骨骼肌損傷模型及其損傷后修復調控相關因素的研究進展

李素廷 洪 莉 洪莎莎

武漢大學人民醫(yī)院婦產(chǎn)科 湖北 武漢 430060

骨骼肌占人體總重的30%～40%，是調節(jié)機體代謝以及維持體內平衡的重要組織。骨骼肌損傷后可依賴組織駐留的肌衛(wèi)星細胞（satellite cells，SCs）或通過細胞因子發(fā)揮直接或間接作用調節(jié)組織重塑［1］。初始炎癥反應期、SCs 活化和增殖再生期以及再生肌纖維成熟重塑期是肌肉損傷后再生過程中的三個重要階段［2］。骨骼肌在維持機體生命活動中有著無可替代的價值，在損傷過重或再生受損情況下肌肉功能難以達到有效修復，了解骨骼肌組織損傷及修復的動態(tài)過程，探尋維持肌肉再生的有效機制對于修復受損的肌肉組織具有重要價值。骨骼肌損傷的原因眾多，包括機械力造成的肌肉撕裂和挫傷等直接創(chuàng)傷［3］、由年齡或慢性壓力造成的間接損傷［4］，以及其他因素所致的肌肉病變如肌萎縮側索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）、炎性肌病、肌肉營養(yǎng)不良等［5?7］，選擇合適的模型是深入探尋疾病發(fā)病機制的關鍵。本文通過綜述骨骼肌損傷動物模型的構建方法，分析骨骼肌損傷后修復的調控機制，以為后續(xù)的研究提供參考。

1 肌肉損傷模型構建

不同的肌肉損傷方案可以干擾組織的損傷?再生平衡程度，甚至改變再生過程及結果。有研究顯示Myf5 缺失小鼠在冷凍損傷后呈現(xiàn)再生表現(xiàn)，但是在心臟毒素（cardiotoxin，CTX）損傷后再生能力明顯減弱［8］。因此，了解不同方案對肌肉組織的破壞機制以及骨骼肌在這些條件下不同的反應方式尤為重要。根據(jù)模型構建的時間差異，可分為急性損傷及慢性損傷兩種類型。

1.1 急性肌肉損傷常用的急性肌肉損傷模型的構建方式包括CTX、虎蛇毒素（notexin，NTX）、氯化鋇（BaCl2）、甘油等生物毒素或化學物品的肌肉注射［9?11］，冷凍、擠壓、牽拉或針刺等急性機械性損傷以及電擊傷等。CTX 注射是最為常用的造模手段。CTX 和NTX 是天然毒性蛋白質，能夠抑制激酶C以及磷脂酶A（2PLA2）的活性，與肌膜上的受體結合并使膜產(chǎn)生破損，通透性小孔的存在導致肌纖維去極化以及大量的Ca2+內流，從而損害肌肉功能；注射后易擴散，能夠在在整個損傷后修復過程中呈現(xiàn)出均勻的肌纖維再生。但是由于CTX/NTX 屬于生物類毒素，其效果穩(wěn)定性相比于化學合成物BaCl2差［12］。冷凍損傷也是較為常用的肌肉損傷造模方式，通過液氮預冷后的鐵棒通過與暴露的肌肉組織直接接觸造成損傷，產(chǎn)生缺乏活細胞的“死區(qū)”，以及構成再生細胞來源的遠端保留區(qū)。相比毒素注射，冷凍損傷也會破壞脈管系統(tǒng)［12］，造成更為嚴重的SCs 損失。頓挫、牽拉傷在運動型損傷中的占比高達90%以上，鈍器打擊或自體/異物重量造成的頓挫撕裂損傷后的修復研究也具有一定的意義和價值［13］。電擊損傷是基于不可逆的電穿孔原理進行，有效接受電擊的組織能夠完全受損但保持細胞外基質的完整，適用于特定研究中。機械性損傷的不足在于模型穩(wěn)定性差，組織損傷不均勻，組織修復過程常涉及多種細胞的運動、相互作用。但在某些情況下，這種細胞由正常?損傷組織的定向遷移能力能為研究組織內不同群體的定向遷移和滲透提供便捷。

1.2 慢性肌肉損傷慢性肌肉損傷的研究常是以某些疾病為基礎，如杜氏進行性肌營養(yǎng)不良（DMD）、ALS 等，其模型的多樣性遠不如急性肌肉損傷。Mdx 小鼠（dystrophin 缺失）是常用的慢性損傷動物模型，雖然Mdx 小鼠的肌肉功能受損程度弱于病人的表現(xiàn)，但是其骨骼肌處于較為頻繁的損傷?修復過程中，是研究骨骼肌損傷修復的最有效模型之一。ALS 特征是運動神經(jīng)元的變性和死亡導致骨骼肌失神經(jīng)支配、萎縮，神經(jīng)肌肉接頭的功能障礙在ALS 的發(fā)作中起著至關重要的作用［14］。去神經(jīng)支配造成的肌肉功能損傷也是研究肌肉退行性病變的有效模型之一，以肌肉萎縮以及骨骼肌組織纖維化為主要表現(xiàn)［15］，修復過程伴隨著線粒體過氧化物、單胺氧化酶、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶等均呈現(xiàn)增加趨勢［16］。

2 骨骼肌損傷后修復及調控相關因素

成人骨骼肌的組成主要是由終末分化的肌纖維組成，肌肉損傷后的修復主要由駐留于肌膜的靜止狀態(tài)的SCs 激活后重新進入細胞周期并參與肌纖維分化以完成修復或重建。肌肉功能的有效重建還需要其他肌肉組織中的細胞/因子調節(jié)，如纖維脂肪形成祖細胞（fibrocyte/adipocyte progenitors，F(xiàn)APs）、內皮細胞、間充質干細胞、巨噬細胞等細胞成分，以及胰島素樣生長因子1（insulin?like growth factor?1，IGF?1）、轉化生長因子?β1（transforming growth fac?tor?β1，TGF?β1）等細胞因子。

2.1 SCs 分化主導的肌纖維修復骨骼肌由肌纖維、神經(jīng)元、脈管系統(tǒng)和結締組織組成，其中骨骼肌的結構和功能單元為肌纖維，每個肌纖維被內膜（也稱為基底膜或基底層）包圍。SCs 處于肌纖維的質膜之間，位于周圍的基底層下方和肌纖維質膜外側，SCs 及同期有相互作用的周圍環(huán)境被稱為衛(wèi)星細胞龕。SCs 在正常情況下大都處于靜止狀態(tài)，激活后重新進入細胞周期。在此過程中，肌纖維的從頭合成分為兩個階段。第一階段是成肌細胞間的相互融合形成新生肌管，第二階段是新的成肌細胞融合到新生肌管中形成成熟肌纖維，表現(xiàn)為MyHC 以及其他肌肉收縮相關蛋白的表達增加。肌肉損傷后的修復過程受到關鍵轉錄因子如MyoD、MyoG、Myf5 等分子的調節(jié)，這些成分表達的時間及多少決定了SCs增殖與分化之間的平衡。盡管該肌肉損傷后修復過程中SCs 的作用已得到一定程度的闡釋，但是探索決定SCs 內在數(shù)量及平衡的機制、了解調節(jié)肌肉肥大及萎縮的機制，從而對相關疾病或癥狀進行有效預防或治療仍需要進一步研究解決。

2.2 FAPs 的調節(jié)存在于肌間質中，具有分化成成纖維細胞或脂肪細胞的特征，對SCs 的增殖以及終末分化有重要調控作用。FAPs 是促進細胞分化因子的來源之一，共培養(yǎng)實驗表明FAPs 能夠通過分泌某些因子驅動成肌細胞的分化和融合，并且能夠抑制白喉毒素所致的肌肉再生受損［17］。此外衰老會損害FAPs 的功能，衰老小鼠骨骼肌的FAPs 中WNT1 誘導信號通路蛋白1（WISP1）丟失，年輕小鼠體內的FAP 移植或WISP1 添加治療可恢復老年小鼠中SCs 的成肌能力，促進骨骼肌損傷后的再生修復［18］。FAPs 也是纖維化的主要來源，去神經(jīng)引起骨骼肌組織中FAPs 的逐步積累，細胞表現(xiàn)出持續(xù)的STAT3 激活并分泌較高水平的IL?6，從而促進肌肉萎縮和纖維化。同時在小鼠脊髓損傷、脊髓性肌萎縮、ALS 患者的肌肉中發(fā)現(xiàn)了STAT3?IL?6信號異常激活的FAPs［19］。而在營養(yǎng)不良小鼠中，F(xiàn)APs 能夠分化成類似于成纖維細胞的基質生成細胞。因此，F(xiàn)APs 在再生期間在肌肉生理學中發(fā)揮顯著的調節(jié)和營養(yǎng)作用。

2.3 神經(jīng)支配調控在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，有髓神經(jīng)軸突自神經(jīng)元胞體發(fā)出后，被施萬細胞所組成的髓鞘包繞。施萬細胞可通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、細胞黏附分子等引導軸突生長錐的定向生長。神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）是神經(jīng)營養(yǎng)因子中最早被發(fā)現(xiàn)、具有神經(jīng)元營養(yǎng)和促突起生長雙重生物學功能的一種神經(jīng)細胞生長調節(jié)因子，它對中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性的表達均有重要的調控作用。NGF 在發(fā)育中的肌肉中表達，并在再生受損的肌肉中再次升高，如肌營養(yǎng)不良癥、ALS，提示NGF 的表達可能與肌肉再生有相關性［20，21］。與NGF 類似，成人骨骼肌中腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)能夠使SCs 保持其靜止狀態(tài)并防止其成肌分化，內源性BDNF 的減少會導致早期的肌源性分化。這些數(shù)據(jù)表明神經(jīng)營養(yǎng)因子或同時能夠以自分泌方式起作用，調節(jié)SCs 的行為和肌肉的再生。

2.4 免疫細胞的調節(jié)正常情況下骨骼肌中駐留的免疫細胞較少，在損傷發(fā)生的早期階段，免疫細胞被快速募集。肌肉穩(wěn)態(tài)和再生涉及多種免疫細胞的相互作用，中性粒細胞/單核細胞是組織損傷后首先招募的細胞，在損傷后3 h 內出現(xiàn)，它們通過分泌蛋白水解酶清除、吞噬壞死組織。巨噬細胞根據(jù)損傷后出現(xiàn)的時間可分為M1 與M2 兩種類型，不同類型的巨噬細胞具有不同的免疫調節(jié)功能，最終對肌肉再生過程發(fā)揮調控功能［11］。在老年肌肉中SCs 周圍的免疫細胞顯示出功能缺陷，自由基產(chǎn)生、吞噬作用和趨化作用的能力降低，這在一定程度上導致了老年骨骼肌再生功能的下降。

3 總結及展望

骨骼肌再生過程涉及多種細胞的相互作用，具有不同特性的細胞亞群提供了在再生過程中不同的推動力。能夠同SCs 直接相互作用其他因素，如局部其他間質細胞，血管及其相關的分泌因子也具有調節(jié)SCs 功能并影響肌肉再生的潛力。多年來骨骼肌一直用于再生干細胞生物學研究，但該領域仍然缺乏統(tǒng)一化的損傷和修復實驗研究方案，由于模型或者取材時間的差異，不同實驗室之間數(shù)據(jù)的可比較性稍差。盡管已有大量研究顯示出有效的調節(jié)SCs 增殖、分化能力或者促進其移植后修復能力的結果，但是SCs 移植后的低存活率和自我更新能力以及受限的運動能力等問題仍未解決。設立標準化的骨骼肌疾病研究方案，開發(fā)SCs 更為有效的體外增殖以及體內移植方法，在此基礎上深入研究SCs 活動和分化行為的內外調控機制，生物醫(yī)學工程的發(fā)展有望通過這些技術緩解肌肉相關疾病的患病及治療壓力。