高效液相色譜法測(cè)定糧油食品中黃曲霉毒素B1含量的不確定度分析

姚 唱，王伊喬，陳 潔

北京市糧油食品檢驗(yàn)所 (北京 100144)

黃曲霉(AFT)是毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)，世界衛(wèi)生組織癌癥研究機(jī)構(gòu)1993年將黃曲霉劃定為一類天然存在的致癌物，其衍生物有約20種，其中以黃曲霉毒素B1的毒性最大，致癌性最強(qiáng)[1-2]。黃曲霉主要污染原糧、油脂及其制品[3]，如玉米、大米、花生、花生油等。國內(nèi)食品檢測(cè)中以黃曲霉毒素B1作為污染指標(biāo)，可通過薄層層析法和高效液相色譜法檢測(cè)[4]。目前，真菌毒素在社會(huì)上受到了廣泛關(guān)注，真菌毒素的檢測(cè)(例如黃曲霉、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素等)已成為糧食作物常檢的項(xiàng)目之一。

測(cè)量不確定度是對(duì)于誤差分析中的最新理解和闡述，是評(píng)定實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果質(zhì)量的指標(biāo)，同時(shí)也是該結(jié)果可信賴程度的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。CNAL發(fā)布專項(xiàng)文件，指出實(shí)驗(yàn)室應(yīng)為不確定度的測(cè)量構(gòu)建配套的評(píng)定程序，而且對(duì)于測(cè)定獲得數(shù)據(jù)開展評(píng)定[5]。在本文實(shí)驗(yàn)中，依據(jù)JJF 1059.1—2012的要求，運(yùn)用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定的過程中，確認(rèn)不確定度的核心影響因素，并對(duì)此展開分析，盡可能保障檢測(cè)數(shù)據(jù)的精準(zhǔn)與真實(shí)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

乙腈，色譜純，美國賽默飛公司；甲醇，色譜純，美國賽默飛公司；黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品，108.3 ng/mL，1 mL/支，德國默克公司；超純水等。

分析天平(分度值0.01 g)，奧豪斯儀器公司；N-EVAP 111型氮吹儀，美國Orgnamation公司；MS 3型渦旋振蕩器，德國艾卡公司；高效液相色譜儀，日本島津公司生產(chǎn)，檢測(cè)器型號(hào)為RF-20A。

1.2 方法

1.2.1樣品前處理

參照GB 5009.22—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定》第三法高效液相色譜-柱后衍生法中規(guī)定的前處理方法。

1.2.2色譜條件

色譜柱，ODS-SP C18(柱長150 mm，內(nèi)徑4.6 mm，填料粒徑5 μm)；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量50 μL；柱溫40 ℃；光化學(xué)柱后衍生器；檢測(cè)器波長，激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm；流動(dòng)相，乙腈、甲醇、水的體積比為16∶16∶68。

1.2.3數(shù)學(xué)模型

式中：X為樣品中黃曲霉毒素B1含量的數(shù)值，μg/kg；A為進(jìn)樣溶液中黃曲霉毒素B1含量的濃度，ng/mL；V為定容體積，mL；M為樣品質(zhì)量的數(shù)值，g；f為稀釋倍數(shù)。

在此次研究過程中，綜合JJF 1059.1—2012所介紹的具體操作思路，總結(jié)此次分析的不確定度，主要有標(biāo)準(zhǔn)溶液、稱量等多個(gè)來源，本試驗(yàn)對(duì)不同來源進(jìn)行評(píng)定與分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不確定度分量的評(píng)定

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度

2.1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度

在此次實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)際采購的標(biāo)準(zhǔn)溶液偏差數(shù)據(jù)是±1.51 ng/mL，濃度數(shù)據(jù)是108.3 ng/mL，包含因子k=3，結(jié)合前述數(shù)據(jù)可得出其相對(duì)不確定度為：

2.1.1.2 玻璃量具引入的不確定度

由玻璃量具引入的不確定度有兩類：一類是量具的生產(chǎn)校準(zhǔn)過程中所引入的；另一類是由于量具的使用溫度與標(biāo)準(zhǔn)溫度不一致，導(dǎo)致液體膨脹而引入的。

表1 玻璃量具的不確定度

由玻璃量具引入的相對(duì)不確定度為：

2.1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線校正引入的不確定度

將配制好的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)曲線上機(jī)測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果

根據(jù)表2擬合得出黃曲霉毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線為：y=99 950.859 6x+2 696.983 4，線性相關(guān)系數(shù)r為0.999 7，式中：y表示峰面積；x表示濃度，ng/mL。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，分析結(jié)果見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)分析結(jié)果

由此計(jì)算得出：

2.1.1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入不確定度的合成

結(jié)合前文所介紹的三類不確定分量，可計(jì)算出由標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度為：

2.1.2樣品稱量引入的不確定度

在進(jìn)行稱量的場(chǎng)景中，產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度(操作中具體的樣品量為5.00 g)為：

2.1.3體積引入的不確定度

由體積引入的不確定度主要包括稀釋因子和最終定容體積。稀釋因子產(chǎn)生的不確定度是由實(shí)驗(yàn)過程中所涉及的一系列稀釋過程所產(chǎn)生的，而過程中所有的稀釋步驟都需搖勻，所以液體分配不均產(chǎn)生的不確定度可以忽略不計(jì)。因?yàn)樵谶M(jìn)行稀釋操作的過程中，要求運(yùn)用多類規(guī)格的量具，故稀釋產(chǎn)生的不確定度主要是由玻璃量具引入的；最后定容體積所產(chǎn)生的影響，即多種批次定容標(biāo)線的劃定與制作工藝的區(qū)別所產(chǎn)生的影響。按照對(duì)玻璃量具引入的不確定度進(jìn)行評(píng)定，見表4。

由玻璃量具引入的相對(duì)不確定度為：

2.1.4樣品提取過程引入的不確定度

在進(jìn)行樣品提取的過程中，主要有相關(guān)樣品的稱量、均質(zhì)等多個(gè)程序，其各個(gè)操作流程都會(huì)帶來影響，對(duì)于該類不確定度，可依靠測(cè)試整個(gè)實(shí)驗(yàn)場(chǎng)景的具體回收率參數(shù)開展針對(duì)性的評(píng)定工作，最終所獲得的結(jié)果詳見下表5所述。

表4 玻璃量具的不確定度

表5 實(shí)驗(yàn)回收率測(cè)定結(jié)果

由表5中數(shù)據(jù)計(jì)算得出不確定度為：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.1.5測(cè)量的重復(fù)性引入的不確定度

對(duì)同一樣品進(jìn)行6次平行測(cè)定，結(jié)果見表6。

表6 樣品的測(cè)定結(jié)果

結(jié)合表6所述的信息，來源于測(cè)量重復(fù)性的不確定度數(shù)據(jù)為：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成及擴(kuò)展

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成

結(jié)合所獲得不確定度分量的數(shù)據(jù)，進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的匯總，最終所獲得的數(shù)據(jù)詳見表7所述。

表7 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量

根據(jù)表7中數(shù)據(jù)，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2擴(kuò)展不確定度的評(píng)定

按照慣例，測(cè)量結(jié)果的擴(kuò)展不確定度包含因子k=2，計(jì)算可得相對(duì)擴(kuò)展不確定度U=urel(c)×k=0.028 23×2=0.056 46。

樣品中黃曲霉毒素B1的最佳估計(jì)值為1.064 287 μg/kg，因此其擴(kuò)展不確定度為U=1.064 287 μg/kg×0.056 46≈0.060 1 μg/kg。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)不確定度的主要影響因素是測(cè)量的重復(fù)性，其次是標(biāo)準(zhǔn)曲線校正以及樣品處理過程引起的，而由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和樣品稱量等引起的不確定度很小，可忽略不計(jì)。 為減小不確定度，樣品提取過程要更規(guī)范，以減少黃曲霉毒素B1在前處理過程中的損失。 樣品每次稱量前都要充分混合均勻，提取液現(xiàn)用現(xiàn)配，樣液經(jīng)免疫親和柱凈化時(shí)要嚴(yán)格控制洗脫流速，其次要注意對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行低溫密封保存，同時(shí)配制、定容過程要選用更高精度的量具，并增加平行實(shí)驗(yàn)次數(shù)，通過這些操作可以進(jìn)一步減小不確定度。