不同時(shí)期布魯菌性脊柱炎患者T淋巴細(xì)胞亞群的變化研究

周麗紅 伍彥輝 趙輝 王曉靜 張向娥

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取石家莊市第五醫(yī)院2016年5月至2020年5月確診的BS患者120例為研究對(duì)象。其中急性期患者70例(58.33%)，慢性期患者50例(41.67%)。急性期70例中，男52例(74%)，女18例(26%)；年齡22～69歲，平均年齡(44.86±11.28)歲。患者都與牛、羊有過(guò)較為親密的接觸，有的患者雖未與活體動(dòng)物有過(guò)親密接觸，但是接觸過(guò)未經(jīng)處理的牛羊肉與皮毛，其中2例患者喝過(guò)未經(jīng)消毒的羊奶。慢性期患者男36例(72%)，女14例(28%)；年齡16～66歲，平均年齡(42.48±16.45)歲?；颊呷粘Ｉ钪卸寂c牛羊等動(dòng)物有不同程度的接觸。做為平行對(duì)照，納入性別、年齡相仿的健康人員30例。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)：與我國(guó)在2012年新修訂的《布魯氏菌病診療指南》中的判斷標(biāo)準(zhǔn)相符：①有明確的流行病學(xué)史(有牛、羊接觸史或食入不熟牛羊肉制品或乳制品)；②在臨床治療中的反應(yīng)，患者表現(xiàn)為渾身無(wú)力、發(fā)燒、背部感覺酸脹疼痛、骨關(guān)節(jié)感覺疼痛等。還有些患者會(huì)有一些神經(jīng)癥狀出現(xiàn)，如頭痛等 ；③使用血清學(xué)檢查的方式進(jìn)行判定，選用的補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)滴度和試劑凝集滴度的比值為1∶100++。選用抗人免疫蛋白實(shí)驗(yàn)滴度時(shí)選用的數(shù)值需1∶400++?；蛘呋颊叩捏w液分泌物(血液、骨髓、其他體液及排泄物)分離到細(xì)菌。脊柱影像學(xué)檢查異常。邀請(qǐng)?jiān)撛壕哂休^多臨床經(jīng)驗(yàn)的主任醫(yī)師對(duì)患者進(jìn)行檢驗(yàn)，判斷其是否為BS；并對(duì)患者的個(gè)人資料進(jìn)行保存。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：患者有過(guò)強(qiáng)直性脊柱炎，曾做過(guò)脊柱外科手術(shù)、在進(jìn)行檢查時(shí)，拍攝體位不正確，得到的圖像不符合要求，患有脊柱結(jié)核的患者。

1.3 分期及標(biāo)準(zhǔn) 臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，依照我國(guó)在2012年最新修訂的《布魯氏菌病診療指南》為參考依據(jù)：(1)急性期：患病病程<6個(gè)月；(2)慢性期：患病過(guò)程>6個(gè)月。本研究經(jīng)過(guò)(石家莊市第五醫(yī)院倫理委員會(huì))認(rèn)證，并經(jīng)過(guò)患者家屬與本人同意。

1.4 標(biāo)本采集 在對(duì)患有BS的患者進(jìn)行血液樣本采集的時(shí)候，無(wú)論是哪一時(shí)期的患者，均要在采集當(dāng)天保持空腹?fàn)顟B(tài)，醫(yī)護(hù)人員從患者靜脈中抽出3 ml左右的血液，將其放置于事先準(zhǔn)備好的含有EDTA的紫頭管和不含抗凝劑的采血管中。隨后將得到的血液樣本送至流式細(xì)胞儀中進(jìn)行醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，使用離心設(shè)備對(duì)得到的不抗凝管血標(biāo)本進(jìn)行處理。提取血清，并將其放在-80℃的環(huán)境下保管。等待檢驗(yàn)分析。

1.5 主要實(shí)驗(yàn)試劑 試劑包括FACS Lysing Solution，BD Intrasure，BD Trucount，CD3 FITC，CD3 FITC，F(xiàn)alcon，CD4抗體與Foxp3抗體、CD25抗體，使用的檢測(cè)設(shè)備購(gòu)買于美國(guó)。使用的生物檢測(cè)儀為美國(guó)生產(chǎn)的全自動(dòng)檢測(cè)儀，使用的檢測(cè)方法為免疫濁度法。

1.6 主要儀器與設(shè)備 (1)顯微鏡購(gòu)于德國(guó)萊卡XS45B2；(2)BIO-RAD 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀產(chǎn)自美國(guó)；(3)安亭牌水平離心機(jī)；(4)酶標(biāo)儀產(chǎn)自美國(guó)品牌型號(hào)為BIO-RAD x Mark；(5)洗板機(jī)為TECAN，產(chǎn)自于奧地利；(6)流式細(xì)胞儀產(chǎn)自于美國(guó)，型號(hào)為FACS Canto_II。

1.7 T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)方法 (1)在抽取患者身上血液樣本時(shí)，將其血液用含有EDTA的試管進(jìn)行抽取儲(chǔ)存。(2)使用2個(gè)干凈的BD Trucount計(jì)數(shù)管，在其中1個(gè)計(jì)數(shù)管中加入CD3/CD8/CD45/CD4抗體的抗凝全血50 μl，并使其充分融合，在另一個(gè)計(jì)數(shù)管中加入同樣劑量的抗凝血，加入不同類型的抗體，具體為CD3/CD16+56/CD45/CD19。(3)將計(jì)數(shù)管中的液體充分搖晃均勻后，放在室溫下進(jìn)行15 min的靜置處理。(4)待處理完成后，將450 μl 1×FACS的溶血素加入其中，并對(duì)其進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，再次靜置15 min。(5)上機(jī)檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)，借助FACSCanto軟件完成檢測(cè)過(guò)程，并對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 BS患者臨床資料

2.1.1 臨床特征：觀察急性期BS和慢性期患者出現(xiàn)波狀熱，多汗，乏力，腰疼，自身活動(dòng)受限，腰背，睪丸發(fā)脹并感覺疼痛情況。見表1。

表1 急性期與慢性期患者的臨床表現(xiàn)比較 例(%)

2.1.2 血清學(xué)檢查：對(duì)120例研究對(duì)象進(jìn)行布氏桿菌凝集試驗(yàn)，得到的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性(100%)；急性期患者血沉(ESR)水平明顯升高，與慢性期患者和健康對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；急性期hs-CRP明顯升高與慢性期和健康對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 急性期、慢性期患者與健康對(duì)照組血清炎性因子檢測(cè)分析

2.2 T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)

表3 急性期與慢性期的患者T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果比較

3 討論

布魯菌病不僅具有較強(qiáng)的感染性與傳播性，且會(huì)對(duì)身體的各個(gè)系統(tǒng)帶來(lái)致命的威脅，在全世界范圍內(nèi)流行，并且能夠?qū)崿F(xiàn)人畜共患。主要多發(fā)于地中海、中東以及中南美洲的部分國(guó)家和地區(qū)[13]。我國(guó)當(dāng)前患有BS的人數(shù)已高達(dá)30～50萬(wàn)，并且每年的增長(zhǎng)幅度均在5 000～6 000人[14]。此病常侵襲骨關(guān)節(jié)，在多種疾病入侵的過(guò)程中，對(duì)脊柱所造成的傷害最為嚴(yán)重。近幾年由于該疾病受到地域與職業(yè)的限制，在實(shí)際治療中，若使用影像學(xué)檢測(cè)與臨床癥狀表現(xiàn)對(duì)其病癥進(jìn)行判斷，極易判斷錯(cuò)誤，將其與脊柱結(jié)核等疾病混淆，所以如何準(zhǔn)確的對(duì)BS做到準(zhǔn)確的診斷是當(dāng)前醫(yī)學(xué)治療所面臨的難題[15]。

3.1 臨床特征 BS在所有年齡段均可發(fā)生，本研究患者年齡16～69歲，絕大部分以男性為主，且他們的居住環(huán)境一般，從事的職業(yè)也都具有暴露因素。在對(duì)部分人群進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在布魯菌病的患病人群中，男性出現(xiàn)BS的可能性更高[16]。其中腰部疼痛最為明顯，偶爾會(huì)伴有腰椎間盤過(guò)度勞累而引起的受累情況。原因在于，患者可能之前有過(guò)相關(guān)炎癥或者是周圍軟組織受損的癥狀。在此次研究中，患有急性期BS的患者有94%的人員有腰部疼痛的現(xiàn)象，而患有慢性期的BS患者中，也有87%左右的人員伴有腰部疼痛的反應(yīng)。故在出現(xiàn)布魯菌病感染可能性較大的區(qū)域中，假如患者出現(xiàn)了腰部疼痛的臨床癥狀，需考慮BS。

3.2 實(shí)驗(yàn)室檢查 患者ESR與hs-CRP的變化，都能夠幫助醫(yī)生對(duì)BS和椎間盤突出進(jìn)行直觀分辨。在此次研究中，研究對(duì)象的上述兩項(xiàng)檢查結(jié)果全部高于正常水平，其中急性期患者明顯高于慢性期，提示急性期患者炎癥較重。使用ESR 與hs-CRP檢測(cè)的時(shí)候，能夠?qū)Ω腥救巳鹤龅阶R(shí)別，但對(duì)于 BS 的診斷缺乏特異性，所以只能將其看作評(píng)價(jià) BS 活動(dòng)性以及最終治療效果的一種參數(shù)[17]。病原菌的培養(yǎng)是診斷布魯菌病的金標(biāo)準(zhǔn)，但就目前的臨床研究可知，使用血培養(yǎng)得到的陽(yáng)性率不高、培養(yǎng)條件較為苛刻、需要較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間，當(dāng)前沒(méi)辦法將其作為診斷BS的常規(guī)檢測(cè)法。在本研究中，所有患者的布氏桿菌凝集試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，證明其具有良好的敏感度及特異度，且費(fèi)用較低。因此，對(duì)BS的初步診斷需要依靠血清學(xué)指標(biāo)。

3.3 T淋巴細(xì)胞亞群有關(guān)布魯菌病的病因與發(fā)病機(jī)制尚不清楚。布魯菌能夠通過(guò)消化系統(tǒng)、皮膚創(chuàng)口、口腔與鼻腔黏膜進(jìn)行傳遞。布魯菌進(jìn)入體內(nèi)后，吞噬細(xì)胞會(huì)快速對(duì)一部分細(xì)菌進(jìn)行吞噬，未被吞噬的細(xì)菌會(huì)在機(jī)體內(nèi)快速繁殖與細(xì)胞相結(jié)合，隨著淋巴源性進(jìn)行轉(zhuǎn)移，進(jìn)入到血液循環(huán)中。此時(shí)被感染的血液中含有大量的內(nèi)毒素，臨床反應(yīng)為畏寒、發(fā)熱。由于布魯菌能夠在胞內(nèi)寄生，從而導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答起到了主導(dǎo)作用。在整個(gè)布魯菌感染的過(guò)程中，T淋巴細(xì)胞免疫與細(xì)菌整個(gè)時(shí)期的活動(dòng)都密切相關(guān)，在急性與慢性期中，機(jī)體所表現(xiàn)出來(lái)的免疫功能狀態(tài)皆不相同。在此次研究中我們對(duì)不同時(shí)期的BS患者做了研究，對(duì)其T淋巴細(xì)胞亞群做了詳細(xì)分析，探究患者體內(nèi)免疫狀態(tài)的動(dòng)態(tài)過(guò)程，為布魯菌病所出現(xiàn)的慢性化發(fā)展原因與機(jī)制作出理論總結(jié)。