有機(jī)磷類農(nóng)藥質(zhì)譜圖中常見(jiàn)的碎片離子 及其應(yīng)用

◎ 肖傳勇，王紅梅，曹盟盟，姜玉龍

（德州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中心，山東 德州 253015）

有機(jī)磷類農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的農(nóng)藥之一，具有藥效高、品種多、應(yīng)用廣以及低生物積累性等特點(diǎn)[1]。然而，有機(jī)磷類農(nóng)藥具有神經(jīng)毒性，進(jìn)入人體后會(huì)抑制血液和組織中膽堿酯酶活性，引起膽堿能神經(jīng)功能紊亂，表現(xiàn)為出汗、震顫、共濟(jì)失調(diào)、精神錯(cuò)亂和語(yǔ)言失常等一系列神經(jīng)中毒現(xiàn)象[2]。截至2019年11月29日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部共規(guī)定了25種有機(jī)磷類農(nóng)藥被禁用或限用[3]；國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）明確規(guī)定了55種有機(jī)磷類農(nóng)藥在食物中農(nóng)藥殘留的最大限量[4]。

隨著分析儀器的發(fā)展，農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留的定量檢測(cè)法主要有氣相色譜法[5-6]、氣相色譜-質(zhì)譜法（Gas Chromatograph-Mass Spectrometer，GC-MS）[7-8]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9-10]。其中，氣相色譜-質(zhì)譜法被廣泛應(yīng)用。利用GC-MS法定量檢測(cè)有機(jī)磷類農(nóng)藥均涉及EI源[11]。在特定條件下經(jīng)EI源轟擊后，有機(jī)磷類農(nóng)藥會(huì)按照一定的質(zhì)譜裂解歷程形成特定的、能反映化合物結(jié)構(gòu)的碎片離子，這些碎片離子可以作為GC-MS法的特征離子。

有機(jī)磷類農(nóng)藥屬于磷酸酯類或硫代磷酸酯類化合物，具有相似結(jié)構(gòu)，經(jīng)電子轟擊后，可發(fā)生相同的質(zhì)譜行為，產(chǎn)生相同的碎片離子[12-13]。本文利用有機(jī)質(zhì)譜解析原理研究了有機(jī)磷類農(nóng)藥產(chǎn)生相同碎片離子的裂解歷程，提出了質(zhì)譜中有機(jī)磷類農(nóng)藥常見(jiàn)碎片離子；在采用質(zhì)譜法定量檢測(cè)有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留時(shí)，根據(jù)各待測(cè)組分與色譜柱相互作用原理，合理利用這些常見(jiàn)的碎片離子，可保證定性定量的準(zhǔn)確性。

1 質(zhì)譜中有機(jī)磷類農(nóng)藥常見(jiàn)的碎片離子

1.1 解析原理

在有機(jī)質(zhì)譜解析中，α斷裂反應(yīng)在電子離子（EI）質(zhì)譜中為主要的裂解反應(yīng)。α斷裂反應(yīng)是由游離基中心誘導(dǎo)產(chǎn)生的，只有奇電子離子（包括分子離子）才發(fā)生α斷裂。在奇電子離子中有一個(gè)未成對(duì)電子，該電子在離子中有其最有利的位置，形成游離基中心。未成對(duì)電子有成對(duì)的傾向，構(gòu)成了α斷裂反應(yīng)的推動(dòng)力，誘導(dǎo)了相鄰的α原子外側(cè)鍵斷裂，這與中性游離基有高度反應(yīng)活性相似。α斷裂反應(yīng)主要分為游離基中心定域于不飽和雜原子、游離基中心定域于飽和雜原子、烯丙基斷裂、環(huán)的開(kāi)裂和游離基誘導(dǎo)的重排反應(yīng)5種方式。

有機(jī)磷類農(nóng)藥在質(zhì)譜中常見(jiàn)的碎片離子由游離基中心定域于不飽和雜原子誘導(dǎo)的α斷裂反應(yīng)產(chǎn)生，即有機(jī)磷類農(nóng)藥經(jīng)EI源（70 eV）轟擊后失去一個(gè)電子而形成單電荷的離子，電荷和游離基定域于不飽和雜原子上，形成奇電子離子，用“+·”符號(hào)表示；未成對(duì)電子有成對(duì)的傾向推動(dòng)下，發(fā)生α斷裂反應(yīng)，構(gòu)成穩(wěn)定的偶電子離子，用符號(hào)“+”[14]。帶有電荷并具有特定質(zhì)量數(shù)的奇電子離子和偶電子離子通過(guò)四極桿被電子倍增器檢測(cè)，進(jìn)而記錄為碎片離子棒圖，即EI源質(zhì)譜圖，而游離基（不帶電荷但帶有不成對(duì)電子）和中性分子不被檢測(cè)[15]。反應(yīng)通式如圖1所示。

1.2 質(zhì)譜中有機(jī)磷類農(nóng)藥常見(jiàn)碎片離子的裂解歷程

有機(jī)磷類農(nóng)藥大部分含有O,O-二甲(乙)基(硫代)磷酸二酯基團(tuán)，根據(jù)甲氧基與乙氧基、P=O與P=S的區(qū)別，大致分為4種結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖2）。

這類有機(jī)磷類農(nóng)藥可發(fā)生圖1的裂解歷程。當(dāng)該組分經(jīng)EI源（70 eV）轟擊后，在P=O或P=S的雜原子O（S）上有未成鍵的孤對(duì)電子，易失去一個(gè)電子，使電荷和游離基定域于O（S）上；在游離基的誘導(dǎo)下，其單電子在離子中有成對(duì)的傾向，形成α斷裂反應(yīng)，優(yōu)先失去最大支鏈，即P-R鍵斷裂，生成偶電子離子：m/z109、m/z125、m/z137和m/z153，如圖3所示。

在圖3（c）和（d）的斷裂反應(yīng)中，母離子與子離子相差28 u，為中性分子CH2=CH2的相對(duì)分子質(zhì)量數(shù)，即在電荷的誘導(dǎo)下，γH通過(guò)六元環(huán)轉(zhuǎn)移到不飽和基團(tuán)后，隨即發(fā)生i斷裂反應(yīng)，相繼發(fā)生兩次上述裂解反應(yīng)。由于P=O與P=S的不同，可發(fā)生m/z137→m/z109→m/z81，m/z153→m/z125→m/z97的裂解歷程。在這類有機(jī)磷類農(nóng)藥的質(zhì)譜圖中，從能量學(xué)角度上講，γH重排剛好合適能量低的六元環(huán)過(guò)渡態(tài)，因此隨著m/z值減少，m/z的豐度變大（表1和表2），裂解成更加穩(wěn)定的偶電子離子，如圖4和圖5毒蟲(chóng)畏和對(duì)硫磷的質(zhì)譜圖中，列舉了含有O,O-二乙基(硫代)磷酸二酯基團(tuán)的質(zhì)譜圖[16]。P=O（S）的鍵角過(guò)大，使得甲氧基上的氫沒(méi)有足夠的空間去重排，因此圖3中（a）和（b）不能發(fā)生類似（c）和（d）的裂解歷程。

表1 有機(jī)磷類農(nóng)藥的質(zhì)譜圖中常見(jiàn)碎片離子的相對(duì)豐度表

表2 有機(jī)磷類農(nóng)藥的質(zhì)譜圖中常見(jiàn)碎片離子的相對(duì)豐度表

表1和表2列舉了部分有機(jī)磷類農(nóng)藥特征離子的相對(duì)豐度，它們含有（硫代）磷酸酯基團(tuán)，由于各自所處的化學(xué)環(huán)境不同，包括碳鏈長(zhǎng)度、鍵角、支化度和取代基原子（基團(tuán)）等，使得游離基和電荷定域中心不同，產(chǎn)生α斷裂反應(yīng)、i斷裂反應(yīng)、σ斷裂反應(yīng)、氫重排反應(yīng)及re（消除）反應(yīng)趨勢(shì)不同，發(fā)生圖1中α斷裂反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)力也不同，產(chǎn)生（硫代）磷酸酯特征離子的相對(duì)豐度也不同。

2 質(zhì)譜中有機(jī)磷類農(nóng)藥常見(jiàn)碎片離子的運(yùn)用

2.1 含有常見(jiàn)碎片離子的有機(jī)磷類農(nóng)藥

有機(jī)磷類農(nóng)藥大部分含有（硫代）磷酸酯基團(tuán)，區(qū)別在于甲氧基與乙氧基、P=O與P=S的結(jié)構(gòu)不同。這類有機(jī)磷類農(nóng)藥含有相似的結(jié)構(gòu)，也具有相同的質(zhì)譜行為。由于各自化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，即碳鏈長(zhǎng)度、鍵角、支化度以及取代基原子（或基團(tuán)）等空間因素或化學(xué)環(huán)境不同，發(fā)生α斷裂反應(yīng)（圖1）的趨勢(shì)不同，產(chǎn)生（硫代）磷酸酯特征離子的豐度也不同。

表3列舉了在質(zhì)譜圖中含有常見(jiàn)碎片離子的有機(jī)磷類農(nóng)藥。在這類有機(jī)磷類農(nóng)藥的質(zhì)譜圖中，都能找到具有（硫代）磷酸酯基團(tuán)的特征離子，其豐度值由各自所處的化學(xué)環(huán)境或空間因素決定。在各自的質(zhì)譜圖中有的特征離子為基峰，如二溴磷，m/z109；馬拉硫磷，m/z125；敵惡磷、毒死蜱和甲拌磷亞砜，m/z97；特丁硫磷砜，m/z125。

2.2 常見(jiàn)碎片離子在質(zhì)譜法定量檢測(cè)有機(jī)磷類農(nóng)藥中的運(yùn)用

利用質(zhì)譜法定量檢測(cè)有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留時(shí)，一般進(jìn)行多組分同時(shí)測(cè)定，因此選用待測(cè)組分m/z大、豐度高、干擾少的特征離子作為定量或定性離子。在有機(jī)磷類農(nóng)藥的質(zhì)譜圖中，常見(jiàn)的碎片離子表征了（硫代）磷酸酯基團(tuán)，可以作為待測(cè)組分的重要“指紋”應(yīng)用[17]。GB 23200.8—2016中采用GC-MS法定量檢測(cè)500種農(nóng)藥，有13種有機(jī)磷類農(nóng)藥采用SIM功能采集表3中的碎片離子來(lái)定性定量（詳見(jiàn)表4）。GB 23200.113—2018中采用GC-MS法定量檢測(cè)208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量中，有10種有機(jī)磷類農(nóng)藥采用表2中的碎片離子作為MRM離子對(duì)（詳見(jiàn)表5）。

表4 13種有機(jī)磷類農(nóng)藥的定量因子、定性因子及相對(duì)豐度表

表5 10種有機(jī)磷類農(nóng)藥的定量離子對(duì)、定性離子對(duì)及碰撞電壓表

2.3 在質(zhì)譜法定量檢測(cè)有機(jī)磷類農(nóng)藥中運(yùn)用常見(jiàn)的碎片離子時(shí)的注意事項(xiàng)

上文已闡述了多數(shù)有機(jī)磷類農(nóng)藥含有相同的結(jié)構(gòu)，可發(fā)生相同的質(zhì)譜行為。由于空間因素、取代基等不同化學(xué)環(huán)境的影響，有機(jī)磷類農(nóng)藥經(jīng)EI源電子轟擊后，發(fā)生裂解反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)力不同，或發(fā)生α斷裂反應(yīng)（圖1）優(yōu)勢(shì)明顯，產(chǎn)生的其他碎片離子少、豐度低。利用氣相色譜-質(zhì)譜法定量檢測(cè)或盲掃有機(jī)磷類農(nóng)藥時(shí)，一般進(jìn)行多組分分段采集；為了提高該待測(cè)物的靈敏度，將表3中的碎片離子作為特征離子或MRM離子對(duì)；為了避免同一采集時(shí)段內(nèi)各待測(cè)物具有相同的碎片離子，必須滿足下面兩點(diǎn)要求（即①和②），將有機(jī)磷類農(nóng)藥常見(jiàn)的碎片離子作為定量定性離子或MRM離子對(duì)，從而避免相互干擾。

表3 含有常見(jiàn)碎片離子的有機(jī)磷類農(nóng)藥表

①要判斷各待測(cè)組分的結(jié)構(gòu)是否相似、是否具有相同的質(zhì)譜行為。②通過(guò)有機(jī)磷類農(nóng)藥各待測(cè)組分與色譜柱的相互作用力-范德華力（色散力、誘導(dǎo)力、取向力）來(lái)判斷是否有良好的分離度（分辨率），是否滿足質(zhì)譜的SIM或MRM功能來(lái)分段采集特征離子或母-子離子對(duì)[18-19]。

例如，在定量檢測(cè)甲拌磷亞砜和甲拌磷砜過(guò)程中，由于兩者結(jié)構(gòu)相似，會(huì)發(fā)生相同的質(zhì)譜行為，其質(zhì)譜圖含有相同的碎片離子及其豐度（見(jiàn)圖6～圖8）。利用固定相為5%苯基-95%甲基硅氧烷、14%氰丙基苯基-86%甲基硅氧烷和50%苯基-50%甲基硅氧烷3種色譜柱分離時(shí)，其分離度（R）均達(dá)不到分段采集要求，為了避免采用相同的碎片離子作為特征離子或母離子，引起定量結(jié)果不準(zhǔn)或定性錯(cuò)誤，因此在GB 23200.113—2018中，甲拌磷砜的MRM離子對(duì)為153.0/97.0（10 eV）、124.9/96.9（5 eV）；甲拌磷亞砜的MRM離子對(duì)為96.9/64.9（20 eV）、199.0/142.9（10 eV）。

在同一采集時(shí)間段內(nèi)具有相同質(zhì)譜行為的待測(cè)組分選擇不同的MRM離子對(duì)進(jìn)行定性定量分析，有效避免了在定量檢測(cè)或盲掃定性時(shí)，引起的定量結(jié)果不準(zhǔn)或定性錯(cuò)誤。MRM分段采集時(shí)間關(guān)鍵依據(jù)色譜柱分離待測(cè)組分，當(dāng)色譜柱柱效下降、形成共流出物時(shí)，分段采集時(shí)間內(nèi)多個(gè)待測(cè)組分由于具有相同的質(zhì)譜行為，會(huì)形成定性定量干擾。以下將以甲拌磷亞砜、甲拌磷砜和毒死蜱為例進(jìn)行分析。

（1）以色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，5%苯基-95%甲基硅氧烷毛細(xì)管柱）作為分離柱，甲拌磷亞砜、甲拌磷砜和毒死蜱的相互分離度分別為R砜-亞砜=1.01、R毒-砜=0.16、R毒-亞砜=1.19，分離度達(dá)不到分段采集的要求，采集時(shí)間均在13.10～14.00 min。

（2）甲拌磷亞砜、甲拌磷砜和毒死蜱含有相似結(jié)構(gòu)，可發(fā)生相同的質(zhì)譜行為，因此在甲拌磷亞砜和甲拌磷砜的質(zhì)譜圖中，具有較高豐度的碎片離子在毒死蜱的質(zhì)譜圖中均可找到（圖5所示），如m/z97、m/z125、m/z125和m/z199（毒 死 蜱 含 有3個(gè)氯原子，m/z199為m/z197的同位素峰，相對(duì)比值為97.7∶100.0，與理論值95.88∶100.00相符）。

（3）甲拌磷亞砜和甲拌磷砜的碎片離子較少，表3中有機(jī)磷類農(nóng)藥常見(jiàn)的碎片離子具有非常高的豐度，為了提高GC-MS靈敏度，將其作為MRM離子對(duì)，甲拌磷亞砜，153.0/97.0（10 eV）、199.0/171.0（5 eV）、125.0/97.0（5 eV）；甲拌磷砜，153.0/97.0（10 eV）、125.0/97.0（5 eV）、199.0/143.0（10 eV）。毒死蜱含有氯原子和乙氧基結(jié)構(gòu)，分子離子失去·Cl后產(chǎn)生偶電子離子m/z314，并在電荷的誘導(dǎo)下發(fā)生氫重排和i斷裂反應(yīng)，相繼失去中性分子CH2=CH2，產(chǎn)生的特征離子m/z286和m/z 258，在毒死蜱的質(zhì)譜圖中有較高的豐度，因此將313.9/257.9（10 eV）、313.9/285.9（5 eV）、313.9/193.9（15 eV）作為MRM離子對(duì)來(lái)檢測(cè)毒死蜱。3種待測(cè)物均采用一組定量離子對(duì)和兩組定性離子對(duì)來(lái)定性定量。

在上述3個(gè)條件下，用MRM方式仍能很好地完成甲拌磷亞砜、甲拌磷砜和毒死蜱日常的定性定量檢測(cè)。但隨著色譜柱的柱流失增大、柱效下降，形成共流出物 ——甲拌磷亞砜、甲拌磷砜和毒死蜱同時(shí)出峰，就會(huì)嚴(yán)重影響定性定量結(jié)果。如圖9、10和11所示，當(dāng)樣品中檢測(cè)出毒死蜱、甲拌磷亞砜、甲拌磷砜時(shí)，通過(guò)保留時(shí)間、毒死蜱特有的MRM離子對(duì)及相對(duì)豐度可以確認(rèn)樣品中含有毒死蜱；甲拌磷亞砜的保留時(shí)間和MRM離子對(duì)吻合，但是MRM離子對(duì)（199.0/171.0）的相對(duì)豐度偏差超過(guò)允許范圍，可以定性為不是；而甲拌磷砜的保留時(shí)間、MRM離子對(duì)以及相對(duì)豐度均符合，可以定性為是，含量為0.038 mg·kg-1；但該樣品通過(guò)GC-FPD法和LC-MS法確認(rèn)只含有毒死蜱，含量為1.43 mg·kg-1。

正是由于這3種有機(jī)磷類農(nóng)藥滿足上述3個(gè)條件，隨著色譜柱的柱效下降，將有機(jī)磷類農(nóng)藥常見(jiàn)的碎片離子作為定性定量離子，定性定量錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)也隨之增大。在將有機(jī)磷類農(nóng)藥常見(jiàn)的碎片離子作為特征離子或MRM離子對(duì)時(shí)，要綜合考慮程溫、色譜柱的類型、柱效等色譜條件，通過(guò)各待測(cè)組分與色譜柱固定相之間的相互作用力（色散力、誘導(dǎo)力、取向力），達(dá)到良好的分離度并滿足分段采集的要求而不相互干擾，保證定性定量結(jié)果準(zhǔn)確。

3 結(jié)語(yǔ)

有機(jī)磷類農(nóng)藥是一類有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，這類化合物一般為磷酸酯、酰胺或硫羥衍生物。在部分有機(jī)磷類農(nóng)藥中，由于甲氧基與乙氧基、P=O與P=S的不同，經(jīng)EI源轟擊電離后，當(dāng)游離基和電荷定域于不飽和O（S）原子上時(shí)，在游離基的誘導(dǎo)下，其單電子在離子中有成對(duì)的傾向，形成α斷裂反應(yīng)，優(yōu)先失去最大支鏈，生成常見(jiàn)的碎片離子——偶電子離子，即m/z109、m/z125、m/z137和m/z153。由于各自的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，即碳鏈長(zhǎng)度、鍵角、支化度以及取代基原子（或基團(tuán)）等空間因素或化學(xué)環(huán)境不同，使得游離基和電荷定域于不同的基團(tuán)上，發(fā)生α斷裂反應(yīng)的趨勢(shì)不同，產(chǎn)生（硫代）磷酸酯特征離子的豐度也不同。

利用質(zhì)譜法的SIM或MRM模式對(duì)有機(jī)磷類農(nóng)藥進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí)，要合理利用表3中的碎片離子，防止定性定量錯(cuò)誤。①通過(guò)化學(xué)結(jié)構(gòu)式判斷，各待測(cè)組分是否具有相似的結(jié)構(gòu)，是否具有相同的質(zhì)譜行為。②判斷各待測(cè)組分通過(guò)色譜柱分離后，能否具有良好的分離度滿足SIM或MRM的分段采集模式。盡管可以在同一采集時(shí)間段內(nèi)，選擇不同的碎片離子或母子離子對(duì)來(lái)規(guī)避風(fēng)險(xiǎn)，但還要防止隨著色譜柱的柱效下降，發(fā)生共流出物現(xiàn)象，導(dǎo)致定性定量不準(zhǔn)確。在將有機(jī)磷類農(nóng)藥常見(jiàn)的碎片離子作為特征離子或MRM離子對(duì)時(shí)，要綜合考慮程溫、色譜柱的類型、柱效等色譜條件，通過(guò)各待測(cè)組分與色譜柱固定相之間的相互作用力（色散力、誘導(dǎo)力、取向力），達(dá)到良好的分離度并滿足分段采集的要求而不相互干擾，從而保證定性定量結(jié)果準(zhǔn)確。