一種新型一氧化氮比率型近紅外熒光探針的制備及應(yīng)用

張夢(mèng)田，吳 麗，杜江燕*

（1.南京師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.南通大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南通 226000）

一氧化氮（NO）是生物體內(nèi)普遍存在的一種內(nèi)源性氣體分子，由線粒體一氧化氮合成酶在氧氣和還原性輔酶Ⅱ（NADPH）參與下催化內(nèi)源性L-精氨酸分解生成［1］。NO在人體內(nèi)作為代謝產(chǎn)物形成的控制生理過(guò)程的信號(hào)分子，廣泛參與多種生理和病理過(guò)程，在血小板聚集和細(xì)胞粘附、心力衰竭、血管舒張、炎癥等生命過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［2-3］。此外，NO 還與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、平滑肌松弛、分解代謝自噬過(guò)程和免疫反應(yīng)［4-8］密切相關(guān)。NO 的生物學(xué)效應(yīng)與其在細(xì)胞微環(huán)境中的濃度密切相關(guān)，對(duì)生物體而言，細(xì)胞內(nèi)NO 是一把“雙刃劍”，較低濃度的NO 參與免疫及炎癥過(guò)程的信息傳遞，促進(jìn)血管生成和腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，而較高濃度的NO則會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，具有抗腫瘤作用［9］；在免疫系統(tǒng)中，較低濃度的NO 能抑制T 細(xì)胞增殖，起抗炎作用，較高濃度的NO 則會(huì)在病原體存在時(shí)引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)［10］。大量研究表明，NO濃度失調(diào)與一些致命疾病密切相關(guān)，如青光眼、免疫紊亂、急慢性炎癥、內(nèi)皮功能障礙、神經(jīng)退行性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、感染性休克和癌癥等［11-13］。因此，體內(nèi)動(dòng)態(tài)檢測(cè)NO對(duì)于研究其在生命活動(dòng)中的生理機(jī)制，以及多種疾病及腫瘤的臨床診斷具有非常重要的意義［14］。

與化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)法、電子順磁共振光譜法或紫外可見吸收光譜法等分析方法相比，熒光探針技術(shù)具有靈敏度高、響應(yīng)快速和抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是動(dòng)態(tài)檢測(cè)活細(xì)胞及活體中NO 的重要手段［15-17］。例如，Kumar課題組［18］設(shè)計(jì)并合成了一種溶酶體靶向探針LyNP-NO，可選擇性檢測(cè)活細(xì)胞中的NO，用于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)大鼠腦組織中的內(nèi)源性NO 水平。Xu 等［3］設(shè)計(jì)了一種智能NO 探針PYSNO，該探針對(duì)外源性和內(nèi)源性NO 均表現(xiàn)出快速反應(yīng)，還可用于跟蹤和研究動(dòng)物組織中NO 的產(chǎn)生。但現(xiàn)有的檢測(cè)NO 的熒光探針仍存在靈敏度不高、選擇性差及信號(hào)易受干擾等問(wèn)題。因此，亟需開發(fā)靈敏度高、專一性好的熒光探針提高NO檢測(cè)的準(zhǔn)確度和可靠度。

2，1，3-苯并噻二唑（Benzothiadiazole，BTD）是一種缺電子雜環(huán)結(jié)構(gòu)熒光受體，具有優(yōu)良的化學(xué)和光學(xué)性能，如斯托克斯位移大、吸電子能力強(qiáng)、光穩(wěn)定性好等特性。本文將BTD 稠合鄰苯二胺獲得的［c］［1，2，5］噻二唑-5，6-二胺（［c］［1，2，5］Benzothiadiazole-5，6-diamine，BTN）衍生物，作為NO 的特異性識(shí)別基團(tuán)和電子受體，通過(guò)與NO 間的特異性反應(yīng)識(shí)別NO。芴衍生物是一種重要的熒光分子，通過(guò)C9 位官能團(tuán)的修飾可調(diào)控?zé)晒庑阅?。將芴衍生物作為給電子基團(tuán)，噻吩作為π 橋與BTN 共價(jià)結(jié)合，構(gòu)建了供體-受體-供體（D-A-D）型熒光探針4，7-雙（5-（9，9-二辛基-9H-芴-2-基）噻吩-2-基）苯并［c］［1，2，5］噻二唑-5，6-二胺（4，7-Bis（5-（9，9-dioctyl-9H-fluoren-2-yl）thiophen-2-yl）benzo［c］［1，2，5］thiadiazole-5，6-diamine，BTBTN）。此探針結(jié)構(gòu)中鄰苯二胺與NO 反應(yīng)后形成苯并三氮唑結(jié)構(gòu)，分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）效應(yīng)增強(qiáng)，吸收光譜明顯紅移，熒光探針在紅光波段處熒光減弱，而在近紅外波段處熒光增強(qiáng)，可實(shí)現(xiàn)NO 的比率計(jì)量檢測(cè)。相較于傳統(tǒng)的增強(qiáng)型或猝滅型NO 熒光探針，該探針通過(guò)比率計(jì)量熒光可實(shí)現(xiàn)背景熒光低、抗干擾能力強(qiáng)的NO近紅外熒光分析和檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

賴氨酸、甘氨酸和抗壞血酸購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DL-同型半胱氨酸、L-半胱氨酸、9，9-二辛基-2-溴芴、N-乙酰-L-半胱氨酸和丙酮醛購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；4，7-二溴-2，1，3-苯并噻二唑、谷胱甘肽和一氧化氮供體鹽（2-（N，N-二乙基氨基）-二氮烯-2-氧鈉鹽水合物）購(gòu)于Sigma-Aldrich西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；其他試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。溶液用二次水配制。

核磁共振碳譜（13C-NMR）、核磁共振氫譜（1H-NMR）測(cè)試實(shí)驗(yàn)采用Bruker Avance III HD 400 MHz超導(dǎo)核磁共振儀。高分辨率質(zhì)譜儀（HRMS）采用美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司生產(chǎn)的Orbitrap Fusion Lumos。紫外吸收光譜實(shí)驗(yàn)采用日本島津公司生產(chǎn)的UV-1900型紫外可見光譜儀。熒光光譜實(shí)驗(yàn)采用英國(guó)愛丁堡公司生產(chǎn)的FS-5型熒光光譜儀。

1.2 熒光探針（BTBTN）的合成與表征

1.2.1 化合物BTBTN的合成路線將4，7-二溴-2，1，3-苯并噻二唑（C6H2N2SBr2）與濃硝酸、三氟甲烷磺酸（CF3SO3H）等原料在一定條件下反應(yīng)生成化合物1（C6O4N4SBr2）；將2-（三丁基錫）噻吩（C16H30SnS）、化合物1、四（三苯基膦）鈀［Pd（PPh3）4］在一定條件下反應(yīng)生成化合物2（C14H6O4N4S3）；將化合物2 溶解于N，N-二甲基甲酰胺（C3H7ON）和乙腈混合溶劑中，分次加入N-溴代琥珀酰亞胺（C4H4NO2Br）和微量溴化氫反應(yīng)完成后，得到橘紅色化合物3（C14H4O4N4S3Br2）；將9，9-二辛基-2-溴芴（C19H41Br）、聯(lián)硼酸頻那醇酯（C12H24O4B2）、無(wú)水醋酸鉀及［1，1’-雙（二苯基膦）二茂鐵］二氯化鈀二氯甲烷絡(luò)合物［PdCl2（dppf）2CH2Cl2］等試劑反應(yīng)得到化合物4（C35H53O2B）；利用Suzuki 偶聯(lián)反應(yīng)將化合物4 偶聯(lián)到化合物3，再投入含有甲醇、K2CO3溶液、Pd（PPh3）4的四氫呋喃溶液中反應(yīng)得到化合物5（C72H86O4N4S3）；將化合物5、鐵粉、乙酸加入密封反應(yīng)容器中反應(yīng)得到化合物BTBTN（C72H90N4S3），制備路線如圖1所示。

圖1 探針BTBTN的合成路線及與NO反應(yīng)可能的機(jī)理Fig.1 Synthesis procedures of probe BTBTN and possible reaction mechanism with NO

1.2.2 探針BTBTN 的核磁共振光譜結(jié)果1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 7.76-7.66（m，6H），7.64（s，2H），7.52（d，J=3.7 Hz，2H），7.40（d，J=3.7 Hz，2H），7.37-7.29（m，6H），2.06-1.96（m，8H），1.35-0.93（m，44H），0.81（t，J = 7.1 Hz，12H），0.65（d，J = 7.8 Hz，8H）。13C NMR（101 MHz，CDCl3）δ 151.70（s），150.99（d，J = 14.3 Hz），147.08（s），141.16（s），140.73（s），139.39（s），134.32（s），132.99（s），129.85（s），127.33（s），126.97（s），124.94（s），123.28（s），123.01（s），120.32（d，J = 18.5 Hz），119.88（s），107.51（s），55.35（s），40.59（s），31.93（s），30.19（s），29.38（s），23.93（s），22.74（s），14.23（s），0.14（s）。

1H-NMR和13C-NMR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所得產(chǎn)物為目標(biāo)化合物BTBTN。

1.3 溶液的配制

BTBTN 儲(chǔ)備液的配制：準(zhǔn)確稱量一定質(zhì)量的BTBTN 樣品，溶解于四氫呋喃（THF）中，配制質(zhì)量濃度為5 mg/mL的BTBTN貯備液，于4 ℃下避光保存。

HEPES 緩沖液（0.01mol/L，pH 7.4）的配制：準(zhǔn)確稱取1.1915 g C8H18N2O4S（4-羥乙基哌嗪乙磺酸）固體，向其中加0.5 L 水，超聲、攪拌至完全溶解，得到0.01 mol/L HEPES 酸液。準(zhǔn)確稱取0.4 g NaOH溶于10 mL水中，配制1 mol/L NaOH 溶液作為堿液。將上述酸液和堿液按照一定比例混合，配制不同pH值的緩沖液。

樣品溶液的配制：在比色皿中加入0.665μL HEPES 緩沖液和1.335μL THF，再取2.3μL 探針母液，用1 mL移液槍吹打均勻，制備探針濃度為5μmol/L的樣品溶液，總體積為2 mL左右。

NO 溶液的配制：準(zhǔn)確稱取一定量的NO 供體鹽，在一定量的水中加入適量NO，配制質(zhì)量濃度為5 mg/mL的NO溶液，立即冷凍在-20 ℃冰箱中，現(xiàn)取現(xiàn)用。

1.4 紫外吸收光譜實(shí)驗(yàn)

將上述探針溶液（5μmol/L）及HEPES緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.4）分別加入到兩個(gè)樣品池中，進(jìn)行紫外吸收光譜測(cè)試。為了消除溶劑誤差，待初始工作基線穩(wěn)定后再開始樣品的測(cè)試。測(cè)試BTBTN 與NO響應(yīng)實(shí)驗(yàn)時(shí)，在測(cè)試液中加入適量濃度的NO儲(chǔ)備液（最終濃度50μmol/L）。充分反應(yīng)后，記錄熒光探針紫外吸收峰強(qiáng)度的變化。

1.5 熒光光譜實(shí)驗(yàn)

以410 nm 作為樣品的激發(fā)光波長(zhǎng)，狹縫寬度2 nm，向石英比色皿中加入HEPES 緩沖液和樣品溶液，使得配制的熒光探針BTBTN 的最終濃度為5μmol/L。測(cè)試BTBTN 與NO 響應(yīng)實(shí)驗(yàn)時(shí)，在測(cè)試液中分別加入適量濃度的NO 儲(chǔ)備液（最終濃度為50μmol/L）。充分反應(yīng)至信號(hào)不再變化時(shí)，記錄熒光探針的最大發(fā)射峰強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光探針與NO作用的光譜研究

為了考察探針BTBTN 對(duì)NO 的響應(yīng)情況，測(cè)定了BTBTN 與NO 反應(yīng)前后的紫外吸收光譜和熒光光譜。結(jié)果如圖2A 所示，BTBTN 的紫外光譜（曲線a）在355 nm 處有1 較強(qiáng)吸收峰，在410 nm 處有1 弱吸收峰。加入NO 后（曲線b）顯示355 nm 處的吸收峰消失，而410 nm 處的吸收峰明顯增強(qiáng)，同時(shí)在660 nm 處產(chǎn)生1 新吸收峰，表明BTBTN 與NO 發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)，有新物質(zhì)生成，且溶液由紅色變?yōu)樗{(lán)色（如圖2A插圖）。

圖2B 為探針BTBTN 與NO 作用前后的熒光光譜，如曲線a 所示，BTBTN 在410 nm 激發(fā)光輻射下，只在640 nm 處有發(fā)射峰，且熒光強(qiáng)度較弱。加入NO 后，640 nm 處的發(fā)射峰明顯降低，且在775 nm 處出現(xiàn)1 明顯的發(fā)射峰，這可能是由于BTBTN 分子中鄰苯二胺的兩個(gè)氨基基團(tuán)與NO 發(fā)生反應(yīng)生成了新物質(zhì)，ICT 效應(yīng)增強(qiáng)使探針在775 nm 處發(fā)出近紅外熒光。圖2B 插圖表明，探針BTBTN 與NO 作用后產(chǎn)生明顯的顏色變化，進(jìn)一步證明BTBTN 與NO 反應(yīng)產(chǎn)生了新的熒光物質(zhì)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明探針BTBTN可用于NO的檢測(cè)。

圖2 探針BTBTN與NO作用前后的紫外吸收光譜（A）及熒光光譜（B）Fig.2 UV-Vis absorption spectra（A）and fluorescence spectra（B）of probe BTBTN in the absence and presence of NO HEPES buffer-THF/H2O（2∶1），pH 7.4；concentration of BTBTN：5μmol/L；λex=410 nm

2.2 熒光探針對(duì)NO的檢測(cè)機(jī)理研究

熒光探針BTBTN 是以鄰苯二胺修飾的［c］［1，2，5］噻二唑-5，6-二胺作為NO 識(shí)別基團(tuán)和電子受體，基于BTBTN 與NO 反應(yīng)前后的光譜變化，推測(cè)BTBTN 上的鄰苯二胺基團(tuán)與NO 發(fā)生環(huán)化反應(yīng)，生成苯并三氮唑結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物。為了證實(shí)這一推斷，考察了BTBTN 與NO 反應(yīng)前后的高分辨質(zhì)譜，結(jié)果如圖3所示。在正離子模式下，BTBTN 在m/z=1107.6 處有1 強(qiáng)的分子離子峰。當(dāng)探針BTBTN 與NO 反應(yīng)后，在負(fù)離子模式下，m/z=1116.6處出現(xiàn)1新的強(qiáng)分子離子峰（圖3B），該數(shù)值與化合物BTBTNO的理論相對(duì)分子質(zhì)量（m/z=1117.6）相對(duì)應(yīng)，符合BTBTNO 的三氮唑在質(zhì)譜中失去了單質(zhì)子H，表明探針確實(shí)被NO還原成化合物BTBTNO，從而驗(yàn)證了圖1提出的探針BTBTN與NO反應(yīng)的機(jī)理推測(cè)。當(dāng)探針與NO結(jié)合，二氨基苯并-（1，2，5-噻二唑）部分的弱電子受體將轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)吸電子能力的三唑并稠合苯并-（1，2，5-噻二唑），然后生成產(chǎn)物BTBTNO，并由增強(qiáng)的ICT效應(yīng)開啟近紅外熒光。

圖3 BTBTN（A）及BTBTN與NO反應(yīng)后（B）的質(zhì)譜圖Fig.3 MS spectra of BTBTN（A）and its reactant after BTBTNO treating with NO（B）BTBTN：Calc. for C72H90N4S3：1106.6328. Found：1107.57［MA+H］+；BTBTNO：Calc. for C72H87N5S3：1117.6124. Found：1116.6［MB-H］-）

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

為獲得最佳的檢測(cè)靈敏度，分別對(duì)溶劑THF配比、反應(yīng)時(shí)間和溶液pH值進(jìn)行優(yōu)化。如圖4A所示，隨著溶劑中THF 含量的增大，BTBTN 的熒光強(qiáng)度呈先升高后降低現(xiàn)象，當(dāng)溶劑THF 和水的體積比為2∶1時(shí)，BTBTN對(duì)NO的響應(yīng)能力最強(qiáng)。

為了探究反應(yīng)時(shí)間對(duì)探針熒光強(qiáng)度的影響，考察了探針BTBTN分別與不同濃度（8、16、70μmol/L）NO混合后，其熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化情況。結(jié)果顯示，BTBTN與NO在3 min內(nèi)反應(yīng)即達(dá)到平衡，表明BTBTN可快速與NO結(jié)合并產(chǎn)生熒光響應(yīng)，因此，選擇3 min作為探針與NO的反應(yīng)時(shí)間。

pH 值對(duì)熒光強(qiáng)度的影響如圖4B所示，在pH 6.0～8.0范圍內(nèi)，探針BTBTN 對(duì)NO 具有較穩(wěn)定的熒光響應(yīng)，表明BTBTN 適用于生理pH 范圍內(nèi)NO 的檢測(cè)。因此，選擇pH 7.4 為HEPES 緩沖液（HEPES buffer-THF/H2O（2∶1））的最佳pH值。

圖4 溶劑配比（A）及pH值（B）對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effects of volume ratios of THF to water（A）and pH value（B）on fluorescence systems of BTBTN HEPES buffer：0.01 mol/L，BTBTN：5μmol/L

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍與檢出限

為了探究熒光探針對(duì)NO 的檢測(cè)靈敏度，測(cè)試了BTBTN 與不同濃度（0～50μmol/L）NO 在HEPESTHF 緩沖液（pH 7.4）中的熒光光譜。從圖5 可知，探針的熒光強(qiáng)度隨著NO 濃度的增加而增加，且BTBTN 在775 nm/640 nm 的熒光強(qiáng)度比值F775nm/F640nm與NO 的濃度在0～10μmol/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=0.2792+0.3282×［NO］（r2=0.9939），式中［NO］為NO 的濃度（μmol/L），Y為F775nm/F640nm的比值。根據(jù)檢出限的計(jì)算公式（LOD=3σ/k，σ為空白樣品連續(xù)測(cè)定3次的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率），測(cè)得方法對(duì)NO的檢出限為28.88 nmol/L。

圖5 探針BTBTN 與不同濃度NO 作用后的熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of BTBTN upon addition of different concentrations of NOBTBTN：5μmol/L，HEPES buffer-THF/H2O（2∶1），pH 7.4；inset：relationship between NO concentration and fluorescence intensity（F775 nm/F640 nm）

與文獻(xiàn)報(bào)道的其他NO 探針的檢測(cè)結(jié)果相比（表1），探針BTBTN 對(duì)NO 具有較低的檢出限?；诒痉椒▽?duì)NO響應(yīng)速度快、檢測(cè)靈敏度高的特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)體外NO含量的快速、靈敏的熒光定量檢測(cè)。

表1 本方法與文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)NO熒光探針的檢出限比較Table 1 Comparison of detection limits of the method with the other fluorescent probes for NO

2.5 選擇性實(shí)驗(yàn)

為了考察探針BTBTN 對(duì)NO 檢測(cè)的選擇性和抗干擾能力，以常見的不同種類分析物作為干擾物，測(cè)試了BTBTN 的熒光光譜。檢測(cè)對(duì)象包括：6 種氨基酸（Hcy、GSH、L-Cys、L-Lys、Gly、NAC，濃度均為5.0 mmol/L）、2 種生物小分子（丙酮醛、抗壞血酸，濃度均為50μmol/L）、6 種金屬離子（Na+、Ca+、Mg2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+，濃度均為1.0 mmol/L）、5 種陰離子、Br-、I-，濃度均為1.0 mmol/L）、5種活性氧及活性氮物種（·OH、1O2、ClO-、H2O2、ONOO-，濃度為100μmol/L）。當(dāng)向5μmol/L BTBTN溶液中加入30μmol/L NO后，其熒光強(qiáng)度比值（F775nm/F640nm）迅速增大。將上述干擾物加入到熒光探針溶液中充分反應(yīng)后，未觀察到F775nm/F640nm的明顯變化，表明上述測(cè)試物中，只有NO 能觸發(fā)BTBTN 探針的近紅外熒光，表明BTBTN 對(duì)NO 檢測(cè)具有較好的選擇性和抗干擾能力，可滿足生物樣品中NO的檢測(cè)要求。

3 結(jié)論

本文以鄰苯二胺修飾的苯并噻二唑衍生物作為NO 識(shí)別基團(tuán)和電子受體，以芴的衍生物作為供電子熒光基團(tuán)，設(shè)計(jì)并合成了一種新型近紅外比率型熒光分子探針BTBTN。該探針與NO 反應(yīng)后生成苯并三氮唑結(jié)構(gòu)，分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）效應(yīng)增強(qiáng)，熒光發(fā)射光譜明顯紅移，探針在紅光區(qū)的熒光發(fā)射減弱，而在近紅外區(qū)的熒光明顯增強(qiáng)，通過(guò)兩者間的熒光變化可實(shí)現(xiàn)NO 的比率計(jì)量檢測(cè)。探針BTBTN對(duì)NO 的熒光檢測(cè)具有響應(yīng)快速（3 min）、檢出限低（28.88 nmol/L）及在生理pH 范圍內(nèi)穩(wěn)定性好和選擇性高的特征，有望用于復(fù)雜細(xì)胞和活體環(huán)境中NO的定量檢測(cè)。