超快速液相色譜-三重四極桿-線性離子阱質(zhì)譜法同時測定桑寄生中多元活性成分

吳 楠，袁嘉歡，王文辛，劉訓(xùn)紅，2*，黎 理，殷圣鑫，陳海杰，薛 佳，周永逸，楊 薇

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.江蘇省經(jīng)典名方工程研究中心，江蘇 南京 210023；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，廣西 南寧 530200）

桑寄生Taxillus sutchuenensis（Lecomte）Danser為桑寄生科半寄生性灌木，以干燥帶葉莖枝入藥，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》［1］。其具有祛風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎元的功效，用于風(fēng)濕痹痛，腰膝酸軟，筋骨無力，崩漏經(jīng)多，妊娠漏血，胎動不安，頭暈?zāi)垦＃?］。桑寄生主要分布在廣西、福建、廣東等地，當(dāng)?shù)厝顺２烧淝o枝和葉熬湯或制成茶飲［3］，用以養(yǎng)生保健?，F(xiàn)代藥理研究表明，桑寄生具有神經(jīng)保護(hù)作用，以及鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、降血壓、血糖、血脂等作用［4-7］。其主要活性成分為黃酮類、有機(jī)酸類、揮發(fā)性成分、磷脂、維生素、微量元素及凝集素等［8-11］。

在前期樣品采集中發(fā)現(xiàn)，所收集的桑寄生商品藥材中葉的比例極低，可能由于傳統(tǒng)采收期為秋冬季落葉量較多或是采收、干燥、運(yùn)輸過程中葉片碎裂導(dǎo)致，這在一定程度上對桑寄生的有效性和安全性造成影響。此前，朱開昕等［12］研究發(fā)現(xiàn)桑寄生老葉中的槲皮素含量高于嫩芽及對照品藥材；蘇本偉等［13］發(fā)現(xiàn)槲皮苷、槲皮素及扁蓄苷主要存在于桑寄生葉中，莖枝中含量較少。2020版《中國藥典》中并未明確桑寄生的指標(biāo)成分，而目前對桑寄生的研究集中在單一黃酮類成分或總黃酮［12-14］，由于中藥作用的整體性、成分的多樣性以及成分間相互作用的難以預(yù)測性，使得對單一活性成分的檢測缺乏代表性［15-16］。為了更加全面地反映桑寄生藥材的質(zhì)量，本文選擇桑寄生中4類成分包括12種黃酮類、4種有機(jī)酸類、12種氨基酸類和5種核苷類共33種活性成分進(jìn)行研究。采用超快速液相色譜-三重四極桿-線性離子阱質(zhì)譜（UFLC-QTRAP-MS/MS）進(jìn)行測定，有效克服了以往桑寄生化學(xué)成分研究中普遍使用的高效液相色譜法（HPLC）中復(fù)雜體系分離困難的問題，可同時定量分析多個化合物，分析時間大幅縮短且靈敏度顯著提高［17-20］。結(jié)合獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)及相關(guān)性分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對比桑寄生莖枝、葉的成分含量差異，以期為桑寄生資源的合理利用提供參考，為建立相應(yīng)的質(zhì)量安全標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

AB SCIEX QTRAP 5500質(zhì)譜儀配有電噴霧離子源和Analyst 1.6.3軟件（美國ABSciex公司）；SIL-20A XR 超快速液相色譜儀，包括LC-20AD XR溶劑輸送泵、DGU-20A3脫氣機(jī)、SIL-20A XR自動進(jìn)樣器、CTO-20AC柱溫箱（日本Shimadzu公司）；DHG-91140A恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；KQ-500B型超聲波清洗器（500 W，40 kHz，江蘇昆山超聲儀器有限公司）；BSA224S型電子分析天平、ME36S型電子分析天平（德國Sartorius公司）；H1650-W高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）。

對照品：兒茶素、槲皮素-3-O-（6″-沒食子?；?β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-O-（6″-沒食子?；?β-D-葡萄糖苷、金絲桃苷、扁蓄苷、槲皮素、原兒茶酸、阿魏酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、酪氨酸、腺苷、2′-脫氧腺苷、肌苷、鳥苷、2′-脫氧鳥苷購于上海源葉生物科技有限公司；槲皮素-3-O-葡萄糖酸苷購于南京良緯生物科技有限公司；蘆丁、沒食子酸、綠原酸、絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、脯氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸購于中國食品藥品檢定研究院；槲皮苷購于中國藥品生物制品檢定所；山奈苷購于成都埃法生物科技有限公司；異槲皮苷、異櫻花素購于成都克洛瑪生物科技有限公司?；衔锏募兌染笥?8%。甲醇、甲酸為色譜純，購于Merck公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

1.2 樣品信息

桑寄生采集于廣西省，采收后立即干燥。經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉訓(xùn)紅教授鑒定為桑寄生科（Loranthaceae）植物桑寄生（Taxillus sutchuenensis（Lecomte）Danser）的干燥帶葉莖枝。樣品的采收信息見表1。留樣憑證存放于南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定實(shí)驗(yàn)室。

表1 桑寄生樣品的信息Table 1 Sample informations of Taxilli Herba

1.3 對照品溶液制備

精密稱取各對照品適量，分別加入70%甲醇配制成對照品儲備液。取各對照品儲備液適量，加70%甲醇定容至10 mL 容量瓶中配成混合對照品溶液，逐級稀釋得到一系列不同質(zhì)量濃度的工作溶液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 供試品溶液制備

取桑寄生干燥樣品，粉碎后過50目篩。精密稱定藥材粉末0.5 g，置于具塞錐形瓶中，加入70%甲醇15.5 mL，密封后稱定重量，超聲（500 W，40 kHz）32 min，冷卻，以70%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻過濾，濾液離心（12000 r/min，10 min）后收集上清液，稀釋10倍，經(jīng)0.22μm濾膜過濾即得。

1.5 分析條件

1.5.1 色譜條件色譜柱為XBridge?C18色譜柱（4.6 mm×100 mm，3.5μm）；柱溫為30 ℃；流動相為0.1%甲酸水（A）-甲醇（B）；梯度洗脫程序：0 ～5 min，2% ～27% B；5 ～8 min，27% ～31% B；8 ～14 min，31%～32%B；14 ～17 min，32%～34%B；17 ～22 min，34%～40%B；22 ～26 min，40%～73%B；26 ～29 min，73%～2%B；體積流速為0.5 mL/min；進(jìn)樣量為2μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源（ESI），正離子（ESI+）和負(fù)離子（ESI-）模式同時切換掃描；多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；噴霧電壓（IS）：4500 V（ESI+），-4500 V（ESI-）；離子源溫度（TEM）：550 ℃；氣簾氣（CUR）：275790 Pa，流速：40 L/min；霧化氣（GS1）和輔助氣（GS2）：413685 Pa，流速：55 L/min；接口加熱，全程通入氮?dú)狻?/p>

2 結(jié)果與討論

2.1 供試品制備方法的優(yōu)化

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，桑寄生中游離槲皮素的含量較少，主要以槲皮苷形式存在［21］，所以本實(shí)驗(yàn)以槲皮苷的提取率作為響應(yīng)值，對甲醇體積分?jǐn)?shù)（40%、50%、60%、70%、80%、90%）、液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1）（mL∶g）及提取時間（20、30、40、50、60、70 min）3 個重要因素進(jìn)行考察。由圖1可知，當(dāng)甲醇的體積分?jǐn)?shù)為50%～70%時，槲皮苷的提取率隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增大，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)升高時，提取率反而下降。其次，隨著料液比及提取時間的增大，提取率均隨之上升，但提取率在液料比達(dá)到30∶1時開始下降，而當(dāng)提取時間≥30 min時，提取率趨于穩(wěn)定。因此選擇甲醇體積分?jǐn)?shù)為70%，液料比為30∶1，提取時間為30 min。

圖1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of single factor experimentA：methanol concentration；B：liquid to material ratio；C：extraction time

2.1.2 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以甲醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、液料比（X2）和提取時間（X3）為考察因素，根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面法進(jìn)行三因素三水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以槲皮苷的提取率（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。應(yīng)用Design-Expert 8.0.6對數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合， 得到回歸方程為Y= 3.93 + 0.074X1+ 0.091X2+ 0.035X3- 0.360X1X2-0.085X1X3- 3.00 × 10-3X2X3-。對回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。P＜0.0001，F(xiàn)=33.39，表明回歸模型具有高度顯著性。同時，失擬項(xiàng)P=0.7715 ＞0.05，無顯著性，說明響應(yīng)值與預(yù)測值之間有較好的擬合度和可信度。利用軟件繪制各因素交互作用對響應(yīng)值影響的響應(yīng)面圖，響應(yīng)曲面坡度越大，表明該因素對響應(yīng)值的影響越大。如圖2所示，各因素對響應(yīng)值影響的大小順序?yàn)榧状俭w積分?jǐn)?shù)＞液料比＞提取時間。

圖2 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plot of interaction of various factors

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素、水平及結(jié)果Table 2 Factors，levels and results of Box-Behnken experiments

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 3 Variance analysis of response surface experiments results

2.1.3 模型驗(yàn)證通過對回歸方程求解，得到最佳提取條件如下：甲醇體積分?jǐn)?shù)為70%，液料比（mL∶g）為30.60∶1，提取時間為31.79 min，此時預(yù)測的響應(yīng)值為3.94 mg/g。為方便實(shí)際操作，將上述條件調(diào)整為甲醇體積分?jǐn)?shù)70%，液料比31∶1，提取時間32 min。在該條件下，進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證模型的可靠性。結(jié)果表明，平均提取率為3.77 mg/g，與預(yù)測值相差0.17%，較為接近。表明優(yōu)化后的提取條件是可靠的。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

考察了XBridge?C18（4.6 mm × 100 mm，3.5 μm）和 SynergiTMHydro-RP 100 ?（2.0 mm × 100 mm，2.5 μm）兩種色譜柱對33種目標(biāo)成分的分離效果，結(jié)果表明，前者對化合物的分離效果和色譜峰形均優(yōu)于后者，因此實(shí)驗(yàn)選擇XBridge?C18柱（4.6 mm ×100 mm，3.5μm）。此外，對不同的流動相系統(tǒng)（水-甲醇、水-乙醇、水-乙腈、0.1%甲酸水-甲醇）、柱溫（25、30、35 ℃）和流速（0.3、0.5、0.8 mL/min）進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，在30 ℃柱溫下，以0.1%甲酸水和甲醇為流動相，0.5 mL/min流速進(jìn)行梯度洗脫，可達(dá)到最佳分離效果。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在電噴霧離子源正、負(fù)離子模式下，將質(zhì)量濃度為100 ng/mL的目標(biāo)成分標(biāo)準(zhǔn)溶液注入質(zhì)譜儀進(jìn)行全掃描。結(jié)果表明，氨基酸類、核苷類成分及扁蓄苷在正離子模式下有較強(qiáng)的響應(yīng)和更好的峰形，而其他黃酮類及有機(jī)酸類成分在負(fù)離子模式下的響應(yīng)值更高，所以分別選擇正、負(fù)離子模式進(jìn)行檢測。同時優(yōu)化去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）等參數(shù)，得到最佳質(zhì)譜參數(shù)見表4，混合標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖見圖3。

圖3 桑寄生中33種目標(biāo)成分混合標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram（TIC）of standard mixture of 33 target constituents in Taxilli Herba the peak numbers denoted were the same as those in Table 4

表4 33種目標(biāo)成分的質(zhì)譜參數(shù)Table 4 Mass spectrometric parameters of 33 constituents

（續(xù)表4）

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系、檢出限與定量下限取“1.3”配制的系列濃度工作溶液按“1.5”條件進(jìn)樣測定。以各成分的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，ng/mL），得到33個目標(biāo)成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線。并分別以信噪比（S/N）約為3 和10 計(jì)算各成分的檢出限（LOD）和定量下限（LOQ），結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，33種目標(biāo)成分在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）均不低于0.9990， LOD 和LOQ 分 別 為0.13 ～66.85 ng/mL和0.42 ～222.83 ng/mL。

表5 33種目標(biāo)成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量下限Table 5 Linear equations，correlation coefficients，linear ranges，limits of detection and limits of quantitation of 33 constituents

（續(xù)表5）

2.4.2 精密度、重復(fù)性與穩(wěn)定性取“1.3”中混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按照本方法測定33種目標(biāo)成分的峰面積，計(jì)算得到各成分的日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.1%～3.3%；每天進(jìn)樣3次，連續(xù)進(jìn)樣分析3 d，計(jì)算各成分的日間RSD為0.97%～3.9%（表6），表明該儀器具有良好的精密度。精密稱取同一樣品（S10-2）6份制備供試品溶液，按“1.5”方法進(jìn)樣分析，計(jì)算33種目標(biāo)成分的RSD為1.4%～4.7%（表6），表明該方法的重復(fù)性良好。取S10-2樣品，按“1.4”方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h時進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算33種目標(biāo)成分的RSD為0.86%～4.6%（表6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表6 33種目標(biāo)成分的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性與加標(biāo)回收率Table 6 Precisions，repeatabilities，stabilities and recoveries of 33 constituents

（續(xù)表6）

2.4.3 加標(biāo)回收率精密稱定9份已知33種成分含量的桑寄生樣品粉末0.25 g，分別添加低、中、高3個水平（80%、100%、120%）的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個水平3個平行，按“1.4”方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定各成分的含量，并計(jì)算回收率和RSD（見表6）。結(jié)果顯示，33 種目標(biāo)成分的平均回收率為98.0%～101%，RSD為1.0%～3.4%，表明本方法的準(zhǔn)確度良好。

2.5 樣品含量測定

分別精密稱取各批次的桑寄生樣品粉末約0.5 g，按“1.4”方法制備供試品溶液，平行3 份，按“1.5”條件進(jìn)樣分析，并以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算各樣品中33種目標(biāo)成分的含量，結(jié)果見表7。

表7 33種目標(biāo)成分的含量測定結(jié)果（n=3，μg/g）Table 7 The content determination results of 33 constituents（n=3，μg/g）

2.6 數(shù)據(jù)分析

2.6.1 相關(guān)性分析基于表7 數(shù)據(jù)，通過SPSS 21.0軟件分別對14批桑寄生樣品莖枝、葉中的33種目標(biāo)成分進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，不同氨基酸成分之間的相關(guān)性較強(qiáng)，普遍存在顯著的正相關(guān)，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的谷氨酸為例，其與賴氨酸、組氨酸、精氨酸、絲氨酸、脯氨酸、纈氨酸及苯丙氨酸呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；組氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，但其與賴氨酸、精氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸及苯丙氨酸呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與纈氨酸、亮氨酸呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。除肌苷與2'-脫氧腺苷、鳥苷呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）外，其余各核苷類成分之間普遍存在正相關(guān)，但相關(guān)性不顯著（P＞0.05）。不同有機(jī)酸類成分中，沒食子酸與原兒茶酸、阿魏酸呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），綠原酸與阿魏酸呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），其余各有機(jī)酸之間均呈現(xiàn)不同程度的正相關(guān)，但相關(guān)性不顯著（P＞0.05）。槲皮苷與槲皮素、蘆丁、槲皮素3-O-（6"-沒食子?；?β-D-半乳糖苷之間存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01），提示該4種黃酮類成分在桑寄生藥材中的含量是相互促進(jìn)的，某種成分含量高，其余成分也會協(xié)同升高。槲皮素與槲皮苷情況一致；異槲皮苷與槲皮苷、槲皮素呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與槲皮素3-O-葡萄糖酸苷、蘆丁呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），且與其他黃酮類成分多呈不顯著的負(fù)相關(guān)（P＞0.05）。含量最高的槲皮素3-O-葡萄糖酸苷與蘆丁呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與異槲皮苷呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與槲皮素-3-O-（6"-沒食子酰基）-β-D-葡萄糖苷呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與其他黃酮類成分均有一定的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，但相關(guān)程度均不顯著（P＞0.05）。同時，不同類別的成分之間也存在一定的相關(guān)性，如兒茶素與沒食子酸、綠原酸、阿魏酸具有極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。原兒茶酸與金絲桃苷呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與異槲皮苷、異櫻花素呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與其他黃酮類成分呈現(xiàn)不同程度的負(fù)相關(guān)，其中，與蘆丁、槲皮苷、槲皮素呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），這表明當(dāng)原兒茶酸的含量升高，桑寄生中蘆丁、槲皮苷、槲皮素的含量會下降，具體原因有待進(jìn)一步探討。

圖4 33種成分的相關(guān)性熱圖Fig.4 Heat map of correlation between 33 constituents*P ＜0.05；**P ＜0.011-33 were the same as those in Table 4

2.6.2 獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)為更好地比較桑寄生莖枝和葉中各成分含量的差異，通過SPSS 21.0 對表7數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。結(jié)果表明，黃酮類成分中，在不同樣本莖枝和葉中含量較高的槲皮素3-O-葡萄糖酸苷、金絲桃苷、蘆丁、異槲皮苷、槲皮苷具有極顯著差異（P＜0.01），含量極低的扁蓄苷在莖枝、葉中也表現(xiàn)出極顯著差異（P＜0.01）；氨基酸成分中，除含量較高的成分谷氨酸外，異亮氨酸、亮氨酸及苯丙氨酸也在莖枝和葉之間達(dá)到顯著差異水平（P＜0.05），其他氨基酸間的差異不顯著（P＞0.05）；核苷類成分中，含量最高的腺苷及含量較高的肌苷與鳥苷在莖枝和葉之間的差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），另2 種核苷的含量無顯著差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)所測4 種有機(jī)酸的含量在莖枝、葉中均無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，槲皮素3-O-葡萄糖酸苷、金絲桃苷、蘆丁、異槲皮苷、槲皮苷、扁蓄苷在不同部位的含量分布順序?yàn)槿~＞莖枝，不同部位中各成分的含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而谷氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、腺苷、肌苷與鳥苷的含量也在桑寄生莖枝和葉中具有顯著差異。這表明桑寄生采收時應(yīng)注意保留有效成分含量高的葉，在干燥、包裝和運(yùn)輸過程中減少掉葉，并對桑寄生藥材的整個生產(chǎn)加工過程進(jìn)行更規(guī)范、嚴(yán)格的管理，以保證藥材質(zhì)量。

3 結(jié)論

本文建立了超快速液相色譜-三重四極桿-線性離子阱質(zhì)譜同時測定桑寄生中黃酮類、有機(jī)酸類、氨基酸類及核苷類共33種活性成分含量的方法，對供試品制備方法及色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，并通過相關(guān)性分析及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對桑寄生中33 種成分含量的變化關(guān)系及其在莖枝、葉中的含量差異進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為揭示桑寄生莖枝和葉中多元活性成分的分布規(guī)律及合理利用桑寄生資源提供了基礎(chǔ)資料，同時為桑寄生藥材內(nèi)在質(zhì)量的綜合評價和全面控制提供了新的參考方法。