高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定葡萄酒中4種有機(jī)磷類除草劑殘留量

郭愛靜,花中霞,張 弘,張世勇,辛 佳,王 可

(石家莊市疾病預(yù)防控制中心,石家莊市化學(xué)毒物檢測及風(fēng)險預(yù)警技術(shù)創(chuàng)新中心,石家莊 050011)

有機(jī)磷類除草劑是分子結(jié)構(gòu)中含有磷元素的一類除草劑,主要包括莎稗磷、甲基胺草磷、抑草磷和哌草磷等。有機(jī)磷類除草劑因高效、成本低而廣泛應(yīng)用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。此類農(nóng)藥具有中等或高毒性,在人體中會抑制乙酰膽堿酯酶活性,造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷而引發(fā)中毒[1-2]。鑒于其危害性,我國在國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763-2019《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定了莎稗磷在稻谷、糙米中的最大殘留量為0.1 mg·kg-1[3]。

有機(jī)磷農(nóng)藥的主要檢測方法有氣相色譜法(GC)[4-7]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[8-11]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[12-15]、液相色譜法(LC)[16-17]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[18-20]。目前,國內(nèi)外對莎稗磷或抑草磷的檢測雖有報道[21-25],但對于有機(jī)磷類除草劑在食品中殘留檢測的文獻(xiàn)相對較少。目前,葡萄酒中農(nóng)殘的檢測以殺蟲劑和殺菌劑為主,對除草劑殘留的檢測相對較少,尚未發(fā)現(xiàn)利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)檢測葡萄酒基質(zhì)中有機(jī)磷類除草劑的報道。

本工作采用乙酸乙酯作為提取劑,分散固相萃取法凈化,建立了葡萄酒中莎稗磷、甲基胺草磷、抑草磷和哌草磷等4 種有機(jī)磷類除草劑的HPLCMS/MS分析方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200-6410B型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,配電噴霧離子源;Mettler Toledo AE240型電子天平;IKA MS3 型渦旋振蕩器;Elma T-460/H 型超聲清洗器;TG16-WS 型臺式高速離心機(jī);Organomation EVAP-12型氮吹儀;Millipore Milli-Q 型超純水機(jī)。

3種有機(jī)磷類除草劑標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:1.00 g·L-1,稱取抑草磷、哌草磷和甲基胺草磷標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg,用甲醇溶解并定容至10 mL 棕色容量瓶中,此溶液保存于-20 ℃冰箱中。

莎稗磷標(biāo)準(zhǔn)溶液:10 mg·L-1。

4種有機(jī)磷類除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:移取適量的1.00 g·L-1的3種有機(jī)磷類除草劑標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液和10 mg·L-1的莎稗磷標(biāo)準(zhǔn)溶液,混合后用甲醇稀釋并定容至1.00 mg·L-1。

甲基胺草磷(Lot:SZBD350XV),純度不小于99.8%;莎稗磷(Lot:407101O)、抑草磷(Lot:41016),純度不小于98.0%;哌草磷(Lot:30416),純度不小于99.0%;乙腈、甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲酸均為色譜純;N-丙基乙二胺(PSA)、無水硫酸鎂(MgSO4)、氯化鈉(NaCl)均為分析純;試驗用水為去離子水。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 Agilent ZORBAX XDB-C18色譜柱(50 mm×4.6 mm,1.8μm);柱溫30 ℃;進(jìn)樣量3μL;流量0.3 mL·min-1;流動相A 為0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸溶液,B 為甲醇;等度洗脫,A 相與B相體積比為15∶85;運(yùn)行時間5 min。

2)質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI),正離子模式;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;干燥氣溫度350 ℃;干燥氣流量10 L·min-1;霧化氣壓力206.8 k Pa;毛細(xì)管電壓4 000 V;碰撞氣為高純氮?dú)?純度大于99.999%);各離子對駐留時間均為100 ms。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1,表中“?”為定量離子。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

稱取2.000 0 g葡萄酒樣品,置于50 mL 離心管中,加入1.00 g NaCl和12 mL的乙酸乙酯,渦旋30 s,超聲10 min,以4 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min,取出10 mL有機(jī)相轉(zhuǎn)移至盛有1.00 g PSA、0.20 g 無水MgSO4的離心管中,渦旋30 s,離心5 min,取上清液6 mL,在40 ℃下氮吹至近干,用1.0 mL 85%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇溶液復(fù)溶后,渦旋30 s,經(jīng)0.2μm 濾膜過濾,按儀器工作條件進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

在優(yōu)化的儀器工作條件下對100.0μg·L-1的4種有機(jī)磷類除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定,其色譜圖見圖1。

2.2 提取條件的選擇

2.2.1 提取劑

試驗考察了乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷及不同體積比的乙腈-乙酸乙酯混合溶液等提取體系用于葡萄酒樣品中4種有機(jī)磷類除草劑的提取時對回收率的影響。在葡萄酒基質(zhì)中添加25μg·kg-1的4種有機(jī)磷類除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照1.3節(jié)試驗方法進(jìn)行測定,不同提取劑所得回收率見圖2。

圖1 4種有機(jī)磷類除草劑的總離子流色譜圖Fig.1 TIC chromatogram of 4 organophosphorus herbicides

由圖2可知:用乙酸乙酯提取時,4種有機(jī)磷類除草劑的回收率為78.7%～84.1%,回收率最高,這可能是4種物質(zhì)在乙酸乙酯中均有較好的溶解度的原因。因此,試驗選擇乙酸乙酯作提取劑。

2.2.2 超聲提取時間

超聲可以加速提取劑在樣品中提取目標(biāo)組分的過程。試驗考察了超聲提取時間分別為5,10,15,20 min時對4種有機(jī)磷類除草劑回收率的影響,結(jié)果見圖3。

圖2 提取劑對4種有機(jī)磷類除草劑回收率的影響Fig.2 Effect of extraction solvent on the recovery of 4 organophosphorus herbicides

圖3 超聲提取時間對4種有機(jī)磷類除草劑回收率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the recovery of 4 organophosphorus herbicides

由圖3可知:回收率隨著超聲提取時間的延長先升高后降低;超聲提取時間為10 min時,4種有機(jī)磷類除草劑的回收率最好;繼續(xù)延長超聲提取時間,回收率反而下降,可能是由于超聲提取時間過長目標(biāo)物發(fā)生降解所造成的。因此,試驗選擇超聲提取時間為10 min。

2.3 凈化劑用量的選擇

試驗考察了凈化劑PSA 和無水MgSO4用量的不同對4種有機(jī)磷類除草劑回收率的影響。固定無水MgSO4用量0.20 g,分別對PSA 用量為0.20,0.40,0.75,1.00,1.20 g時4種有機(jī)磷類除草劑的回收率進(jìn)行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn):隨著PSA 用量的增加回收率先升高后降低;PSA 用量為1.00 g時,回收率最好,為81.5%～96.7%。這可能是由于PSA 能有效吸附葡萄酒基質(zhì)中的有機(jī)酸、糖類和色素等雜質(zhì),故隨著PSA 用量增加回收率提高,但PSA 過量也會吸附待測組分,反而回收率降低。

固定PSA 用量為1.00 g,分別對無水MgSO4用量為0.10,0.20,0.40,0.75,1.00 g時4種有機(jī)磷類除草劑的回收率進(jìn)行比較。結(jié)果表明:無水MgSO4用量為0.20 g時,回收率最好,為83.4%～95.8%。這是因為水在乙酸乙酯中溶解度很低,加入一定量的無水MgSO4會除去乙酸乙酯層的水分,但無水MgSO4過量會吸附待測組分,反而導(dǎo)致回收率降低。因此,試驗最終選擇用1.00 g PSA、0.20 g無水MgSO4對樣品進(jìn)行凈化。

2.4 流動相的選擇

使用100.0μg·L-14種有機(jī)磷類除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣,分別考察了乙腈-0.1%甲酸和甲醇-0.1%甲酸體系為流動相時對4種有機(jī)磷類除草劑峰形和響應(yīng)值的影響。結(jié)果表明:當(dāng)流動相為乙腈-0.1%甲酸溶液體系時,甲基胺草磷響應(yīng)值較低;當(dāng)流動相為甲醇-0.1%甲酸溶液體系時,整體響應(yīng)值都有明顯地提高,因此,選擇甲醇-0.1%甲酸溶液體系作為試驗的色譜流動相。試驗進(jìn)一步優(yōu)化了兩相比例,發(fā)現(xiàn)體積比為85∶15的甲醇和0.1%甲酸溶液作流動相、流量為0.3 mL·min-1時,4種有機(jī)磷類除草劑的色譜峰峰形和分離度均較好。試驗采用體積比為85∶15 的甲醇和0.1%甲酸溶液等度洗脫。

2.5 質(zhì)譜條件的選擇

4種有機(jī)磷類除草劑的分子結(jié)構(gòu)中均含有N、O等原子,均易結(jié)合H＋,極性較強(qiáng)。因此,選擇電噴霧電源子正離子模式(ESI＋)進(jìn)行檢測。以100.0μg·L-14種有機(jī)磷類除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣,進(jìn)行一級全掃描篩選母離子,發(fā)現(xiàn)各除草劑的[M＋H]＋峰均響應(yīng)較強(qiáng),確定為母離子;通過選擇離子監(jiān)測(SIM)優(yōu)化碎裂電壓,使其母離子響應(yīng)達(dá)到最佳;用產(chǎn)物離子掃描確定兩個響應(yīng)強(qiáng)、干擾小的子離子,同時優(yōu)化碰撞能量,使其子離子獲得最佳響應(yīng)。每個除草劑的兩個子離子中響應(yīng)較高的為定量離子,最終確定質(zhì)譜條件,具體參數(shù)見表1。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)

分別用85%甲醇溶液和葡萄酒基質(zhì)空白提取溶液配制兩組質(zhì)量濃度均為10.0,20.0,50.0,100.0μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,按照儀器工作條件進(jìn)行測定。比較同一質(zhì)量濃度下在甲醇和基質(zhì)溶液中同一被測組分的峰面積,計算基質(zhì)效應(yīng)(ME)。ME＝B/A×100%(B為空白樣品基質(zhì)中添加某一質(zhì)量濃度待測物按照儀器條件測定的響應(yīng)值,A為純?nèi)軇┲刑砑油毁|(zhì)量濃度待測物相同儀器條件下測定的響應(yīng)值[26]。ME 值為80.0%～120.0%時,表明基質(zhì)效應(yīng)較小;ME 值低于80.0%或高于120.0%時,表明有較強(qiáng)的基質(zhì)抑制或增強(qiáng)作用[27]。試驗結(jié)果表明:哌草磷的 ME 值在96.4%～104.8%之間,沒有明顯的基質(zhì)效應(yīng);其他3種有機(jī)磷類除草劑的ME 值為53.6%～73.5%,有較強(qiáng)地基質(zhì)抑制作用。因此,試驗采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(工作曲線),以減少基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.7 工作曲線與檢出限

在葡萄酒基質(zhì)空白樣品溶液中添加4種有機(jī)磷類除草劑標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制成濃度均為1.0,2.0,5.0,10.0,20.0,50.0,100.0,200.0μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,按儀器工作條件進(jìn)行測定。以各化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。

分別以3倍信噪比和10倍信噪比計算檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N)。4種化合物的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和測定下限見表2。

表2 線性參數(shù)、檢出限及測定下限Tab.2 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

由表2可知:4種有機(jī)磷類除草劑的質(zhì)量濃度均在1.0～200.0μg·L-1內(nèi)與對應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)在0.999 0以上。4種有機(jī)磷類除草劑的檢出限為0.01～0.04μg·kg-1,測定下限為0.03～0.13μg·kg-1。

2.8 精密度和回收試驗

稱取空白試樣2.000 0 g,在5,20,50μg·kg-1等3個濃度水平下進(jìn)行加標(biāo)回收試驗,按試驗方法進(jìn)行測定,每個加標(biāo)水平平行測定5次,計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表3。

表3 精密度和回收試驗結(jié)果(n＝5)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

由表3可知:4種有機(jī)磷類除草劑的回收率為69.3%～99.2%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.3%～8.1%,表明該方法的準(zhǔn)確度高、精密度較好。

2.9 樣品分析

按試驗方法對10份葡萄酒樣品進(jìn)行測定,其中4份檢出抑草磷,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.53～0.76μg·kg-1。雖然目前我國還沒有其限量標(biāo)準(zhǔn),但結(jié)果表明葡萄酒中存在抑草磷的殘留污染。相關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)管,對其危害進(jìn)行評估,加快制定葡萄酒中抑草磷的限量標(biāo)準(zhǔn)。

本工作建立了同時測定葡萄酒中4種有機(jī)磷類除草劑的分散固相萃取-HPLC-MS/MS分析方法,分別對提取劑種類、超聲提取時間、凈化劑用量等前處理條件進(jìn)行了優(yōu)化。方法操作簡單、靈敏度高、準(zhǔn)確度好,適用于葡萄酒中4種有機(jī)磷類除草劑殘留量的測定。