸（99%）、醋酸鋅（99.99%）、油胺（97%）、硫粉（99.98%）、殼聚糖（CHIT，分子量100000～300000，脫乙酰度＞95%）均從Sigma-Aldrich 獲得；氯金酸（HAuCl4）等其他分析純試劑購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。所有試劑使用時未進行純化。實驗用水為超純水。PBS緩沖液pH 值均為7.4，濃度為0.1 mol/L。除特別提及，所有實驗均在室溫下進行。

1.2 四元Cu-Zn-In-S半導(dǎo)體納米晶制備

通過一鍋法合成四元Cu-Zn-In-S 半導(dǎo)體納米晶［16］（NCs）。室溫下，將乙酸亞銅（2 mg，0.1 mmol）、醋酸鋅（18 mg，0.1 mmol）、醋酸銦（29 mg，0.1 mmol）、十二烷基硫醇（DDT，2 mmol）和油酸（0.6 mmol）以及4 mL 1-十八烯（ODE）放入三頸燒瓶中。向體系中不間斷通入惰性氣體（氬氣），同時將燒瓶加熱至210 ℃，直至形成透明溶液。然后，將溶解于0.5 mL 油胺中的硫溶液（0.3 mmol）快速注入上述混合物中，反應(yīng)10 min，再加熱至230 ℃反應(yīng)5 min。顆粒生長完成后，將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，加入10 mL己烷。用甲醇連續(xù)萃取去除副產(chǎn)物，直至甲醇相澄清。

通過對合成的NCs 表面配體的替換實現(xiàn)納米晶的相轉(zhuǎn)移［23］。將上述NCs 沉淀溶解于2 mL 氯仿中，加入2 mL 含3-巰基丙酸（MPA）的水溶液，劇烈攪拌2 h 后，對該溶液進行反復(fù)離心提純，去除多余的MPA。所得水溶性NCs儲存于4 ℃下冰箱中待用。

1.3 金納米星（AuNSs）與Ab2-AuNSs的制備

采用Liu 等［24］提出的方案一步合成金納米星（AuNSs）：配制100 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）溶液，并用1 mol/L NaOH 將pH 值調(diào)節(jié)至7.4 ± 0.1。然后，將4 mL 上述HEPES 與3 mL 水混合，在37 ℃下加入150μL 10 mmol/L 的HAuCl4溶液。在靜置狀態(tài)下反應(yīng)30 min，溶液顏色從淺黃變?yōu)榈?，最后變?yōu)樗{綠時，表明AuNSs已形成。

Ab2-AuNSs 的制備：取3 mL AuNSs 溶液，加入一定量的1% K2CO3溶液調(diào)節(jié)pH 值后，緩慢加入12μg/mL的Ab2抗體，攪拌反應(yīng)40 min后，加入100μL 10%BSA 封閉30 min后，將溶液置于離心機內(nèi)離心20 min（4 ℃，10000 r/min），棄去上清液，沉淀物用PBS重懸，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ECL-RET免疫傳感器的組裝

ECL-RET傳感器的構(gòu)建過程如圖1所示：將5.0 mg CHIT溶解于5 mL 0.05 mol/L的HCl溶液中，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，配制成1.0 mg/mL的CHIT溶液。稱取酸化后的MWNTs 1.0 mg加入到1 mL上述CHIT溶液中，超聲分散1 h，得到均勻分散的MWNTs-CHIT混合體系。將玻碳電極（GCE）表面處理干凈后，采用滴涂法取6μL MWNTs-CHIT溶液滴至GCE表面，室溫晾干，使其形成一層均勻致密的薄膜。隨后將含有10 mg/mL EDC 和20 mg/mL NHS 的8μL NCs 溶液滴涂于上述GCE/MWNTs-CHIT 表面，得到GCE/MWNTs-CHIT/NCs電極。室溫干燥后，將10μL Ab1（10μg/mL）滴加到電極表面，4 ℃下孵育2 h后，用PBS洗滌，并用BSA溶液封閉非特異性結(jié)合位點。反應(yīng)進行1 h后，將不同濃度的PSA底液滴加到上述修飾電極表面，37 ℃恒溫孵育1 h。進一步加入10μL的Ab2-AuNSs（10μg/mL）溶液，以形成三明治夾心結(jié)構(gòu)，得到GCE/MWNTs-CHIT/NCs/Ab1/PSA/Ab2-AuNSs。采用電化學(xué)交流阻抗法研究其組裝過程，電化學(xué)發(fā)光法檢測不同PSA濃度下傳感器發(fā)光信號的變化，從而實現(xiàn)PSA濃度的定量檢測。

圖1 ECL-RET傳感器檢測PSA 的示意圖Fig.1 ECL-RET immunoassay schematic for PSA detection

2 結(jié)果與討論

2.1 納米材料的形貌表征

通過一鍋法合成出的NCs不僅具有優(yōu)異的發(fā)光效率，而且可以通過改變Zn/In的比例得到不同發(fā)射波長的量子點。若將Zn/In 比設(shè)定為1/1，得到的NCs熒光發(fā)射波長為690 nm（圖2曲線a）。用透射電鏡（TEM）對NCs形貌進行表征（圖3A），可看出，NCs具有單分散特性，平均直徑為（4.6±0.5）nm。實驗所用AuNSs 通過一步合成法制備，即向HAuCl4溶液中加入特定的還原劑（HEPES）后一步生成金納米星。圖3B為AuNSs 的透射電鏡圖，從圖中可看出，晶體表面有多個尖端，屬于典型的星狀結(jié)構(gòu)，其直徑約為（35 ± 5）nm，尖端長度約15 nm。通過對其紫外可見吸收光譜圖進行分析（圖2 曲線b），發(fā)現(xiàn)AuNSs 具有兩個明顯的LSPR 峰，其中一個較強的縱向吸收峰在670 nm 處，另外一個較弱的橫向吸收峰在520 nm處。當(dāng)與Ab2結(jié)合后，AuNSs的縱向吸收峰發(fā)生明顯紅移，峰位出現(xiàn)在690 nm處（圖2曲線c）。同時，兩個吸收峰的峰寬也略有增加，這表明AuNSs 與Ab2 成功結(jié)合［25］。紅移后AuNSs 的縱向吸收光譜與NCs的熒光發(fā)射光譜重疊，確保了AuNSs與NCs之間發(fā)生ECL-RET的可能。

圖2 NCs（a）的熒光發(fā)射光譜，及AuNSs（b）、Ab2-AuNSs（c）的紫外可見吸收光譜Fig.2 Fluorescence spectrum of Cu-Zn-In-S NCs（a），UV-Vis absorption spectra of AuNSs（b）and Ab2-AuNSs（c）

圖3 NCs（A）及AuNSs（B）的TEM圖Fig.3 TEM images of NCs（A）and AuNSs（B）

2.2 ECL-RET免疫傳感器的組裝原理及過程表征

在電極的組裝過程中，首先將修飾了NCs的MWNTs-CHIT作為納米基底固載Ab1，隨后利用三明治夾心免疫反應(yīng)將修飾AuNSs 的二抗（Ab2-AuNSs）組裝到電極表面，AuNSs 與電極表面的NCs 發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，NCs 的ECL 信號被猝滅，通過測定NCs 的電化學(xué)發(fā)光信號情況，可定量檢測底液中的PSA 濃度。采用電化學(xué)交流阻抗法（EIS）對上述ECL-RET免疫傳感器的組裝過程進行跟蹤表征。如圖4所示，裸GCE 的阻抗譜近乎直線（曲線a），表明該電極Ret很小。當(dāng)將MWNTs-CHIT 和NCs 修飾在電極表面后，Ret稍有增加（曲線b），說明MWNTs-CHIT/NCs薄膜能夠阻礙電極表面的電子轉(zhuǎn)移。隨后，在GCE/MWNTs-CHIT/NCs上修飾Ab1和BSA，EIS半圓大幅度增加，Ret增大（曲線c），這是由于蛋白質(zhì)的絕緣效應(yīng)阻礙了電子傳遞。而當(dāng)PSA被Ab1捕獲和加入Ab2-AuNSs后，電阻進一步增大（曲線d、e），說明電極表面形成了穩(wěn)定的三明治結(jié)構(gòu)，傳感器成功構(gòu)建。

圖4 不同修飾電極的EIS譜Fig.4 EIS curves of modified GCE at different stagesa：bare GCE，b：GCE/MWNTs-CHIT/NCs，c：GCE/MWNTs-CHIT/NCs/Ab1，d：GCE/MWNTs-CHIT/NCs/Ab1/PSA，e：GCE/MWNTs-CHIT/NCs/Ab1/PSA/Ab2-AuNSs

2.3 ECL-RET免疫傳感器的可行性分析

為驗證該方案的可行性，考察了ECL-RET免疫傳感器在檢測PSA前后的ECL信號變化（圖5）。在共反應(yīng)劑K2S2O8存在下，當(dāng)電極表面未檢出PSA時，傳感器產(chǎn)生強烈的發(fā)光信號（曲線a），發(fā)光強度為3301 a.u.，信號非常穩(wěn)定，說明NCs 在電極表面形成的薄膜可作為發(fā)光體構(gòu)筑ECL-RET 免疫傳感器。當(dāng)PSA存在時，傳感器的ECL急劇下降（曲線b），發(fā)光強度僅為402 a.u.，猝滅效率高達88%。表明PSA 存在時，抗體之間形成穩(wěn)定的三明治夾心結(jié)構(gòu)，Ab2-AuNSs 被成功組裝到電極表面，NCs 與AuNSs 之間產(chǎn)生有效的RET 效應(yīng)，從而發(fā)生ECL 信號的猝滅。實驗結(jié)果表明，通過測定傳感器ECL 信號的變化實現(xiàn)溶液中PSA含量的檢測是切實可行的。

圖5 不同電極在5 mmol/L K2S2O8 溶液中的ECL圖Fig.5 ECL curves of different electrodes in 5 mmol/L K2S2O8a：GCE/MWNTs-CHIT/NCs/Ab1，b：GCE/MWNTs-CHIT/NCs/Ab1/PSA/Ab2-AuNSs，c：GCE/CHIT/NCs/Ab1

為證明MWNTs 在ECL-RET 免疫體系中的信號放大的作用，進行了對比實驗。采用CHIT 作為基底直接固載NCs，從圖中可以看到，GCE/CHIT/NCs/Ab1 的ECL 信號明顯低于GCE/MWNTs-CHIT/NCs/Ab1（曲線c），其發(fā)光強度僅為1815 a.u.，說明以MWNT作為固定化基底不僅可增大電極的比表面積，使Ab1 的負載量成倍增加，而且由于其優(yōu)異的導(dǎo)電性和生物相容性，能夠最大程度地保持抗體活性，增加電子轉(zhuǎn)移速率，具有很強的信號放大作用。

2.4 實驗條件的優(yōu)化

為選擇合適的pH值，實驗考察了pH值對ECL猝滅效率的影響，如圖6A所示，隨著pH值的增加，傳感器的ECL猝滅效率逐漸升高，而當(dāng)pH值大于7.4時，猝滅效率大幅度降低。實驗選擇pH 7.4為最佳酸度。

圖6 不同實驗條件對傳感器性能的影響Fig.6 Effect of different experimental conditions on ECL quenching efficiency of the proposed immunosensing systemA：pH value of PBS，B：volume of MWNTs-CHIT；C：concentration of K2S2O8

研究了MWNTs-CHIT 的滴涂量對傳感器性能的影響（圖6B）。結(jié)果顯示，當(dāng)MWNTs-CHIT 體積從2.0μL 增加到6.0μL 時，ECL 的猝滅效率逐漸增加，當(dāng)體積大于6.0μL 后，猝滅效率反而急劇下降。這是因為MWNTs 能夠有效增加電極的比表面積，提高電子轉(zhuǎn)移速率，但過量的MWNTs 會導(dǎo)致ECL背景信號的增加，電子轉(zhuǎn)移速率反而降低。因此實驗采用6.0μL作為MWNTs-CHIT的成膜體積。

進一步考察不同濃度K2S2O8對信號的影響（圖6C）。結(jié)果顯示，隨著K2S2O8濃度從1 mmol/L 增加到5 mmol/L，ECL的猝滅效率持續(xù)升高，當(dāng)濃度超過5 mmol/L，猝滅效率呈下降趨勢。本實驗選擇5 mmol/L作為K2S2O8的最佳濃度。

2.5 ECL-RET免疫傳感器的性能分析

在最佳實驗條件下，利用制備的ECL-RET 免疫傳感器對不同濃度的PSA 進行定量檢測，結(jié)果如圖7A所示。隨著PSA濃度的增大，ECL強度逐漸減弱，當(dāng)PSA的濃度在0.01～150 ng/mL之間時，ECL猝滅效率與logc呈良好的線性關(guān)系，擬合方程為ΔIECL= 0.4513 logc+ 0.1883（r2= 0.998），檢出限（S/N=3）為0.03 ng/mL。與文獻相比［26-29］，該傳感器表現(xiàn)出較寬的檢測范圍和較低的檢出限，表明該傳感器在PSA檢測中具有突出潛力。

通過對孵育50 ng/mL PSA 后的傳感器進行連續(xù)掃描300 s測定其穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，ECL信號無明顯變化（RSD=1.1%），表明該傳感器具有優(yōu)良的穩(wěn)定性。為了考察ECL-RET 免疫傳感器對PSA 的特異性，本實驗選擇牛血清白蛋白（BSA）、甲胎蛋白（AFP）和癌胚抗原（CEA）作為可能的干擾蛋白進行實驗（如圖7B）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述干擾蛋白對傳感器的檢測干擾幾乎可以忽略。在相同實驗條件下，傳感器檢測純樣品和混合干擾蛋白樣品的ECL猝滅效率基本一致，說明傳感器具有較高的選擇性。

圖7 不同濃度PSA的ECL響應(yīng)曲線（A）及ECL-RET傳感器的選擇性（B）Fig.7 ECL responses of ECL-RET immunosensor with different concentrations of PSA（A），and selectivity of ECL-RET immunosensor（B）inset：calibration plot of ECL quenching efficiency with logarithmic value of PSA concentration

2.6 實際樣品分析

為了評價ECL-RET 免疫傳感器在臨床PSA 檢測中的可行性，將傳感器用于成年男性血清樣本中PSA 濃度的檢測，結(jié)果如表1 所示。臨床血清樣本按照以下程序制備［30］：將5 mL 全血放入試管中以3000 r/min 離心10 min，然后將血清等量轉(zhuǎn)移至1.5 mL 試管中備用。分別用常用的化學(xué)發(fā)光法［31］和ECL-RET免疫傳感器法對樣品進行檢測。通過對比發(fā)現(xiàn)，ECL-RET免疫傳感器的測試結(jié)果與常用方法吻合，相對誤差范圍為-7.2%～6.0%，說明該方法對人血清樣本中的PSA 抗原具有良好的準確性，該方法具有較好的臨床應(yīng)用前景。

表1 利用ECL-RET與化學(xué)發(fā)光法檢測人血清樣本中PSA的數(shù)據(jù)比較Table 1 Comparison of ECL-RET immunosensor with chemiluminescence（CL）immunoassay for clinical PSA detection

3 結(jié)論

本文首次基于NCs（發(fā)光體）與AuNSs（受體）的ECL-RET，采用K2S2O8作為共反應(yīng)劑，制備了一種高靈敏檢測PSA 的猝滅型ECL 免疫傳感器。首先，利用一鍋法合成四元Cu-Zn-In-S 納米晶（NCs），并將其作為發(fā)光體固載于修飾了MWNTs的基底表面。該電極表現(xiàn)出極強的初始ECL信號和較低的ECL電位。隨后，利用三明治夾心免疫反應(yīng)將PSA 和修飾了AuNSs 的二抗（Ab2-AuNSs）組裝到電極表面，通過AuNSs 與NCs 之間的有效ECL-RET，使得電極的ECL 信號顯著下降，從而實現(xiàn)PSA 的檢測。該傳感器不僅靈敏度高、檢測范圍寬，還具有選擇性好、穩(wěn)定性高等特點。將該方法應(yīng)用于人血清樣本檢測，其準確率高、誤差小，為臨床PSA的檢測提供了一種新方法。