跨膜蛋白48 對宮頸癌細胞增殖、侵襲、遷移及Yes 相關蛋白通路影響研究

陳雪齡，符浮，符芳慧，張敏，郭彩霞

1.萬寧市人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科，海南 萬寧 571500 ；2.海南省第三人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科，海南 三亞 572000

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐漸升高之勢［1］。大多數(shù)宮頸癌患者就診時已屬中晚期，失去根治手術機會，且對放化療具有抵抗性［2］。宮頸癌具有較強的侵襲性，容易浸潤癌旁組織并發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，這是影響患者生存預后的主要原因［3］。尋找宮頸癌的生物學標志物對其臨床診治有重要意義?？缒さ鞍祝╰ransmembrane protein，TMEM）與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關［4］。TMEM 48是TMEM 家族的重要成員之一，TMEM 48 對細胞核膜的完整性、核質(zhì)運輸和基因穩(wěn)定起重要作用［5］。TMEM 48 與腫瘤的關系及機制尚未闡明，需要深入分析。Yes 相關蛋白（Yes-associated protein，YAP）是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，與腫瘤密切相關，在宮頸組織和細胞中高度表達，特別是晚期宮頸癌［6］。YAP激活后可促進宮頸癌細胞的增殖、侵襲和遷移［7］。本研究分析沉默TMEM 48 對宮頸癌HeLa 和CaSki細胞增殖、侵襲、遷移及YAP 信號通路的影響，旨在尋找宮頸癌潛在的治療靶點。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器 正常宮頸上皮細胞（H8）和宮頸癌細胞系（SiHa、HeLa、CaSki、C33A）均購自中國科學院上海細胞庫。細胞培養(yǎng)箱（上海漢尼生物細胞技術有限公司），ABI7500 型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀（美國賽默飛公司），ChemiDoc XRS 型化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)（美國Bio-rad 公司），CX33 型光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、二喹啉甲酸蛋白定量檢測試劑盒、凝膠快速制備試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×SYBR Green PCR Mastermix 試劑盒購自上海西格生物科技有限公司。細胞核蛋白和細胞質(zhì)蛋白提取試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司。Transwell 小室和CCK-8 試劑盒購自上海夏夷實業(yè)有限公司。LipoFiterTM 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自上海漢恒生物科技有限公司。si-TMEM 48 序列正義鏈：5-AUUAGAUCCAUAGUCAUACGG-3′，反義鏈：5′-GUAUGACUAUGGAUCUAAUUC-3′；si-control序列正義鏈：5′-GAUGAUUCCUUCAGGGUUA-3′，反義鏈：5′ -GCACAAACCCAGGCUAUUU-3′，均由上海吉馬制藥有限公司合成并提供。pYAP、YAP和TMEM 48 抗體均購于美國Sigma 公司。選取自2020 年6 月至2021 年6 月行手術切除治療的35例宮頸癌患者的宮頸癌組織及其配對的癌旁組織（距離癌組織≥5 cm）?；颊吣挲g范圍47～69 歲，年齡（49.4±7.8）歲；術前均未接受放療或化療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 實時熒光定量PCR 法檢測組織和細胞中TMEM 48 基因表達 采用TRIzol 法提取組織和細胞中的總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，用實時熒光定量試劑盒進行PCR 擴增。反應條件：95℃ 30 min；94℃ 15 s、55℃ 30 s、70℃ 30 s，共40 個循環(huán)。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，用2-△△Ct法計算TMEM 48 相對表達量。

1.2.2 蛋白免疫印跡法檢測組織和細胞中TMEM 48 蛋白表達 RAPI 裂解液提取組織和細胞中的總蛋白，用二喹啉甲酸試劑盒檢測蛋白濃度，10% SDSPAGE 電泳分離蛋白，用半干轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上。隨后用5 % 脫脂奶粉封閉2 h，加入TMEM 48（1∶500）、磷酸甘油醛脫氫酶內(nèi)參照（1∶500）抗體4℃過夜孵育，次日除去抗體，用緩沖液洗滌3 次后加入二抗。ECL 發(fā)光儀進行蛋白成像，Image J 軟件分析灰度值。

1.2.3 沉默TMEM 48 對宮頸癌HeLa 和CaSki 細胞增殖、侵襲、遷移及YAP 信號通路的影響 細胞轉(zhuǎn)染。以2×105個/孔密度將HeLa 或CaSki 細胞接種于6 孔板中。轉(zhuǎn)染前用磷酸緩沖鹽溶液洗滌細胞2 次，加入1.8 ml 無血清培養(yǎng)基。分別用100 μl 無血清培養(yǎng)基稀釋10 μl LipoFiter 和10 ml TMEM 48 si-RNA（或者si-control），根據(jù)轉(zhuǎn)染序列將細胞分為對照組和沉默組，靜置5 min 后混勻。轉(zhuǎn)染24 h 后進行后續(xù)實驗。CCK8 法檢測細胞增殖。轉(zhuǎn)染后用胰蛋白酶消化細胞，按照10 000 個/孔密度將細胞接種于6 孔板中，用CCK-8 試劑盒檢測細胞活性，在培養(yǎng)24、48、72 h，向每個培養(yǎng)孔中添加10 μl CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。用酶標儀在490 nm 波長處讀取吸光度，以反映細胞增殖活力［8］。Transwell 小室實驗檢測細胞侵襲和遷移。將含有50 000 個細胞的200 μl 無血清培養(yǎng)基滴入Transwell 小室的上室，此為細胞遷移實驗。進行侵襲實驗時，將50 000 個細胞加入上室，涂上無血清培養(yǎng)基稀釋的Matrigel。分別將800 μl 含有10 % 胎牛血清的培養(yǎng)基加入下室。37℃條件下進行孵育，將膜底表面的瘤細胞用100 % 甲醇固定，隨后用0.1 % 結(jié)晶紫染色液進行染色，30 min 后在光學顯微鏡下進行計數(shù)［9］。實時熒光定量PCR 法檢測TMEM 48 基因表達。用試劑盒提取細胞總蛋白、細胞核、細胞質(zhì)蛋白，用蛋白免疫印跡法檢測TMEM 48、YAP、pYAP 蛋白表達水平，檢測細胞核和細胞質(zhì)中YAP 蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t 檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TMEM 48 在宮頸癌細胞和組織中的表達 與癌旁組織比較，癌組織中TMEM 48 基因和蛋白表達水平均較高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與正常宮頸上皮細胞H8 比較，宮頸癌SiHa、HeLa、CaSki、C33A 細胞系的TMEM 48 基因和蛋白表達水平較高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖1、表1～2。

表1 TMEM 48 在宮頸癌組織中的表達（）

表1 TMEM 48 在宮頸癌組織中的表達（）

圖1 蛋白免疫印跡法檢測細胞和組織中TMEM 48蛋白表達注（N：癌旁組織；T：癌組織）

2.2 沉默TMEM 48 對HeLa 和CaSki 細胞增殖、侵襲的影響 HeLa 和CaSki 細胞中，對照組CCK-8 實驗72 h 時的細胞增殖活性、侵襲細胞數(shù)、遷移細胞數(shù)均低于沉默組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖2、表3～4。

表2 TMEM 48 在宮頸癌細胞中的表達（）

表2 TMEM 48 在宮頸癌細胞中的表達（）

注：與H8細胞比較，①P<0.05

表3 沉默TMEM 48 對HeLa 細胞增殖、侵襲的影響（）

表3 沉默TMEM 48 對HeLa 細胞增殖、侵襲的影響（）

圖2 Transwell法檢測細胞侵襲和遷移

表4 沉默TMEM 48 對CaSki 細胞增殖、侵襲的影響（）

表4 沉默TMEM 48 對CaSki 細胞增殖、侵襲的影響（）

2.3 沉默TMEM 48 對YAP 信號通路的影響 沉默組TMEM 48 基因和蛋白相對表達量均明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖3、表5～6。與對照組比較，沉默組pYAP 蛋白表達水平、pYAP/總YAP、YAP 蛋白的核質(zhì)比均較低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。提示沉默組pYAP 會抑制YAP 的轉(zhuǎn)錄活性。見圖4、表7～8。

圖3 蛋白免疫印跡法檢測TMEM 48蛋白表達水平變化

圖4 蛋白免疫印跡法檢測YAP信號通路相關蛋白表達水平

表5 HeLa細胞TMEM 48基因和蛋白表達水平的變化（）

表5 HeLa細胞TMEM 48基因和蛋白表達水平的變化（）

表6 CaSki細胞TMEM 48基因和蛋白表達水平的變化（）

表6 CaSki細胞TMEM 48基因和蛋白表達水平的變化（）

表7 HeLa細胞YAP信號通路相關蛋白表達水平變化（）

表7 HeLa細胞YAP信號通路相關蛋白表達水平變化（）

表8 CaSki細胞YAP信號通路相關蛋白表達水平變化（）

表8 CaSki細胞YAP信號通路相關蛋白表達水平變化（）

3 討論

分析宮頸癌的發(fā)病機制并尋找潛在的分子生物學標志物對其臨床診治有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌細胞和組織中TMEM 48 表達水平較高，沉默TMEM 48 表達可以抑制宮頸癌細胞的增殖、侵襲和遷移。

膜蛋白根據(jù)其與生物膜的結(jié)合方式分為TMEM、外周膜蛋白和脂錨定膜蛋白，TMEM 占大多數(shù)，包含至少一個跨膜片段［10］。多研究發(fā)現(xiàn)TMEM（如TMEM 45、TMEM 48、TMEM 158、TMEM 206 等）與腫瘤密切相關，發(fā)揮促瘤作用［4，11-12］。TMEM 48 有6 個跨膜片段，是一種核孔蛋白，對細胞核的完整性、核質(zhì)運輸、基因穩(wěn)定性起著重要作用［13］。因為核孔蛋白在多種腫瘤中表達異常，通過染色體異位等方式參與腫瘤進展［14-15］，所以推測TMEM 48 與腫瘤有關。有研究發(fā)現(xiàn)，TMEM 48 在非小細胞肺癌組織和細胞中表達水平升高，抑制其表達可以促進癌細胞凋亡［5］。TMEM 48 與宮頸癌的關系既往少有報道。本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織比較，癌組織中TMEM 48基因和蛋白表達水平均較高。與正常宮頸上皮細胞H8 比較，宮頸癌SiHa、HeLa、CaSki、C33A 細胞系的TMEM 48 基因和蛋白表達水平較高。沉默TMEM 48 基因后可以抑制HeLa 和CaSki 細胞的增殖、侵襲和遷移。以上說明TMEM 48 可能參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

YAP 是一種細胞內(nèi)連接蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)器官發(fā)育、血管生成、組織再生和干細胞自我更新等方面起著重要作用［16］。YAP 以磷酸化形式存在于細胞質(zhì)，當YAP 信號通路活化后會導致YAP 磷酸化，誘導YAP 入核，參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控［17］。YAP入核后參與多種癌基因的調(diào)控，影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關蛋白、凋亡相關蛋白等的表達，從而影響腫瘤進展［18］。作為腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要機制，YAP 信號通路的激活參與多種腫瘤的增殖、侵襲、遷移等惡性生物學行為，包括宮頸癌［7，19］。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默TMEM 48 后pYAP 蛋白表達水平、pYAP/總YAP、YAP 蛋白的核質(zhì)比均降低，提示沉默組pYAP 會抑制YAP 的轉(zhuǎn)錄活性。

綜上所述，宮頸癌細胞和組織中TMEM 48 表達水平較高，沉默TMEM 48 表達可以抑制宮頸癌細胞的增殖、侵襲和遷移，說明TMEM 48 可能參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。本研究也存在一些局限性，例如未分析凋亡和細胞周期等癌細胞生物學行為；未檢測YAP 下游分子的變化；未對宮頸癌患者進行隨訪，TMEM 48 與預后的關系需要未來進行進一步分析。