環(huán)境中抗生素抗性基因的分布、檢測及消除研究進(jìn)展

龍進(jìn)寶，幸鴻雁，李航軍，汪明金，費(fèi)孝桐，魏 嘉

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030）

抗生素作為藥品和飼料添加物被長期應(yīng)用，對人類社會(huì)產(chǎn)生了巨大的影響。大部分抗生素不能被人體或動(dòng)物體吸收，而以代謝產(chǎn)物的形式排出［1］。由于抗生素在畜牧養(yǎng)殖中的長期濫用，導(dǎo)致養(yǎng)殖動(dòng)物腸道內(nèi)誘導(dǎo)出抗生素抗性菌（Antibiotic Resistant Bacteria，ARB），抗生素與ARB 一起通過日常生活、醫(yī)療、養(yǎng)殖業(yè)等活動(dòng)進(jìn)入到環(huán)境中［2］。誘導(dǎo)并增強(qiáng)了其他微生物耐藥性，微生物通過自身突變或產(chǎn)生可移動(dòng)遺傳元件（MGEs）發(fā)生水平轉(zhuǎn)移來獲得相關(guān)抗性，進(jìn)而通過改變藥物作用位點(diǎn)、產(chǎn)生特定酶使抗菌藥物鈍化或被滅活、改變藥物代謝途徑等機(jī)制對抗生素產(chǎn)生抗性［3，4］。抗生素抗性基因（Antibiotic Resistance Genes ，ARGs）可以在非病原體、病原體甚至是遠(yuǎn)源相關(guān)生物之間轉(zhuǎn)移革蘭氏陰性和陽性菌等［5］，通過水平基因轉(zhuǎn)移的方式來增加ARGs 在環(huán)境中的遷移與傳播。

ARGs 不僅會(huì)污染環(huán)境，還對人體健康造成威脅。研究報(bào)道，抗生素除殺滅病原菌外，還對機(jī)體的免疫功能有影響，少數(shù)β-內(nèi)酰胺類抗生素屬增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的抗生素，大環(huán)內(nèi)酯、喹諾酮類抗生素屬與免疫系統(tǒng)有協(xié)同作用的抗生素［6］。檢測及消除ARGs 對于保護(hù)生態(tài)環(huán)境和機(jī)體健康尤為重要。

1 環(huán)境中抗生素抗性基因分布現(xiàn)狀

1.1 養(yǎng)殖場中的抗生素抗性基因

隨著養(yǎng)殖業(yè)工業(yè)化、大型化發(fā)展，抗生素被廣泛使用到養(yǎng)殖業(yè)中。養(yǎng)殖場中的ARB 和ARGs 通過廢水和糞便排放、養(yǎng)殖場人員進(jìn)出、肉制品生產(chǎn)等過程進(jìn)入環(huán)境，致使環(huán)境中的抗生素抗性基因豐度增加，擴(kuò)散效率可能超過親代細(xì)菌［7］，誘導(dǎo)多重抗性菌的產(chǎn)生。趙翰斌等［8］從肉鵝養(yǎng)殖場污水處理系統(tǒng)的樣品中分離出了一株對諾氟沙星有抗性的細(xì)菌并從中發(fā)現(xiàn)了ARGs。鄒威等［9］通過分析幾家規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖場的糞便樣品發(fā)現(xiàn)，不同規(guī)模的養(yǎng)豬場糞便ARGs 污染程度為中型最多、大型次之、小型最少，不同規(guī)模養(yǎng)雞場糞便中ARGs 相對豐度并無顯著差異，且雞糞中ARGs sul 和erm 的豐度高于豬糞。趙晶等［10］采集不同規(guī)模養(yǎng)殖場的糞肥、養(yǎng)殖場附近的地表水、土壤及種植的蔬菜，利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對氟喹諾酮類抗生素含量進(jìn)行分析，均檢測出氟喹諾酮類抗生素，且含量為糞肥最多、蔬菜最少。金明蘭等［11］從養(yǎng)禽場周圍不同水環(huán)境中分離出56株大腸桿菌，檢測其抗生素敏感性及抗性基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)18 株磺胺類抗性菌，且其中存在多重磺胺類抗性菌株。

Mahmoud 等［12］從埃及的12 個(gè)肉雞場的腸內(nèi)物質(zhì)中篩選出四環(huán)素抗性基因tet（M）、tet（W）、tet（Q）和tet（G），結(jié)果表明，tet（W）在所有腸樣品中都有表達(dá)。Tamminen 等［13］篩 選 鑒 定 了9 種 不 同 類 型ARGs，但發(fā)現(xiàn)在水體、魚類、沉積物中并沒有使用過抗生素的記錄。Andrea 等［14］在沒有抗生素選擇壓力的地方發(fā)現(xiàn)了抗生素耐藥腸球菌。在沒有使用過抗生素的養(yǎng)殖場環(huán)境中也檢測到了ARB 和ARGs，魚類生活的環(huán)境中含有抗性基因，并且在很多水產(chǎn)養(yǎng)殖場中都檢測到了多重耐藥菌株。

1.2 土壤中的抗生素抗性基因

抗生素和AGRs 殘留主要通過施肥、廢水排放或再生水灌溉等方式釋放到土壤環(huán)境中［15］，使土壤性質(zhì)發(fā)生改變，使土壤受到嚴(yán)重污染?？股貫E用導(dǎo)致的AGRs 環(huán)境擴(kuò)散和積累被認(rèn)為是生物污染，并逐漸成為全世界較為關(guān)注的環(huán)境污染問題［16］。糞便施肥是抗生素進(jìn)入環(huán)境的一種方式［17］。沈聰?shù)龋?8］在養(yǎng)雞場雞糞中共檢測到132～168 種ARGs亞型，其中氨基糖苷類最多。黃福義等［19］通過高通量熒光定量PCR 對比分析豬糞有機(jī)肥對水稻土ARB 和ARGs 分布發(fā)現(xiàn)，使用豬糞有機(jī)肥的水稻土中ARGs 的種類和豐度明顯增多。醫(yī)療廢物填埋積累導(dǎo)致磺酰胺和多藥耐藥基因的類型變多，并增加了抗性基因在土壤中的遷移率［20］?？股丶翱剐曰虮┞队诃h(huán)境中，含有抗生素的廢物應(yīng)謹(jǐn)慎管理，以免ARGs 污染。

1.3 水環(huán)境中的抗生素抗性基因

水環(huán)境中的ARGs 來源多，如工業(yè)廢水、醫(yī)療廢水、生活污水和養(yǎng)殖場廢水等。冀秀玲等［21］在黃浦江水域的2 個(gè)養(yǎng)殖場污水貯流池中共檢測出了7 種四環(huán)素類、4 種磺胺類的ARGs。黃福義等［22］在福建省尾礦庫庫區(qū)水體中發(fā)現(xiàn)97 種ARGs、11 種MGEs。胡靜［23］對污水處理廠進(jìn)水及出水樣品進(jìn)行檢測，夏季檢測到18 種ARGs，冬季檢測到20 種ARGs，表明ARGs 的分布有季節(jié)性差異。Jang 等［24］檢測海洋中的ARGs 豐度發(fā)現(xiàn)，南大洋ARGs 的絕對豐度比西太平洋低1.8 倍，β-內(nèi)酰胺和四環(huán)素抗性基因在所有樣本中均占主導(dǎo)地位。

2 抗生素抗性基因的檢測方法

檢測ARGs 的方法有微生物培養(yǎng)法、PCR 檢測、宏基因組學(xué)法等。傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法操作簡單靈活、標(biāo)準(zhǔn)化程度高、成本低，為細(xì)菌種屬鑒定及分子生物學(xué)檢測提供了基礎(chǔ)，但費(fèi)時(shí)較長；PCR 是最經(jīng)典、最常用的ARGs 檢測方法，較傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)，效率有很大提高；宏基因組學(xué)通過直接提取和克隆來自微生物的DNA 進(jìn)行基因組分析，無需對微生物進(jìn)行分離純化，簡化了微生物培養(yǎng)步驟，但對設(shè)備要求較高。金明蘭等［25］將樣品接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)，進(jìn)行分離鑒定、敏感性檢測以及耐藥性分析發(fā)現(xiàn)，不同來源菌株對磺胺類藥物的抗性不同，其中大腸桿菌對磺胺類抗生素抗性較高，且具有多重抗生素抗性。白龍等［26］建立了一種可以同時(shí)檢測雞源細(xì)菌中5 種四環(huán)素耐藥基因tetA、tetD、tetG、tetS、tetX的多重PCR 體系。江月等［27］使用高通量熒光定量PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR，在水庫水體中檢測出118 種ARGs，其中β-內(nèi)酰胺類ARGs 最多。Ma 等［28］用宏基因組學(xué)研究人類、豬和雞的糞便樣本中的ARGs，發(fā)現(xiàn)了高水平的四環(huán)素、紅霉素和氨基糖苷類耐藥基因，且3 種糞便中含有共同的ARGs，表明抗性基因可能通過某些途徑在環(huán)境中不斷傳播。

3 抗生素抗性基因的消減及去除方法

3.1 人工濕地處理系統(tǒng)

人工濕地技術(shù)因其工藝流程簡單、低耗高效等優(yōu)點(diǎn)已普及并運(yùn)用于不同國家的煉油廠、屠宰場、食品加工、紡織工業(yè)、采礦等領(lǐng)域的廢水處理［29］。程羽霄等［30］對潮汐流人工濕地以增加隔板、種植植物等方式進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)對7 類21 種ARGs 去除率高達(dá)83.82%～100.0%。張子揚(yáng)等［31］采用垂直潛流人工濕地處理ARGs 后發(fā)現(xiàn)，sulⅠ、sulⅡ、sul Ⅲ的平均去除率分別為89%、88%、84%。

Lamori 等［32］評估了人工濕地的去除效果，腸球菌的ARGs HF183、intl1 和ermF 的總體去除率分別為84.0%、66.6%、67.2%和13.1%。Huang 等［33］研究了人工濕地三段組合對ARB 和ARGs 去除的影響，結(jié)果表明，3 種混合人工濕地均可從廢水中去除98%以上的替米考星和多西環(huán)素，對ARGs intI1、ermB、ermC、ermF、tetW 和tetG 也有很高去除效率。人工濕地處理系統(tǒng)能有效削減抗性菌和抗性基因，但容易使抗性基因積累，且需要針對不同廢水性質(zhì)設(shè)計(jì)相應(yīng)的處理系統(tǒng)。

3.2 氯消毒和紫外消毒

在20 世紀(jì)60 年代時(shí)，紫外線消毒就被應(yīng)用在水處理中［34］，加氯消毒是最常用的手法，但其單獨(dú)使用時(shí)對ARGs 的去除效果不理想?？股乜剐缘娜コ嗜Q于氯的劑量和紫外線強(qiáng)度，大劑量的紫外線或氯氣抑制了ARGs 的轉(zhuǎn)移頻率［35］。紫外線/氯是去除ARGs tetM 和blaTem 最有效的方法，其次分別是氯化和紫外輻射［36］。盡管紫外線和氯氣處理可有效滅活細(xì)菌，但仍存在抗性基因降解不完全的現(xiàn)象［37］。Virender 等［38］研究發(fā)現(xiàn)，氯化能有效減少紅霉素和四環(huán)素的抗性基因，其中紅霉素和四環(huán)素抗性基因的去除率分別為0.42±0.12 和0.10±0.02 log，40%的紅霉素耐藥基因和80%的四環(huán)素耐藥基因在氯化后仍然能存在于廢水中。因此，即使在消毒后，ARGs 仍降解不完全，質(zhì)粒攜帶的抗性基因仍可能轉(zhuǎn)移到其他細(xì)菌中。

3.3 臭氧消毒

臭氧（O3）是一種有效降低磺胺甲惡唑（SMX）的綠色氧化劑［39，40］，其滅菌過程屬生物化學(xué)氧化反應(yīng)。O3處理過程中，pH 是關(guān)鍵性因素，隨pH 增大，O3分解為自由基的速率也隨之提高［41］。張佳麗等［42］研究發(fā)現(xiàn)，在溶液體積為1 L、初始青霉素G 為50 mg/L、初始pH 為11、O3為15 mg/L、反應(yīng)溫度為20 ℃的條件下，青霉素G 的去除率相對較高，O3氧化可迅速降解水中青霉G，5 min 后青霉素G 去除率為100%。O3的利用效率低，在臭氧化過程中可能形成一些有毒的消毒副產(chǎn)物（DBPs）［43］，在適當(dāng)臭氧劑量下，臭氧化和生物活性炭過濾工藝可有效去除水中的磺酰胺［44］，并將工藝中的消毒副產(chǎn)物降低至水質(zhì)安全標(biāo)準(zhǔn)水平。Stange 等［45］采用臭氧處理ARGs 5 min 后發(fā)現(xiàn)，ARGs 減少了4.3～4.6 log。

3.4 電離輻射技術(shù)

電離輻射技術(shù)去除抗生素抗性基因的原理是利用Χ 射線、γ 射線以及高能電子束來破壞細(xì)胞內(nèi)DNA 鏈。基于電離輻射技術(shù)的消毒效率不受季節(jié)的影響，與紫外和O3相比，具有耗電量低、對消毒后的 細(xì) 菌 有 明 顯 的 再 生 抵 抗 力 等 優(yōu) 點(diǎn)［46，47］。Shen等［48］研究表明，30 kGy 吸收劑量的γ 射線作用后，抗生素發(fā)酵殘留物中的紅霉素含量降低56%，大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因（ereA，ermB，mefA和mpfB）的豐度下降了1.0～1.3 log，且輻射對殘留物中的營養(yǎng)成分影響不明顯，發(fā)酵殘留物可作肥料。Chu 等［49］通過γ 射線處理紅霉素生產(chǎn)中的廢水，在50 kGy 吸收劑量下，ARGs、紅霉素、抗菌活性和化學(xué)需氧量（COD）的去除率分別為96.5%～99.8%，90.0%、47.8%和10.3%。研究對比電離輻射技術(shù)、臭氧化和熱處理技術(shù)對頭孢菌素發(fā)酵殘留物中抗生素降解率及抗性基因失活率，結(jié)果表明，3 種方法都能有效去除ARB和ARGs，但在100 kGy 劑量下的去除效果最佳［50］。

4 小結(jié)

自發(fā)現(xiàn)抗生素以來，從藥物到添加劑，抗生素的使用越來越廣泛。但抗生素的廣泛使用使得部分細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，所造成的疾病也更難治療。在長期的抗性環(huán)境中，部分的細(xì)菌基因也隨之改變，導(dǎo)致多重抗性菌的出現(xiàn)及抗性基因的傳播。中國已實(shí)施全面禁抗，減少抗生素的使用，抗生素造成的環(huán)境問題亟待解決，ARB 和ARGs 的檢測與消除方法仍需進(jìn)一步研究。