基于UPLC-QTOF MS的魚類鰓靶器官代謝組學(xué)分析方法研究

劉英杰，姚明珠，李?yuàn)櫸?，陳中祥，?鵬，孫言春*

（1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150010）

代謝組學(xué)是研究生物體系受到外部刺激或擾動(dòng)后內(nèi)源性代謝物的整體改變及變化規(guī)律的一門科學(xué)［1］。作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，隨著高通量高分辨率分析技術(shù)的不斷成熟，代謝組學(xué)發(fā)展迅速，現(xiàn)已在藥物毒理、臨床疾病及食品營(yíng)養(yǎng)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。由于代謝組學(xué)可以揭示生物系統(tǒng)在細(xì)胞層面的變化規(guī)律，從整體上闡明特定性狀發(fā)生發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)和調(diào)控機(jī)制，因此為包括水生動(dòng)物在內(nèi)的良種繁育以及抗逆應(yīng)激機(jī)制研究提供了一種新的有效手段。近年來，代謝組學(xué)技術(shù)在水產(chǎn)科學(xué)中的研究備受關(guān)注［2-5］。

目前，代謝組學(xué)常用的分析技術(shù)主要包括液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用［6-7］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GCMS）［8-9］、核磁共振（NMR）［10-11］等。其中，以超高效液相色譜-三重四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLCQTOF MS）為代表的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)因高靈敏度、高通量、高特異性、高分辨率和掃描速度等特點(diǎn)已成為代謝組學(xué)分析的重要手段。就分析步驟而言，常規(guī)的代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)流程主要包括樣本的收集和前處理、代謝組數(shù)據(jù)的采集、數(shù)據(jù)預(yù)處理、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析、標(biāo)志物識(shí)別和通路分析等。由于生物樣品中所含物質(zhì)種類豐富，而其中代謝物的豐度和極性呈現(xiàn)高度差異性，因此，規(guī)范的樣本前處理與數(shù)據(jù)采集方法在提高代謝物數(shù)據(jù)的覆蓋率、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性過程中起著決定性的作用［12］。

作為魚類參與呼吸、離子和滲透調(diào)節(jié)、酸堿平衡和氨氮排泄的主要功能器官，鰓與周圍水環(huán)境有著直接和持續(xù)的相互作用，在環(huán)境適應(yīng)、應(yīng)激下的生理調(diào)控中扮演著重要角色［13］。由于鰓組織中的代謝物具有種類繁多、化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣、極性差異較大等特點(diǎn)，因而對(duì)其代謝組學(xué)的全面分析提出了巨大挑戰(zhàn)。目前，雖有一些研究對(duì)血清［14］、血漿［15］、腎臟［16］、胚胎［17］等樣品的代謝組學(xué)分析方法進(jìn)行了探討，但仍然缺乏對(duì)于鰓這一水生動(dòng)物特定器官的代謝組學(xué)分析優(yōu)化方案。鰓代謝組學(xué)前處理以及數(shù)據(jù)采集的各方法中，尚未達(dá)到更好的覆蓋范圍和穩(wěn)定性。因此，亟需建立一種適用于鰓樣品的代謝組學(xué)分析方法，用于解析鰓靶器官在魚類生物功能中的科學(xué)內(nèi)涵。

本研究采用UPLC-QTOF MS 技術(shù)作為分析手段，利用蛋白質(zhì)沉淀法對(duì)鯽鰓組織樣品中的代謝物進(jìn)行提取，通過反相C18色譜柱對(duì)代謝物進(jìn)行色譜分離，并以葡萄糖、L-亮氨酸、檸檬酸、8-羥基二十碳四烯酸（8-HETE）、溶血磷脂酰膽堿（18∶0）（LysoPC（18∶0））、尿苷6 種不同極性的代表性內(nèi)源代謝物為研究對(duì)象，以代謝物的覆蓋率、穩(wěn)定性為指標(biāo)，結(jié)合質(zhì)量控制（QC）樣本評(píng)價(jià)方法，建立了適用于魚鰓靶器官中小分子代謝物全面分析的代謝組學(xué)分析方法。該方法對(duì)鰓組織樣品中廣極性代謝物的覆蓋面寬，具有提取率高、穩(wěn)定性強(qiáng)、專屬性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，適用于開展魚類代謝組學(xué)研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC 超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；SCIEX Triple TOF 5600 plus 高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX公司）；Allegra X-30R高速離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）；高通量組織研磨機(jī)（寧波新芝生物有限公司）；渦旋混勻器（德國(guó)IKA公司）；數(shù)控超聲儀（昆山超聲儀器有限公司）；XS205DY電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；YP-2002 電子天平（上海越平公司）；Milli-Q A10 超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）。

甲醇（MeOH）、乙腈（ACN）（質(zhì)譜純，德國(guó)Merck 公司）；甲酸（色譜純，德國(guó)Merck 公司）；0.22μm 有機(jī)相濾膜（上海安譜公司）；間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽（MS-222）（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；生理鹽水（四川科倫藥業(yè)公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集本實(shí)驗(yàn)所用銀鯽取自哈爾濱市方正縣方正銀鯽國(guó)家良種場(chǎng)。選擇大小均一、健康無外傷且遺傳背景一致的銀鯽50 尾，體長(zhǎng)約（13.0±0.5）cm，質(zhì)量約（120.10±5.64）g，將其轉(zhuǎn)移至室內(nèi)溫控循環(huán)養(yǎng)殖設(shè)備中。每天保持12 ～14 h 的光照，水溫23 ～24 ℃，按照三定三巡（定時(shí)定點(diǎn)定量投喂、早中晚巡查）的管理模式馴養(yǎng)15 d。采樣前24 h 停止喂食，將魚轉(zhuǎn)移至100 mg/L 的MS-222 溶液中深度麻醉后置于冰上解剖，快速采集鰓組織，用生理鹽水清洗表面血液后立即置于凍存管中液氮速凍，之后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 樣品預(yù)處理取出-80 ℃下保存的鰓組織樣品于4 ℃下解凍，準(zhǔn)確稱取50 mg于1.5 mL離心管中，加入800μL的4 ℃預(yù)冷甲醇-水（4∶1）和3個(gè)小鋼珠，-20 ℃下以60 Hz的速度低溫研磨3 min，于-20 ℃靜置30 min后，在4 ℃下以13000 r/min離心15 min，取500μL上層溶液，經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過濾至進(jìn)樣瓶中待測(cè)。在此過程中，將所有樣品等量混合制備QC樣品，用于方法學(xué)考察。

1.2.3 UPLC-QTOF MS檢測(cè)采用Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm），流動(dòng)相A 為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B 為0.1%甲酸乙腈溶液，流速為0.30 mL/min。洗脫梯度：0 ～2 min，5%～20%B；2～3 min，20%～60%B；3 ～11 min，60%～80%B；11 ～12 min，80%～100%B；12 ～13 min，100%B；13 ～13.1 min，100%～5%B；13.1 ～15 min，5%B。柱溫為35 ℃，自動(dòng)進(jìn)樣室溫度為4 ℃，進(jìn)樣量為10μL。

離子源采用電噴霧（ESI）源，在正、負(fù)離子模式下掃描數(shù)據(jù)。TOF MS Scan 模式m/z范圍為100 ～1200 Da；離子源溫度：550 ℃；離子化電壓：5500 V/-4500 V（正/負(fù)離子模式）；氣簾氣（CUR）：241.3 kPa；噴霧氣（GAS）：344.7 kPa；去簇電壓（DP）：80 eV；碰撞能量（CE）：10 eV。信息依賴采集（IDA）法進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集的m/z范圍為50 ～1200 Da，開啟動(dòng)態(tài)背景扣除（DBS），DP：80 eV；CE：（35±15）eV。每隔5個(gè)樣品采集1次QC樣品，以評(píng)估數(shù)據(jù)質(zhì)量。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理將正、負(fù)離子模式下采集的數(shù)據(jù)導(dǎo)入數(shù)據(jù)處理軟件Progenesis QI（美國(guó)Waters 公司），對(duì)色譜峰進(jìn)行譜峰識(shí)別、峰對(duì)齊、峰過濾等數(shù)據(jù)預(yù)處理程序。隨后，使用HMDB（http：//www.hmdb.ca/）與LIPID MAPS（https：//www.lipidmaps.org/）公共數(shù)據(jù)庫對(duì)代謝物進(jìn)行注釋。最后輸出由保留時(shí)間、精確質(zhì)荷比、樣本名稱、代謝物名稱和峰面積組成的數(shù)據(jù)矩陣，導(dǎo)入多變量統(tǒng)計(jì)軟件SIMCA 14.1進(jìn)行主成分分析（PCA）。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

代謝物的提取質(zhì)量是影響代謝組學(xué)分析的關(guān)鍵因素，因而樣品前處理步驟至關(guān)重要。在動(dòng)物的代謝組學(xué)分析中，代謝物種類繁多，且不同代謝物之間的化學(xué)性質(zhì)差異大。提取過程中必須兼顧不同代謝物的理化性質(zhì)，盡可能高質(zhì)量地獲得樣本中代謝物的全部信息。提取溶劑的種類、用量以及提取溫度等關(guān)鍵參數(shù)會(huì)對(duì)代謝物的提取結(jié)果產(chǎn)生影響，因此本研究對(duì)上述參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。

2.1.1 提取溶劑種類的選擇代謝組學(xué)分析中，不同種類的提取溶劑對(duì)代謝物的極性選擇范圍不同。因此，提取溶劑種類是影響內(nèi)源性代謝物的數(shù)量、種類和信號(hào)強(qiáng)度的主要因素之一［18］。以圖譜總峰面積、檢測(cè)到的代謝物數(shù)目、相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）以及代表性代謝物的信號(hào)強(qiáng)度為指標(biāo)，考察了MeOH、ACN、MeOH-ACN（1∶1，體積比，下同）、MeOH-H2O（4∶1）、MeOH-H2O（7∶3）5 種提取溶劑的提取效果。

首先，將正、負(fù)離子模式下獲得的UPLC-QTOF MS 原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Progenesis QI 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，得到不同提取溶劑下檢測(cè)的總峰面積。結(jié)果如圖1A所示，采用MeOH-H2O（4∶1）提取處理后，鰓組織樣品經(jīng)UPLC-QTOF MS檢測(cè)的圖譜總峰面積最大，且與除MeOH-H2O（7∶3）以外的3種提取溶劑之間存在顯著差異。隨后，使用公共數(shù)據(jù)庫對(duì)代謝物進(jìn)行注釋，并計(jì)算各代謝物在不同樣本間相對(duì)峰面積的RSD，以考察不同提取溶劑的平行性。結(jié)果如圖1B 所示，采用MeOH、ACN、MeOH-ACN（1∶1）、MeOH-H2O（4∶1）、MeOH-H2O（7∶3）為提取溶劑分別鑒定出528、564、513、598和581種代謝物。在代謝組學(xué)分析中，代謝物的相對(duì)峰面積RSD ＜30%時(shí)，表明其特征較穩(wěn)定［19］。相較而言，采用MeOH-H2O（4∶1）作為提取溶劑獲得的代謝物數(shù)目最多，覆蓋率最大，且相對(duì)峰面積RSD ＜30%的代謝物占比最大。選取葡萄糖、L-亮氨酸、檸檬酸等6種代表性內(nèi)源代謝物，進(jìn)一步考察了碳水化合物、氨基酸、甘油酯、有機(jī)酸等不同種類與極性的代謝物采用上述提取溶劑時(shí)的信號(hào)強(qiáng)度。結(jié)果如圖1C所示，除LysoPC（18∶0）外，其余代表性代謝物采用MeOH-H2O（4∶1）為提取溶劑可獲得更高的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度。綜上，本研究最終選擇MeOH-H2O（4∶1）作為提取溶劑。

圖1 提取溶劑種類對(duì)鰓代謝物提取結(jié)果的影響Fig.1 The influence of extraction solvent type on the extraction results of gill metabolitesA. total peak area of TIC；B. the number of metabolites and RSD distribution；C. relative signal abundance of representative metabolites with different polarities；different letters in Fig.1A indicate significant differences among the treatment groups（p ＜0.05）

2.1.2 提取溶劑用量的選擇提取溶劑的用量直接影響樣品中蛋白質(zhì)的去除效果和小分子代謝物的溶出效率，參考相關(guān)文獻(xiàn)［20-22］，本實(shí)驗(yàn)考察了樣品-試劑比（mg∶μL）分別為1∶13、1∶16、1∶20 和1∶25時(shí)對(duì)鰓組織中代謝物提取效果的影響。

結(jié)果表明，樣品-試劑比（mg∶μL）為1∶16 時(shí)獲得的圖譜總峰面積最大，且與1∶20 和1∶25 兩組之間存在顯著差異（圖2A）。樣品-試劑比為1∶13、1∶16、1∶20 和1∶25 時(shí)分別鑒定出564、580、497 和472 種代謝物，其中樣品-試劑比為1∶16 時(shí)獲得的代謝物數(shù)量最多，且相對(duì)峰面積RSD ＜30%的代謝物占比最大，穩(wěn)定性良好（圖2B）。進(jìn)一步考察了6 種代謝物在上述樣品-試劑比例下的信號(hào)強(qiáng)度，結(jié)果顯示，各代謝物在樣品-試劑比為1∶16 時(shí)的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度更高（圖2C）。綜上，本研究最終選擇樣品-試劑比（mg∶μL）為1∶16。

圖2 提取溶劑用量對(duì)鰓代謝物提取結(jié)果的影響Fig.2 The influence of extraction solvent amount on the extraction results of gill metabolitesA. total peak area of TIC；B. the number of metabolites and RSD distribution；C. relative signal abundance of representative metabolites with different polarities；different letters in Fig.2A indicate significant differences among the treatment groups（p ＜0.05）

2.1.3 提取溫度的選擇在代謝組學(xué)樣品前處理過程中，提取溫度顯著影響小分子代謝物的提取效果。提取溫度過高可能影響蛋白質(zhì)的沉淀效果，并導(dǎo)致代謝物降解。為進(jìn)一步提高代謝物的提取效果，本研究對(duì)提取溫度進(jìn)行了優(yōu)化。分別考察3 種不同方法對(duì)代謝物提取效果的影響：①鰓組織中加入常溫（25 ℃）提取溶劑進(jìn)行研磨；②鰓組織中加入4 ℃預(yù)冷后的提取溶劑進(jìn)行常溫研磨；③鰓組織中加入4 ℃預(yù)冷后的提取溶劑，在-20 ℃下進(jìn)行低溫研磨后，置于-20 ℃環(huán)境中靜置30 min。

結(jié)果顯示，采用方法③獲得的圖譜總峰面積最大，且與其它兩種方法存在顯著差異。就代謝物數(shù)目而言，上述3種提取條件下分別獲得459、530、583種代謝物。采用方法③獲得的代謝物數(shù)量最多，且相對(duì)峰面積RSD ＜30%的代謝物占比最大，體現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性。同時(shí)對(duì)6種代表性代謝物在不同提取溫度下的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果顯示，采用方法③時(shí)，6種代謝物均可獲得最強(qiáng)的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度。

綜上所述，最佳前處理方法為：樣品-試劑比（mg∶μL）為1∶16，以4 ℃預(yù)冷的MeOH-H2O（4∶1）作為提取溶劑，在-20 ℃下進(jìn)行低溫研磨后，置于-20 ℃環(huán)境中靜置30 min。

2.2 色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜條件的優(yōu)化采用Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm ×2.1 mm，1.7μm），分別考察了流動(dòng)相種類、柱溫、流速、進(jìn)樣量等條件對(duì)色譜分離效果的影響。

為避免基質(zhì)干擾，優(yōu)化目標(biāo)峰的保留時(shí)間，比較了甲醇-水、乙腈-水、0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水、0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水4種流動(dòng)相對(duì)代謝物分離效果的影響。結(jié)果表明，流動(dòng)相B為乙腈時(shí)代謝物的響應(yīng)強(qiáng)度優(yōu)于甲醇。而甲酸的加入有利于分析物形成［M+H］+，提高正離子檢測(cè)模式下的離子化效率，同時(shí)可顯著改善負(fù)離子檢測(cè)模式下的色譜峰形，減少色譜峰拖尾。雖然酸性流動(dòng)相對(duì)負(fù)離子檢測(cè)模式下的信號(hào)強(qiáng)度略有抑制，但其減小程度不顯著。因此本實(shí)驗(yàn)選擇0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相。

對(duì)柱溫及流速的考察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柱溫為35 ℃，流速為0.30 mL/min 時(shí)可獲得較好的分離效果。對(duì)樣品進(jìn)樣量的考察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，增加進(jìn)樣量可提高代謝物的響應(yīng)強(qiáng)度，但流動(dòng)相系統(tǒng)的壓力會(huì)有明顯波動(dòng)，導(dǎo)致干擾色譜峰無序出現(xiàn)，甚至影響目標(biāo)色譜峰。最終，本實(shí)驗(yàn)選擇最佳進(jìn)樣量為10μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化UPLC-QTOF MS系統(tǒng)使用電噴霧離子源（ESI），為提高質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度及靈敏度，本實(shí)驗(yàn)選擇前述6種代表性內(nèi)源代謝物對(duì)離子源溫度、離子源噴霧電壓、氣簾氣、噴霧氣、去簇電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，最終得到優(yōu)化的質(zhì)譜采集條件如“1.2.3”所示。

經(jīng)色譜、質(zhì)譜條件優(yōu)化后，正、負(fù)離子模式下鰓組織樣品中6種代謝物的總離子流色譜圖（TIC）如圖3所示。結(jié)果表明，各色譜峰的分離效果良好，響應(yīng)值得到了顯著提升。

圖3 UPLC-QTOF MS分析獲得的鰓組織代謝物總離子流色譜圖Fig.3 Total ion chromatograms（TIC）of gill metabolites obtained by UPLC-QTOF MSA. positive ion mode；B. negative ion mode

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 儀器精密度按照優(yōu)化后的樣品前處理與儀器分析方法，對(duì)同一QC 樣品連續(xù)進(jìn)樣6 次，進(jìn)行UPLC-QTOF MS分析。表1結(jié)果顯示，6種代表性代謝物相對(duì)峰面積的RSD為2.2%～4.2%，保留時(shí)間的RSD為1.2%～2.4%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 方法精密度按照優(yōu)化后的樣品前處理與儀器分析方法，取6 份QC 平行樣品，進(jìn)行UPLCQTOF MS分析，并將獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析。表1結(jié)果表明，6種代表性代謝物相對(duì)峰面積的RSD為3.4%～6.8%，保留時(shí)間的RSD為1.4%～4.6%。6個(gè)QC平行樣本在正、負(fù)離子模式下的一維PCA圖如圖4A、4B所示，各樣本的偏差均在2倍標(biāo)準(zhǔn)偏差（Std）范圍內(nèi)。取10份普通樣品同時(shí)進(jìn)行UPLC-QTOF MS分析，在正、負(fù)離子模式下獲得的二維PCA 圖如圖4C、4D 所示，正、負(fù)離子模式下各QC 樣本在小范圍內(nèi)表現(xiàn)出高度的聚集性。結(jié)果表明該方法的精密度和重復(fù)性良好。

表1 儀器精密度、方法精密度和樣品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 1 Results of instrument precision，method precision and sample stability tests（n=6）

圖4 QC樣本的一維PCA圖（A、B）與二維PCA圖（C、D）Fig.4 One-dimensional PCA plots（A，B）and two-dimensional PCA plots（C，D）of QC samplesA，C：in positive ion mode；B，D：in negative ion mode

2.3.3 樣品穩(wěn)定性取同一QC 樣品，分別在0、6、12、24、48、72 h，按照優(yōu)化后的樣品前處理與儀器分析方法進(jìn)行UPLC-QTOF MS 分析。表1 結(jié)果表明，6 種代表性代謝物相對(duì)峰面積的RSD 為3.8%～10%，保留時(shí)間的RSD為3.4%～8.1%，表明該方法處理的樣品在72 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.4 方法的初步應(yīng)用

應(yīng)用該方法系統(tǒng)性地開展了鯽鰓靶器官代謝組學(xué)研究［23］。結(jié)果顯示，依據(jù)本方法可定性的代謝物數(shù)量平均達(dá)8000余種。對(duì)其中的高質(zhì)量物質(zhì)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，二級(jí)定性物質(zhì)數(shù)量均超過600余種。捕獲代謝物包括氨基酸類、碳水化合物類、有機(jī)酸及其衍生物類、核苷酸及其類似物、甘油酯類等二十余種。與同類研究相比，所獲得的代謝物數(shù)目更多，覆蓋范圍廣泛且無偏向性。在后續(xù)的差異代謝物篩選分析過程中，共篩選出顯著差異代謝物200余種，而前期采用未經(jīng)優(yōu)化的方法僅篩選出100余種。本方法發(fā)現(xiàn)的差異代謝物數(shù)量提高了1 倍以上，從而顯著提高了發(fā)現(xiàn)代謝性生物標(biāo)記物的概率，為開展魚類鰓靶器官代謝組學(xué)研究提供了可靠的方法學(xué)依據(jù)。

3 結(jié)論

本研究針對(duì)魚類鰓靶器官代謝組學(xué)分析過程中存在的科學(xué)問題，對(duì)影響樣品前處理以及儀器分析過程中的關(guān)鍵因素開展了系統(tǒng)研究，建立了一種基于UPLC-QTOF MS 檢測(cè)技術(shù)的魚類鰓組織代謝組學(xué)分析方法。結(jié)果表明，該方法具有精密度高、穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，符合高通量代謝組學(xué)研究的基本要求。研究結(jié)果為各種魚類鰓靶器官的高通量代謝組學(xué)研究提供了技術(shù)支持，可為解析鰓器官在細(xì)胞層面發(fā)生的代謝調(diào)控規(guī)律提供方法學(xué)基礎(chǔ)，具有重要的現(xiàn)實(shí)科學(xué)意義。