肥胖兒童血清microRNA-27a、PPAR-γ與胰島素抵抗的相關(guān)性研究*

寇永妹，陳新春，谷小娜，楊振朋，孫國華

（唐山市人民醫(yī)院兒內(nèi)科，河北唐山 063001）

肥胖是指機(jī)體脂肪局部含量和/或總含量增多或分布異常的狀態(tài)。近年來隨著生活水平的提高和生活方式的改變，我國兒童肥胖患病率迅速上升，數(shù)據(jù)顯示，1985年—2014年我國≥7 歲兒童肥胖率從0.5%上升至7.3%，預(yù)計(jì)2020年兒童肥胖率將達(dá)到22.3%[1-2]。肥胖不僅嚴(yán)重影響兒童生長發(fā)育，還是一種獨(dú)立的慢性代謝性疾病，與胰島素抵抗（insulin resistance,IR）密切相關(guān)，是2 型糖尿病、非酒精性脂肪肝、代謝綜合征等慢性疾病的重要危險(xiǎn)因素，并會(huì)增加成年期慢性疾病的風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。IR 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，microRNA（miRNA）是一類非編碼RNA 分子，能降解靶基因和/或抑制靶基因翻譯，在IR 中發(fā)揮重要作用[5]。microRNA-27a（miR-27a）是一種與肥胖相關(guān)的miRNA，既往研究報(bào)道m(xù)iR-27a 在肥胖患者血清中表達(dá)上調(diào)，其過表達(dá)可導(dǎo)致骨骼肌對(duì)葡萄糖消耗和攝取能力的降低[6-7]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPAR-γ）是胰島素敏感性的重要調(diào)控因子，能入核調(diào)控具備PPAR 特異性反應(yīng)元件的下游基因，維持血糖穩(wěn)態(tài)，該基因缺失將導(dǎo)致IR[8]。研究[9]顯示，PPAR-γ 為miR-27a參與代謝的關(guān)鍵靶基因。目前關(guān)于miR-27a 和PPAR-γ 與肥胖兒童IR 的關(guān)系鮮有報(bào)道，本研究旨在分析肥胖兒童血清miR-27a、PPAR-γ 與IR 的相關(guān)性，以期為改善肥胖兒童IR 提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1月—2021年7月唐山市人民醫(yī)院104 例肥胖兒童為肥胖組。其中，男性64 例，女性40 例；年齡7～14 歲，平均（10.25±2.11）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①肥胖符合《中國兒童和青少年肥胖癥外科治療指南（2019 版）》[10]相關(guān)定義：體質(zhì)量指數(shù)（BMI）>生長標(biāo)準(zhǔn)曲線的第95 百分位數(shù)；②年齡≤14 歲；③臨床資料完整，具備良好依從性；④兒童家長或監(jiān)護(hù)人知情研究并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①藥物、激素等其他原因引起的繼發(fā)性肥胖者；②合并先天性疾病者；③合并甲狀腺疾病者；④合并心、肝、腎等重要臟器損害者；⑤合并急慢性感染者；⑥血液系統(tǒng)異常者。另選取同期本院體檢的63 名健康兒童為對(duì)照組。其中，男性38 例，女性25 例；年齡7～14 歲，平均（10.17±2.08）歲。兩組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

收集所有兒童身高和體重資料，計(jì)算BMI=體重（kg）/身高（m2）。并采集肥胖兒童和正常兒童空腹肘靜脈血，3 000 r/min 離心10 min，半徑8 cm，取上清分為2 份，置于-80℃冰箱中待檢。

其中一份采用葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖（fasting blood glucose,FBG），75 g 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)檢測空腹胰島素（fasting insulin,FINS），穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=FBG （mmol/L） ×FINS （mIU/L）/22.5。AU5800 全自動(dòng)生化分析儀（美國貝克曼庫爾特公司） 檢測總膽固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（triglycerides,TG）、高密度脂 蛋 白 膽 固 醇（high density lipoprotein cholesterol,HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol,LDL-C）。Multiskan FC酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]檢測血清脂聯(lián)素、瘦素、抵抗素、內(nèi)脂素、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6,IL-6）、腫瘤壞死因子- α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）水平，試劑盒均購自上海酶研生物科技有限公司。另一份采用Trizol 試劑盒（上海梵態(tài)生物科技有限公司）提取血清總RNA，Narodrop 分光光度計(jì)[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]驗(yàn)證cDNA 濃度及純度，OD260/OD280 為1.8～2.0，TaKaRa 試劑盒（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用qRT-PCR 儀（上海閎龍生物科技有限公司）和qRT-PCR 試劑盒（上海聯(lián)邁生物工程有限公司）進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增。miR-27a 正向引物：5'-TGCGCTTCACAGTGGCTAAGT-3'，反向引物：5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3'；內(nèi)參U6 正向引物：5'-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3'，反向引物： 5'-AAATATGGAACGCTTCACGA-3'；PPAR-γ 正向引物：5'-CTGGCCTCCCTGATGAATAA-3'，反向引物：5'-CGCAGGTTTTTGAGGAACTC-3'；內(nèi)參GAPDH 正向引物：5'-TGTGTCCGTCGTGGATC TGA-3'，反向引物：5'-CCTGCTTCACCACCTTCTTG AT-3'。10 μL 反應(yīng)體系：5.0 μL SYBR Premix Ex Taq；0.2 μL 引物；0.2 μL ROX 參考染料；1.0 μL cDNA 模板；3.4 μL 經(jīng)DEPC 處理水。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性90 s 循環(huán)1 次，95℃變性30 s、63℃退火30 s、72℃延伸15 s 循環(huán)40 次，制備熔解曲線。反應(yīng)結(jié)束后得到各反應(yīng)管Ct，采用2-ΔΔCt法計(jì)算血清miR-27a mRNA、PPAR-γ mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）或中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，比較用t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)分析用Pearson 或Spearman 法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組BMI、脂代謝指標(biāo)、細(xì)胞因子水平比較

兩組BMI、脂代謝指標(biāo)（除FBG 外）、細(xì)胞因子水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），肥胖組BMI、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、瘦素、抵抗素、內(nèi)脂素、IL-6、TNF-α、miR-27a mRNA 高于對(duì)照組，HDL-C、脂聯(lián)素、PPAR-γ mRNA 低于對(duì)照組。兩組FBG 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 肥胖組與對(duì)照組BMI、代謝指標(biāo)、細(xì)胞因子水平比較

2.2 血清miR-27a mRNA、PPAR-γ mRNA 與BMI、脂代謝指標(biāo)、細(xì)胞因子的相關(guān)性

Pearson/Spearman 相關(guān)性分析顯示，肥胖兒童血清miR-27a mRNA 與BMI、 FINS、 HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、瘦素、抵抗素、內(nèi)脂素、IL-6、TNF- α 呈正相關(guān)（r/rs=0.607、 0.362、 0.466、0.435、0.542、0.450、0.546、0.558、0.437、0.633和0.559，均P<0.05），與HDL-C、脂聯(lián)素、PPAR-γ mRNA 呈負(fù)相關(guān)（r/rs=-0.686、-0.607 和-0.727，均P<0.05）；肥胖兒童血清PPAR-γ mRNA 與BMI、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、瘦素、抵抗素、內(nèi)脂素、IL-6、TNF-α 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.513、-0.328、-0.437、-0.340、-0.434、-0.411、-0.537、-0.514、-0.428、-0.547 和-0.509，均P<0.05），與HDL-C、脂聯(lián)素呈正相關(guān)（r=0.599 和0.527，P<0.05）。見表2。

表2 miR-27a mRNA、PPAR-γ mRNA與BMI、脂代謝指標(biāo)、細(xì)胞因子的相關(guān)性

2.3 HOMA-IR 與血清脂代謝指標(biāo)、細(xì)胞因子的相關(guān)性

肥胖兒童HOMA-IR 與TC、TG、LDL-C、瘦素、抵抗素、內(nèi)脂素、IL-6、TNF-α 呈正相關(guān)（r/rs=0.167、0.168、0.259、0.442、0.426、0.372、0.438和0.441，均P<0.05），與HDL-C、脂聯(lián)素呈負(fù)相關(guān)（r=-0.240 和-0.378，均P<0.05）。見表3。

表3 HOMA-IR與脂代謝指標(biāo)、細(xì)胞因子的相關(guān)性

3 討論

兒童肥胖是由遺傳因素、環(huán)境因素等共同作用導(dǎo)致的一種獨(dú)立的慢性代謝性疾病，目前兒童肥胖形勢日益嚴(yán)峻，但相關(guān)干預(yù)和治療卻存在諸多挑戰(zhàn)，尚無充分證據(jù)證實(shí)外科手術(shù)減肥適用于肥胖兒童，其可能影響兒童的生長發(fā)育，而飲食和行為干預(yù)又很難達(dá)到顯著減肥效果，因此有必要進(jìn)一步探索兒童肥胖相關(guān)機(jī)制。IR 為肥胖兒童常見代謝異常因素之一，實(shí)質(zhì)為機(jī)體對(duì)能量過剩的一種代償反應(yīng)機(jī)制，當(dāng)機(jī)體儲(chǔ)存過多能量而肥胖時(shí)，胰島素不能發(fā)揮正常效應(yīng)，對(duì)葡萄糖攝取和利用效率降低，機(jī)體代償性分泌過多胰島素以維持血糖穩(wěn)定，是肥胖兒童心血管疾病發(fā)生的主要原因[11-12]。研究肥胖兒童IR 機(jī)制對(duì)降低體重和心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。

miRNA 是一類長度約22 個(gè)核苷酸的高度保守的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈非編碼RNA，能與靶mRNA 的3'非翻譯端相互作用，降解靶mRNA 或翻譯抑制，參與包括IR 等多種病理生理過程[13]。miR-27a 定位于人染色體19p13.12，在脂肪組織中高度表達(dá)，能作為負(fù)向調(diào)控劑促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)堆積，而脂肪過度積聚為肥胖者機(jī)體能量失衡的主要表現(xiàn)，因此miR-27a 被認(rèn)為是肥胖相關(guān)miRNA[6-7]。本研究結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，肥胖組血清miR-27a mRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯升高，說明miR-27a 參與肥胖發(fā)生，分析原因與miR-27a 高表達(dá)參與脂肪過度積聚有關(guān)。同時(shí)本研究結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，肥胖組FINS 和HOMA-IR 顯著升高，說明本組肥胖兒童存在明顯的IR，但兩組FBG 水平比較無差異，分析原因與肥胖兒童胰島素功能雖然受損，但還是能緩慢分泌胰島素降低血糖有關(guān)。作為肥胖相關(guān)miRNA，大量研究也報(bào)道了miR-27a 與IR 的關(guān)系，如YU 等[15]研究顯示，骨骼肌細(xì)胞中miR-27a 過表達(dá)可引起骨骼肌對(duì)葡萄糖消耗和攝取能力的降低，導(dǎo)致骨骼肌IR。骨骼肌是胰島素刺激葡萄糖吸收的主要效應(yīng)器官，在維持機(jī)體血糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，miR-27a 過表達(dá)能引起骨骼肌IR 提示miR-27a 參與IR 過程。本研究結(jié)果顯示，肥胖兒童血清miR-27a 與FINS、HOMA-IR 呈正相關(guān)，說明肥胖兒童血清miR-27a升高與IR 發(fā)生有關(guān)。脂肪組織是一個(gè)代謝和免疫功能活躍的器官，能特異性分泌大量具備活性的TC、TG、HDL-C、LDL-C、脂聯(lián)素、瘦素、抵抗素、內(nèi)脂素等脂肪因子，以及IL-6、TNF-α 等前炎癥因子。肥胖狀態(tài)下脂肪細(xì)胞體積變大和脂肪組織血流量異常等可引起脂肪因子和前炎癥因子異常表達(dá)，前炎癥因子能直接抑制胰島素信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致IR，脂肪因子代謝紊亂可導(dǎo)致大量脂肪堆積于肌肉、肝臟、β 細(xì)胞，引起胰島細(xì)胞功能障礙和IR[16-17]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，肥胖組TC、TG、LDL-C、瘦素、抵抗素、內(nèi)脂素、IL-6、TNF-α 水平升高，而HDL-C、脂聯(lián)素水平降低，說明肥胖兒童存在明顯脂代謝異常和炎癥反應(yīng)，與既往報(bào)道一致[18]。相關(guān)性分析表明HOMA-IR 與脂代謝異常和炎癥反應(yīng)相關(guān)，說明miR-27a mRNA高表達(dá)可能通過脂代謝異常和炎癥反應(yīng)參與肥胖兒童IR。

PPAR-γ 是一種核激素受體因子，具備轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制的作用，初始研究認(rèn)為其僅能調(diào)控脂肪細(xì)胞分化，在脂質(zhì)裂解和代謝中發(fā)揮重要作用，近年研究表明，PPAR-γ 還能通過調(diào)控葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4、胰島素受體底物等改善IR，同時(shí)PPAR-γ 也能通過控制脂肪組織分泌脂肪因子和前炎癥因子改善胰島素敏感性[8]。本研究結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，肥胖組血清PPAR-γ mRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯降低，說明PPAR-γ 參與肥胖發(fā)生，分析原因與PPAR-γ 參與脂質(zhì)裂解和代謝有關(guān)，PPAR-γ表達(dá)降低會(huì)抑制其裂解和代謝脂質(zhì)作用，導(dǎo)致脂肪過度積聚引起肥胖。結(jié)果還顯示，肥胖兒童血清PPAR-γ 與FINS、HOMA-IR 呈負(fù)相關(guān)，說明肥胖兒童血清PPAR-γ 表達(dá)降低與IR 發(fā)生有關(guān)，與既往報(bào)道一致[8]。相關(guān)性分析也說明PPAR-γ mRNA 相對(duì)表達(dá)量降低可能通過脂代謝異常和炎癥反應(yīng)參與肥胖兒童IR。生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果表明，miR-27a 可結(jié)合PPAR-γ mRNA 的3'非翻譯端，抑制PPAR-γ mRNA 表達(dá)，近年多項(xiàng)研究通過熒光報(bào)告素酶實(shí)驗(yàn)也證實(shí)miR-27a 能靶向抑制PPAR-γ mRNA 表達(dá)，從而發(fā)揮其生物學(xué)作用，如DENG 等[19]在綿羊脂肪生成研究中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-27a 能通過下調(diào)PPAR-γ 促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化和聚集。CHEN等[20]在小鼠肥胖和脂肪細(xì)胞IR 模型研究中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-27a 能通過下調(diào)PPAR-γ 降低脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用，并下調(diào)胰島素敏感性。本研究結(jié)果也顯示，肥胖兒童血清miR-27a mRNA與PPAR-γmRNA 呈負(fù)相關(guān)，因此可推測肥胖兒童血清miR-27a mRNA 高表達(dá)可能通過抑制PPAR-γ mRNA 表達(dá)導(dǎo)致IR，但該結(jié)論還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，肥胖兒童血清miR-27a mRNA 高表達(dá)、PPAR-γ mRNA 低表達(dá)，兩者與IR 密切相關(guān)。但本研究樣本量較少，關(guān)于miR-27a 和PPAR-γ 參與肥胖兒童IR 的機(jī)制有待研究驗(yàn)證，后續(xù)研究將進(jìn)一步探討二者與肥胖兒童預(yù)后的關(guān)系。