沉默MBNL1-AS1對H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響

郭亮 余新建

心肌細(xì)胞的凋亡參與了許多心血管疾病的發(fā)生，發(fā)展過程，而氧化應(yīng)激增加能激活心肌細(xì)胞凋亡[1,2]。因此，抑制心肌細(xì)胞損傷有利于心血管疾病的治療。研究表明非編碼RNA在心血管疾病相關(guān)的細(xì)胞死亡中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[3]。盲肌樣蛋白1反義RNA1(MBNL1-AS1)是一種lncRNA，研究報道MBNL1-AS1的下調(diào)通過靶向KCNMA1，保護(hù)了七氟醚預(yù)處理的小鼠免于缺血再灌注損傷[4]。研究報道敲低PVT1可通過上調(diào)miR-135a-5p來減輕缺氧引起的H9c2細(xì)胞損傷[5]。在大鼠原代心肌細(xì)胞中，沉默circArhgap12通過海綿miR-135a-5p促進(jìn)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激[6]。Krüppel樣因子4(KLF4)是一種鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，研究報道m(xù)iR-506和miR-214的過表達(dá)通過抑制KLF4和KLF5的表達(dá)對H2O2引起的心肌損傷具有保護(hù)作用[7]。SNHG14通過在體外調(diào)節(jié)miR-25-3p/KLF4軸來保護(hù)H9c2細(xì)胞免受缺氧誘導(dǎo)的損傷[8]。而MBNL1-AS1是否通過調(diào)控miR-135a-5p及KLF4影響心肌損傷尚不清楚。因此，本實驗用H2O2用處理心肌細(xì)胞H9C2，研究MBNL1-AS1對心肌細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制是否與miR-135a-5p和KLF4有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 試劑材料 H9C2細(xì)胞(美國ATCC；DMEM培養(yǎng)基美國Hyclone公司；過氧化氫(H2O2)溶液購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；熒光定量試劑盒購自日本Takara；蛋白提取試劑盒購自美國Invent公司；凋亡檢測試劑盒購自日本同仁研究所；MDA含量及SOD活性檢測試劑盒購自上海信裕生物科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國AAT Bioquest 公司。

1.2 細(xì)胞處理與分組 H9C2細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，用200 μmol/L的H2O2溶液培養(yǎng)H9C2細(xì)胞12 h作為H2O2組，正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為Con組；將si-NC、si-MBNL1-AS1、miR-NC、miR-135a-5p轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞后用200 μmol/L的H2O2溶液處理，作為H2O2+si-NC組、H2O2+si-MBNL1-AS1組、H2O2+miR-NC組、H2O2+miR-135a-5p組；將si-MBNL1-AS1分別與anti-miR-NC、anti-miR-135a-5p轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞后用200 μmol/L的H2O2溶液處理，作為H2O2+si-MBNL1-AS1+anti-miR-NC組、H2O2+si-MBNL1-AS1+anti-miR-135a-5p組。

1.3 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測MBNL1-AS1和miR-135a-5p的表達(dá)水平 提取各組心肌細(xì)胞總RNA，合成cDNA，然后進(jìn)行PCR，相對表達(dá)量用2-△△Ct法計算。MBNL1-AS1上游引物序列：5’-CTCCCGCTT

CTACCGAC-3’，下游引物序列：5’-TTGGTGCATTTAA

GGCGGC-3’；GAPDH上游引物序列：5’-TTCACCACC

ATGGAGAAGGC-3’，下游引物序列：5’-GGCATGGAC

TGTGGTCATGA-3’；miR-135a-5p上游引物序列：5’-GCCGCTATGGCTTTTTATTCCTATGTGA-3’，下游引物序列：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.4 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測KLF4蛋白表達(dá) 提取心肌細(xì)胞的總蛋白，然后通過SDS-PAGE分離蛋白，再轉(zhuǎn)移至PVDF上，用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入KLF4多克隆一抗后37℃孵育2 h，然后加入二抗室溫孵育2 h，顯影，定影，分析蛋白條帶灰度值，以KLF4和GAPDH灰度值的比值作為蛋白相對表達(dá)水平。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 孵育48 h后收集各組細(xì)胞，并用冷磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中洗滌，棄去上清液并將細(xì)胞重懸于結(jié)合緩沖液中，向每100 微升細(xì)胞懸液中加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，室溫下孵育細(xì)胞15 min；再添加400 μl的結(jié)合緩沖液，輕輕混合，上流式細(xì)胞儀分析。

1.6 試劑盒檢測SOD活性和MDA含量 細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集4組細(xì)胞，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.7 雙熒光素酶報告實驗 構(gòu)建MBNL1-AS1以及KLF4的熒光素酶野生型和突變型載體，然后將其分別與miR-NC和miR-135a-5p共轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，按照說明書檢測熒光素酶強度，用螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶強度的比值計算相對熒光素酶的活性。

2 結(jié)果

2.1 MBNL1-AS1、miR-135a-5p和KLF4的表達(dá) 與Con組相比，H2O2組心肌細(xì)胞中MBNL1-AS1表達(dá)水平升高，miR-135a-5p表達(dá)水平降低，KLF4蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與H2O2組和H2O2+si-NC組相比，H2O2+si-MBNL1-AS1組心肌細(xì)胞中MBNL1-AS1表達(dá)水平降低，miR-135a-5p表達(dá)水平升高，KLF4蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 KLF4蛋白的表達(dá)

表1 MBNL1-AS1、miR-135a-5p和KLF4表達(dá)的檢測

2.2 沉默MBNL1-AS1對H2O2誘導(dǎo)H9C2氧化應(yīng)激的影響 與Con組比較，H2O2組心肌細(xì)胞中MDA含量升高(P<0.05)，SOD活性降低(P<0.05)；與H2O2組和H2O2+si-NC組比較，H2O2+si-MBNL1-AS1組心肌細(xì)胞中MDA含量降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)。見表2。

表2 沉默MBNL1-AS1減弱H2O2誘導(dǎo)的H9C2氧化應(yīng)激

2.3 沉默MBNL1-AS1對H2O2誘導(dǎo)的H9C2損傷的影響 與Con組比較，H2O2組心肌細(xì)胞的凋亡率升高明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與H2O2組和

H2O2+si-NC組相比，H2O2+si-MBNL1-AS1組心肌細(xì)胞的凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3，圖2。

表3 沉默MBNL1-AS1減輕H2O2誘導(dǎo)的H9C2損傷

圖2 沉默MBNL1-AS1對凋亡率的檢測

2.4 MBNL1-AS1、miR-135a-5p和KLF4靶向關(guān)系的驗證 Starbase預(yù)測顯示MBNL1-AS1與miR-135a-5p有互補的核苷酸序列；targetscan預(yù)測顯示miR-135a-5p與KLF4有互補的核苷酸序列。wt-MBNL1-AS1或wt-KLF4與miR-135a-5p共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性降低；而mut-MBNL1-AS1或mut-KLF4與miR-135a-5p共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性無顯著差異(P>0.05)。見圖3，表4。

圖3 MBNL1-AS1、miR-135a-5p和KLF4互補序列及熒光素酶活性

表4 雙熒光素酶報告實驗

2.5 miR-135a-5p對H2O2誘導(dǎo)的H9C2損傷氧化應(yīng)激的影響 與H2O2+miR-NC組比較，H2O2+miR-135a-5p組miR-135a-5p表達(dá)水平升高，KLF4蛋白表達(dá)水平降低，MDA含量降低，SOD活性升高，細(xì)胞凋亡率降低，組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4，表5。

圖4 miR-135a-5p對KLF4蛋白表達(dá)和凋亡率的檢測

表5 miR-135a-5p減弱H2O2誘導(dǎo)的H9C2損傷氧化應(yīng)激

2.6 抑制miR-135a-5p可逆轉(zhuǎn)沉默MBNL1-AS1對H2O2誘導(dǎo)的H9C2損傷氧化應(yīng)激的影響 與H2O2+si-MBNL1-AS1組和H2O2+si-MBNL1-AS1+anti-miR-NC組相比，miR-135a-5p表達(dá)水平降低，KLF4蛋白表達(dá)水平升高，MDA含量升高，SOD活性降低，細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。見圖5，表6。

圖5 抑制miR-135a-5p可逆轉(zhuǎn)沉默MBNL1-AS1對KLF4蛋白表達(dá)和凋亡率的檢測

表6 抑制miR-135a-5p可逆轉(zhuǎn)沉默MBNL1-AS1對H2O2誘導(dǎo)的H9C2的影響

3 討論

心肌梗死和心力衰竭等多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中都有心肌細(xì)胞損傷[9,10]。研究報道lncRNA-HOTAIR通過miR-125抑制MMP2加劇了氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷[11]。LncRNA Gpr19抑制通過miR-324-5p/Mtfr1軸抑制細(xì)胞細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，從而減輕了急性心肌梗塞后的缺血再灌注損傷[12]。本實驗結(jié)果顯示，過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中MBNL1-AS1表達(dá)水平升高；本實驗沉默MBNL1-AS1表達(dá)后，心肌細(xì)胞的凋亡率降低，MDA含量降低，SOD活性升高；表明沉默MBNL1-AS1表達(dá)可抑制過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。

本實驗顯示，MBNL1-AS1與miR-135a-5p有結(jié)合位點，且證實MBNL1-AS1靶向調(diào)控miR-135a-5p。研究報道氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中miR-135a-5p表達(dá)降低，抑制SNHG6可通過上調(diào)miR-135a-5p減輕ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC損傷[13]。miR-135a-5p可通過下調(diào)SP1基因來抑制PC12細(xì)胞凋亡[14]。miR-135a-5p的過表達(dá)可以通過抑制ROCK1/2來改善腦缺氧/復(fù)氧損傷[15]。說明miR-135a-5p參與細(xì)胞損傷應(yīng)激氧化應(yīng)激反應(yīng)。本實驗結(jié)果顯示，過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-135a-5p表達(dá)水平降低；過表達(dá)miR-135a-5p后心肌細(xì)胞的凋亡率降低，MDA含量降低，SOD活性升高；表明過表達(dá)miR-135a-5p可抑制過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激；且抑制miR-135a-5p可逆轉(zhuǎn)沉默MBNL1-AS1對過氧化氫誘導(dǎo)的H9C2損傷的作用。表明MBNL1-AS1可能通過調(diào)控miR-135a-5p影響心肌細(xì)胞損傷。

研究報道KLF4通過調(diào)節(jié)心肌素的表達(dá)和活性來調(diào)節(jié)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心臟肥大[16]。抑制miR-92a可通過調(diào)控KLF4保護(hù)大鼠急性心肌梗死后的內(nèi)皮細(xì)胞損傷[17]。miR-145通過靶向KLF4保護(hù)濾泡性顆粒細(xì)胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[18]。表明KLF4參與細(xì)胞損傷過程。本實驗結(jié)果表明miR-135a-5p可靶向調(diào)控KLF4及抑制過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，提示miR-135a-5p可能通過靶向調(diào)控KLF4影響心肌細(xì)胞損傷。沉默MBNL1-AS1后，miR-135a-5p表達(dá)水平升高，KLF4蛋白表達(dá)水平降低，提示MBNL1-AS1可能通過miR-135a-5p進(jìn)而調(diào)控KLF4。

綜上所述，沉默MBNL1-AS1可能通過調(diào)控miR-135a-5p/KLF4抑制過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。