沉默F(xiàn)OXD3-AS1調(diào)控miR-335-3p/PTEN對(duì)H2O2作用的神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響

劉秀竹 劉鴻淵 李宗平 廖英 王曉毅

氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷是神經(jīng)退行性疾病的重要發(fā)病機(jī)制，影響神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)展[1,2]。因此，抑制神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷對(duì)治療相關(guān)疾病具有重要意義。研究表明lncRNA在神經(jīng)系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有重要作用[3]。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子D3反義RNA 1(forkhead box D3 antisense RNA 1,FOXD3-AS1)是一種lncRNA，研究報(bào)道氧葡萄糖剝奪/復(fù)氧后N2a細(xì)胞中FOXD3-AS1上調(diào)，F(xiàn)OXD3-AS1敲低可通過miR-765/BCL2L13軸防止腦缺血/再灌注損傷[4]。FOXD3-AS1過表達(dá)可通過促進(jìn)自噬加重心肌細(xì)胞的缺血/再灌注損傷[5]。然而FOXD3-AS1對(duì)過氧化氫(H2O2)作用的神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制尚不清楚。miR-335-3p是一種富含神經(jīng)元的microRNA，與神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)；研究報(bào)道敲除circTLK1通過miR-335-3p/TIPARP可以顯著減少梗死體積，減輕神經(jīng)元損傷并改善神經(jīng)功能缺損[6]。H2O2誘導(dǎo)的HLE-B3細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中miR-335-3p下調(diào)表達(dá)[7]。但miR-335-3p在H2O2作用的神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)及作用尚不清楚。研究表明，10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)在神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)元再生中起重要作用，抑制PTEN表達(dá)有益于周圍神經(jīng)損傷后的神經(jīng)再生和功能恢復(fù)[8]。甘氨酸通過PTEN/Akt信號(hào)通路減輕大鼠腦出血損傷[9]。生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)FOXD3-AS1與miR-335-3p有結(jié)合位點(diǎn)，miR-335-3p與PTEN有結(jié)合位點(diǎn)，但其之間的關(guān)系尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究FOXD3-AS1對(duì)H2O2作用的神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制是否與miR-335-3p和PTEN相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料 PC12細(xì)胞(美國(guó)ATCC)；DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO)；H2O2(上海鈺博生物)；Trizol試劑(南京森貝伽生物)；SYBR Premix ExTaqTM試劑盒(武漢科昊佳生物)；RIPA蛋白裂解液(上海北諾生物)；MTT試劑盒(大連美侖生物)；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(上海貝博生物)；CAT、SOD活性檢測(cè)試劑盒、MDA含量檢測(cè)試劑盒(上海研卉生物)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(上海翌圣生物)。

1.2 細(xì)胞處理與分組 PC12細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，用200 μmol/L的H2O2處理細(xì)胞24 h，記為H2O2組；常規(guī)培養(yǎng)不作處理的細(xì)胞作為Control組；將FOXD3-AS1干擾載體及其陰性對(duì)照、miR-335-3p模擬物及其陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞后用200 μmol/L的H2O2處理，記為H2O2+si-FOXD3-AS1組、H2O2+si-NC組、H2O2+miR-335-3p組、H2O2+miR-NC組；將FOXD3-AS1干擾載體與miR-335-3p抑制劑共轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞后用200 μmol/L的H2O2處理，記為H2O2+si-FOXD3-AS1+anti-miR-335-3p組。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)FOXD3-AS1和miR-335-3p的表達(dá)水平 提取各組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GAPDH和U6為內(nèi)參進(jìn)行PCR，相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。FOXD3-AS1上游引物序列：5’-GGTGGAGGAGGCGAGGATG-3’，下游引物序列：5’-AGCGGACAGACAGGGATTGG-3’；GAPDH上游引物序列：5’-CTGACATGCCGCCTGGAGA-3’，下游引物序列：5’-ATGTAGGCCATGAGGTCCAC-3’；miR-335-3p上游引物序列：5’-GTTTTTCATTATTGCTCCTGACCA-3’，下游引物序列：5’-CGTGCATCTAGACCGTCATAG

A-3’；U6上游引物序列：5’-ATGACGTCTGCCTTGGAG

AAC-3’，下游引物序列：5’-TCAGTGTGCTACGGAGTT

CAG-3’。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)PTEN蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白，定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，每孔泳道上樣40 μg蛋白，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF，將膜置于5%脫脂牛奶中封閉2 h，加入PTEN一抗4℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育2 h，顯影、定影，分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為參照計(jì)算PTEN相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞活力 4組細(xì)胞48 h每孔加入20 μl的MTT溶液，孵育4 h后棄去上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，振蕩反應(yīng)10 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm吸光度(OD)值。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，漂洗后加入結(jié)合緩沖液重懸，然后加入10 μl的Annexin V-FITC和5 μl的PI，混勻，避光孵育10 min；上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.7 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中CAT、SOD的活性以及MDA的含量 收集各組培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 將FOXD3-AS1及PTEN的野生型和突變型熒光素酶載體分別與miR-NC、miR-335-3p共轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞中，然后按照試劑盒說明檢測(cè)熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 沉默F(xiàn)OXD3-AS1對(duì)H2O2處理的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與Control組比較，H2O2組CAT、SOD活性降低，MDA含量升高(P<0.05)；與H2O2組和H2O2+si-NC組比較，H2O2+si-FOXD3-AS1組CAT、SOD活性升高，MDA含量降低(P<0.05)。見表1。

表1 沉默F(xiàn)OXD3-AS1對(duì)H2O2處理的PC12氧化應(yīng)激的影響

2.2 沉默F(xiàn)OXD3-AS1對(duì)H2O2處理的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 與Control組比較，H2O2組FOXD3-AS1及PTEN表達(dá)水平升高，miR-335-3p表達(dá)水平降低，細(xì)胞活力降低，細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)；與H2O2組和H2O2+si-NC組比較，H2O2+si-FOXD3-AS1組FOXD3-AS1及PTEN表達(dá)水平降低，miR-335-3p表達(dá)水平升高，細(xì)胞活力升高，細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 沉默F(xiàn)OXD3-AS1對(duì)H2O2處理的PC12凋亡及PTEN蛋白表達(dá)的影響;A 沉默F(xiàn)OXD3-AS1可抑制H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá);B 沉默F(xiàn)OXD3-AS1可抑制H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡

表2 沉默F(xiàn)OXD3-AS1對(duì)H2O2處理的PC12凋亡的影響

2.3 miR-335-3p對(duì)H2O2處理的神經(jīng)細(xì)胞凋亡氧化應(yīng)激的影響 與H2O2組和H2O2+iR-NC組比較，H2O2+miR-335-3p組miR-335-3p表達(dá)水平升高，PTEN表達(dá)水平降低，細(xì)胞活力升高，細(xì)胞凋亡率降低，CAT、SOD活性升高，MDA含量降低(P<0.05)。見圖2，表3。

圖2 miR-335-3p對(duì)H2O2處理的PC12凋亡及PTEN蛋白表達(dá)的影響；A miR-335-3p可抑制H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)；B miR-335-3p可抑制H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡

表3 miR-335-3p對(duì)H2O2處理的PC12凋亡氧化應(yīng)激的影響

2.4 FOXD3-AS1靶向miR-335-3p、miR-335-3p靶向PTEN DIANA Tools軟件預(yù)測(cè)顯示FOXD3-AS1和miR-335-3p有互補(bǔ)序列；targetscan軟件預(yù)測(cè)顯示miR-335-3p和PTEN有互補(bǔ)序列。wt-FOXD3-AS1或wt-PTEN與miR-335-3p共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性降低(P<0.05)；而mut-FOXD3-AS1或mut-PTEN與miR-335-3p共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)顯著變化。見表4，圖3。

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

圖3 FOXD3-AS1、miR-335-3p、PTEN的靶向關(guān)系預(yù)測(cè);A FOXD3-AS1和miR-335-3p的互補(bǔ)序列;B miR-335-3p和PTEN的互補(bǔ)序列

2.5 抑制miR-335-3p可逆轉(zhuǎn)沉默F(xiàn)OXD3-AS1對(duì)H2O2處理的神經(jīng)細(xì)胞凋亡氧化應(yīng)激的影響 與H2O2+si-FOXD3-AS1組比較，H2O2+si-FOXD3-AS1+anti-miR-335-3p組miR-335-3p表達(dá)水平降低，PTEN表達(dá)水平升高，細(xì)胞活力降低，細(xì)胞凋亡率升高，CAT、SOD活性降低，MDA含量升高(P<0.05)。見圖4，表5。

圖4 抑制miR-335-3p可逆轉(zhuǎn)沉默F(xiàn)OXD3-AS1對(duì)H2O2處理的PC12凋亡的作用;A 抑制miR-335-3p可逆轉(zhuǎn)沉默F(xiàn)OXD3-AS1對(duì)H2O2處理的PC12中PTEN蛋白表達(dá)的抑制作用;B 抑制miR-335-3p可逆轉(zhuǎn)沉默F(xiàn)OXD3-AS1對(duì)H2O2處理的PC12凋亡的抑制作用

表5 抑制miR-335-3p可逆轉(zhuǎn)沉默F(xiàn)OXD3-AS1對(duì)H2O2處理的PC12凋亡氧化應(yīng)激的作用

3 討論

神經(jīng)退行性疾病是嚴(yán)重影響人類健康的常見疾病，氧化應(yīng)激在其中發(fā)揮重要作用，過量自由基可導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激水平升高，從而引起神經(jīng)元的損傷和凋亡[10,11]。H2O2廣泛用于細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的制作。本實(shí)驗(yàn)用H2O2處理PC12細(xì)胞誘導(dǎo)氧化損傷模型。研究報(bào)道FOXD3-AS1敲低可通過上調(diào)miR-150-5p延長(zhǎng)細(xì)胞存活率并抑制細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)AC16心肌細(xì)胞免受缺氧誘導(dǎo)的損傷[12]。FOXD3-AS1通過海綿化miR-150調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H2O2作用的神經(jīng)細(xì)胞中FOXD3-AS1表達(dá)水平升高。沉默F(xiàn)OXD3-AS1后，細(xì)胞活力升高，細(xì)胞凋亡率降低，過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性升高，丙二醛(MDA)含量降低；CAT、SOD是關(guān)鍵的抗氧化酶，CAT可通過破壞細(xì)胞中的H2O2產(chǎn)生水和氧氣來(lái)在很大程度上減輕氧化應(yīng)激[14]。SOD具有清除氧自由基的作用，可增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力；MDA是脂質(zhì)過氧化代謝的終產(chǎn)物，其含量直接反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的速率和強(qiáng)度[15]。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明沉默F(xiàn)OXD3-AS1可減弱H2O2處理PC12細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激。

研究報(bào)道m(xù)iR-19b可通過靶向PTEN，抑制氧化應(yīng)激，促進(jìn)細(xì)胞存活和抑制細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用[16]。沉默PTEN可以抑制七氟醚引起的氧化應(yīng)激損傷和海馬細(xì)胞凋亡[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H2O2作用的神經(jīng)細(xì)胞中PTEN表達(dá)水平升高，說明PTEN可能與神經(jīng)細(xì)胞損傷有關(guān)，與前人研究結(jié)果相符。且本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-335-3p靶向調(diào)控PTEN。H2O2作用的神經(jīng)細(xì)胞中miR-335-3p表達(dá)降低；過表達(dá)miR-335-3p，細(xì)胞活力升高，凋亡率降低，CAT、SOD活性升高，MDA含量降低；說明過表達(dá)miR-335-3p可減弱H2O2處理PC12細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激，其機(jī)制可能與調(diào)控PTEN有關(guān)。此外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXD3-AS1可有效靶向調(diào)控miR-335-3p；而抑制miR-335-3p可逆轉(zhuǎn)沉默F(xiàn)OXD3-AS1，對(duì)H2O2處理的PC12細(xì)胞損傷的作用。

綜上所述，沉默F(xiàn)OXD3-AS1通過調(diào)控miR-335-3p/PTEN軸減輕H2O2作用的神經(jīng)細(xì)胞損傷。