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    糖化血紅蛋白A1 亞基在肺癌發(fā)生過程中的作用

    2022-08-13 15:01:30陶芃作夏全松馮志啟
    關(guān)鍵詞:腫瘤發(fā)生糖化肺癌

    陶芃作 夏全松 馮志啟 張 曦 楊 麗

    昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗科 云南 昆明 650118

    血紅蛋白(hemoglobin,Hb)是紅細(xì)胞內(nèi)運輸氧的特殊蛋白質(zhì),由珠蛋白和血紅素組成,其珠蛋白部分是由兩對不同的珠蛋白鏈(α 鏈和β 鏈)組成的四聚體[1]。糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin,GHb)是血紅蛋白與血漿中的糖類相結(jié)合的產(chǎn)物[2],通過緩慢、持續(xù)且不可逆的糖化反應(yīng)形成。糖化血紅蛋白在糖尿病患者體內(nèi)含量,取決于患者的血糖濃度以及血糖與血紅蛋白的作用時間,而與患者的抽血時間、空腹與否、以及是否使用胰島素等外界因素?zé)o關(guān)[3]。因此,糖化血紅蛋白指標(biāo)可有效地反映糖尿病患者過去1~2 個月內(nèi)血糖控制的情況。糖化血紅蛋白由HbA1a、HbA1b、HbA1c 三個亞基組成,其中HbA1c 約占70%,且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,因此被用作糖尿病控制的監(jiān)測指標(biāo)[4,5]。

    肺癌是常見八大惡性腫瘤之一[6],發(fā)病率逐年上升,臨床表現(xiàn)復(fù)雜。由于肺癌早期很難被患者察覺,因此在診斷時,大部分患者已失去手術(shù)機(jī)會,預(yù)后差,死亡率高[7,8]。因此,通過科學(xué)研究在體外模擬人類肺癌病因、發(fā)病機(jī)制、發(fā)展過程,從源頭來研究肺癌的發(fā)生就顯得尤為重要[9]。

    有研究發(fā)現(xiàn)許多癌癥患者有糖尿病或糖耐量異常,血糖呈現(xiàn)異常升高,提示血糖可能與癌癥存在一定的聯(lián)系[10]。有研究認(rèn)為長期的高血糖可作為營養(yǎng)基為惡性腫瘤細(xì)胞提供能量[11],同時可誘導(dǎo)活性氧簇蓄積并導(dǎo)致氧化應(yīng)激,從而對DNA 造成氧化損傷,當(dāng)損傷程度超出自我修復(fù)能力時引起基因突變,使細(xì)胞無限增殖,即可誘發(fā)細(xì)胞癌變[12,13],為了研究血糖異常在肺癌發(fā)生中的關(guān)系,我們進(jìn)行了下列研究。

    1 材料與方法

    1.1 材料胎牛血清購自杭州天杭生物技術(shù)有限公司;DMEM 培養(yǎng)基購自HyClone 公司;胰蛋白酶、雙抗,PBS 購自杭州吉諾生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司。CO2恒溫培養(yǎng)箱(SCO6WE)購自上海桂寧實驗器材有限公司。CCK?8 檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Western Blot 相關(guān)試劑購自美國ASPEN 公司;Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染試劑盒購自上海恪敏生物科技有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌細(xì)胞A549 細(xì)胞系購自ATCC 細(xì)胞庫,使用DMEM+10%FBS+1%P/S 培養(yǎng)基,并于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞生長到80%~90%匯合度時進(jìn)行傳代,1∶3 傳代,2~3 d 傳代一次;人正常胚肺成纖維細(xì)胞MRC?5 細(xì) 胞 系 購 自ATCC,使 用DMEM+10%FBS+1% P/S 培養(yǎng)基,并于5% CO2、37 ℃恒溫箱中培養(yǎng),待細(xì)胞生長到80%~90%匯合度時進(jìn)行傳代,1∶3 傳代,2~3 d 傳代一次。

    1.2.2 動物模型 BALB/c 小鼠誘導(dǎo)肺癌異種移植模型:BALB/c 小鼠分為對照組和肺癌模型組,每組20 只,肺癌組采用在腹股溝處皮下注射1×105個A549 細(xì)胞對BALB/c 小鼠進(jìn)行處理,形成肺癌異種移植模型,對照組注射同等劑量的MRC5 細(xì)胞;分組:BALB/c+MRC?5、BALB/c+A549。肺癌異種移植小鼠中過表達(dá)HbA1c 后給予高糖飲食:8 周齡BALB/c 小鼠,每組10 只,實驗組注射0.2 mL 濃度為5×1011/mL 包裝有oe?HbA1c 載體的重組腺病毒(將能表達(dá)oe?HbA1c 的過表達(dá)載體與腺病毒的病毒衣殼一起包裝,對照組包裝的載體為oe?NC),注射病毒24 h 后給予小鼠高糖飲食(HSD),對照組給予正常飲食(NC)。分組:oe?NC、oe?NC+HSD、oe?HbA1c+NC、oe?HbA1c+HSD。本研究中所用實驗小鼠在實驗結(jié)束時通過注射40 mg/kg 的戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉處理后解剖取組織,組織樣保存于-80 ℃冰箱中留待后續(xù)實驗。本實驗已得到昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院動物倫理會的批準(zhǔn),所有實驗動物的處理嚴(yán)格遵守動物倫理學(xué)規(guī)定。

    1.2.3 CCK?8 檢測細(xì)胞活性 將對數(shù)生長期細(xì)胞用胰蛋白酶消化后,按照CCK?8 檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)說明步驟進(jìn)行處理,設(shè)立實驗組、對照組,使用酶標(biāo)儀測定450 nm 吸光度(A)值,按公式:細(xì)胞存活率(%)=實驗組A值/對照組A值×100%,計算細(xì)胞的存活率。

    1.2.4 實時熒光定量PCR(qRT ?PCR) 采用

    TRIzol(Invitrogen,Carlsbad,5CA,USA)試劑盒根據(jù)說明書步驟嚴(yán)格操作提取組織或細(xì)胞總RNA,并測定RNA 濃度。本研究所用引物由大連Takara 公司合成(表1)。非miRNA 反轉(zhuǎn)錄按照cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(K1622,北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司,北京,中國)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作,設(shè)定反應(yīng)條件為:42 ℃,30~50 min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng));85 ℃,5 s(反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng))。反轉(zhuǎn)錄的cDNA 稀釋至50 ng/μL,后續(xù)熒光定量PCR 備用。每次加2 μL,反應(yīng)擴(kuò)增體系為25 μL。放入熒光定量PCR 儀(ViiA 7,中山大學(xué)達(dá)安基因有限公司,中國)中進(jìn)行檢測。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性4 min;95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸20 s,共39 個循環(huán)。以1 μg 總RNA 反轉(zhuǎn)所得的全部cDNA 為模板,以β?actin 作為內(nèi)參采用相對定量法(2-△△Ct法)計算目的基因的相對轉(zhuǎn)錄水平:△△Ct=△Ct 實驗組-△Ct 對照組,△Ct=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參),每次實驗重復(fù)3 次。

    表1 RT-qRCR 引物序列

    1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將生長良好的A549 細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基接種到6 孔板中。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到60%~80% 時 按 照Lipofectamine2000(Invitrogen,Carls?bad,CA,USA)試劑盒說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒(oe?NC、oe?HbA1)由廣州銳博生物科技有限公司構(gòu)建。

    1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot) 取各組細(xì)胞,利 用RIPA 裂 解 液(Beyotime Biotechnology,Shanghai,China)提 取 總 蛋 白,采 用BCA 試 劑 盒(20201ES76,翊圣生物科技有限公司,上海)測定蛋白濃度。根據(jù)不同濃度進(jìn)行定量,聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后采用濕轉(zhuǎn)方法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜(Millipore,Darmstadt,Germany)上,5% BSA 室溫下封閉1 h。加入HbA1 抗體(1∶5 000 稀釋),HbA1c 抗體(1∶2 000 稀釋),4 ℃孵育過夜。TBST洗膜5 min×3 次,加入HRP 標(biāo)記的二抗稀釋液室溫下1 h。TBST 洗膜10 min×3 次,加入顯影液,顯影。 ImageJ 1.48u 軟 件(National Institutes of Health)進(jìn)行蛋白定量分析,以各蛋白的灰度值與內(nèi)參β?actin 的灰度比值進(jìn)行蛋白定量分析。每次實驗重復(fù)3 次。

    1.2.7 Transwell 小室實驗檢測細(xì)胞遷移率 取高密度和低密度培養(yǎng)的A549 細(xì)胞,分別制成單細(xì)胞懸液(2×108個/L);取細(xì)胞懸液200 μL 加入Tran?swell 小室,下室為全培養(yǎng)基600 μL;培養(yǎng)18 h 后,取出Transwell 小室,擦除室內(nèi)殘余細(xì)胞,甲醇固定膜外細(xì)胞,吉姆薩染色,倒置顯微鏡下觀察并拍照,每孔取5 個視野進(jìn)行統(tǒng)計。遷移率=測試組跨膜細(xì)胞/對照組跨膜細(xì)胞×100%,實驗重復(fù)3 次。

    1.3 數(shù)據(jù)分析所有實驗重復(fù)3 次以獲得平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。計量資料采用±s描述,并使用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析,使用GraphPad 8.0 軟件作圖。以P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 肺癌小鼠模型中HbA1c 表達(dá)量顯著上調(diào)為了研究糖化血紅蛋白與肺癌腫瘤發(fā)生的關(guān)系,我們采取向裸鼠(BALB/c 小鼠)皮下注射肺癌細(xì)胞的方式構(gòu)建肺癌小鼠模型。實驗組為每只小鼠注射1×105個A549 細(xì)胞,對照組注射同等劑量的MRC5 細(xì)胞。8 周后觀察到注射A549 細(xì)胞的小鼠背部出現(xiàn)了顯著的腫瘤塊,而對照組小鼠未出現(xiàn)腫瘤(圖1A),表明肺癌小鼠造模成功。斷尾取血獲得小鼠靜脈血,4 ℃,3 000g離心15 min 收集血清,BCA 定量測定血清中蛋白質(zhì)濃度,以麗春紅染色結(jié)果作為內(nèi)參,通過Western Blot 實驗檢測血清中HbA1 和HbA1c 的含量,結(jié)果表明注射A549 細(xì)胞誘導(dǎo)肺癌的小鼠較對照組小鼠HbA1 的蛋白水平無顯著差異(圖1B),但HbA1c 的蛋白水平顯著上調(diào)(圖1C)。提示HbA1c 與肺癌的腫瘤發(fā)生有關(guān)。

    圖1 肺癌小鼠模型中HbA1c 顯著上調(diào)

    2.2 HbA1c 能促進(jìn)A549 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲為了研究糖化血紅蛋白在肺癌的腫瘤發(fā)生中的作用,我們構(gòu)建了HbA1 的過表達(dá)載體。qRT?PCR(圖2A)和Western Blot(圖2B)檢測結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染oe?HbA1 組相比于oe?NC 組HbA1 的表達(dá)水平顯著上調(diào),表明HbA1 的過表達(dá)載體構(gòu)建成功。在A549 細(xì)胞中過表達(dá)HbA1 后給予1.5 mg/mL 葡萄糖刺激(對照組給予同等劑量的PBS),結(jié)果表明對HbA1 的蛋白表達(dá)無顯著變化(圖2C),但HbA1c 的蛋白水平顯著上調(diào)。CCK?8 實驗表明,外源葡萄糖可顯著性促進(jìn)過表達(dá)HbA1 的A549 細(xì)胞的增殖速率(圖2E)。Transwell 實驗表明外源葡萄糖可顯著性促進(jìn)過表達(dá)HbA1 的A549 細(xì)胞的遷移能力(圖2F)。以上結(jié)果提示過表達(dá)HbA1 并給予外源葡萄糖刺激后上調(diào)的HbA1c 能促進(jìn)A549 細(xì)胞的癌化。

    圖2 糖化血紅蛋白HbA1c 能促進(jìn)A549 細(xì)胞的癌化

    2.3 HbA1c 能促進(jìn)小鼠肺癌的腫瘤發(fā)生通過尾靜脈注射含HbA1 過表達(dá)載體(oe?HbA1)的腺病毒構(gòu)建過表達(dá)HbA1 的小鼠模型,給予小鼠高糖飲食(HSD)喂養(yǎng),對照組給予正常飲食。結(jié)果顯示注射攜帶HbA1 過表達(dá)載體(oe?HbA1)的腺病毒后,在小鼠外周血中HbA1 的mRNA 和蛋白水平顯著上調(diào)(圖3A、3B),表明過表達(dá)HbA1 的小鼠模型構(gòu)建成功。而過表達(dá)HbA1 后給予HSD,HbA1c 的蛋白水平顯著上調(diào)(圖3C)。向小鼠皮下注射A549 細(xì)胞進(jìn)行肺癌造模,圖3D 表明,各組小鼠皮下均出現(xiàn)顯著的腫瘤塊,解剖小鼠取出腫瘤,圖3E 表明過表達(dá)HbA1 后給予HSD 組相比于NC 組腫瘤顯著增大,圖3F、3G 表明過表達(dá)HbA1 后給予HSD 組相比于NC 組腫瘤的重量和體積都顯著增大。提示HbA1c能促進(jìn)肺癌的腫瘤發(fā)生。

    圖3 HbA1c 能促進(jìn)小鼠肺癌的腫瘤發(fā)生

    3 討論

    糖尿病是由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的常見病,臨床以高血糖為主要標(biāo)志,引起一系列代謝紊亂綜合征,嚴(yán)重危害人的生命健康。近年來有大量的研究和數(shù)據(jù)表明,糖尿病的患者,比起血糖正常的人,有著更高的患癌風(fēng)險。據(jù)調(diào)查,高血糖的人群,死于癌癥的幾率,比血糖水平正常的人要高25%左右。而同樣的,腫瘤患者之中,似乎也有著比較高的糖尿病發(fā)病率[14]。

    研究表明,多種癌癥的發(fā)病與長期異常的高血糖存在高度正相關(guān)。腎癌作為常見的一種癌癥,和腎臟受到損傷有關(guān)。長期高血糖的影響下,此時人的腎臟功能也會受到影響,就可能導(dǎo)致糖尿病性腎病的出現(xiàn),久而久之還會導(dǎo)致腎臟細(xì)胞變性,出現(xiàn)癌變的可能,最終誘發(fā)腎癌[15]。肝臟作為人體的重要器官,除了受到病毒感染后容易引發(fā)惡性腫瘤外,如果長期高血糖沒有控制,患上肝硬化,脂肪肝的概率增加,因此可能患上肝癌[16]。據(jù)研究表明,中國肝癌的發(fā)生與糖尿病密切相關(guān),糖尿病患者患上肝癌的風(fēng)險升高了49%。胰腺癌作為惡化程度較高的惡性腫瘤,同樣多出現(xiàn)在糖尿病患者身上[17]。據(jù)統(tǒng)計,臨床上有超過三成出現(xiàn)胰腺癌的人,在檢查過程中發(fā)現(xiàn)患者存在糖尿病,可見,胰腺癌的出現(xiàn)和血糖過高也有一定關(guān)系[18]。

    在本研究中我們從肺癌小鼠模型中發(fā)現(xiàn)糖化血紅蛋白的水平隨腫瘤的發(fā)生而上調(diào),進(jìn)而引發(fā)后續(xù)的一系列研究,先通過細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)糖化血紅蛋白HbA1c 的上調(diào)會促進(jìn)A549 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,使得A549 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力進(jìn)一步上調(diào),最后在小鼠上進(jìn)一步驗證我們的觀點,發(fā)現(xiàn)糖化血紅蛋白的上調(diào)能促進(jìn)肺癌原位癌小鼠模型中的腫瘤發(fā)生和發(fā)展。提示通過抑制血紅蛋白的糖化可能可以抑制肺癌的發(fā)生和發(fā)展,為肺癌的治療提供了新思路和新靶點。但是,糖化血紅蛋白HbA1c 是通過何種機(jī)制促進(jìn)肺癌的腫瘤發(fā)生還不明了,急需更多的科研工作者共同參與到后續(xù)的研究中,為早日開發(fā)出新的肺癌治療方法提供自己力所能及的幫助。

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