無機雜化脂肪酶的制備及其催化性能研究

陳林林, 張佳欣, 李 偉, 王 玲, 宋佳琪, 辛嘉英,2

（1. 哈爾濱商業(yè)大學 省高校食品科學與工程重點實驗室, 黑龍江 哈爾濱 150076;2. 中國科學院蘭州化學物理研究所 羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室, 甘肅 蘭州 730000）

脂肪酶屬于水解酶, 是最廣泛的生物催化劑之一, 具有專一性強、 反應(yīng)條件溫和以及可被生物降解等優(yōu)點［1-3］. 在食品領(lǐng)域, 脂肪酶常常用于改善食品的風味, 延長食品的貨架期等［4］. 然而, 天然的脂肪酶在高溫和有機溶劑等非自然環(huán)境中穩(wěn)定性較差, 催化反應(yīng)存在著不穩(wěn)定、 難以重復利用等問題［1,5］. 為了克服上述不足, 建立了多種酶的固定化方法用來提高脂肪酶的催化性能和穩(wěn)定性. 傳統(tǒng)的酶固定化的方法主要有吸附法、 共價結(jié)合法、 包埋法及交聯(lián)法等［6］. Galina等［7］通過吸附法制備了多孔碳氣凝膠固定化脂肪酶, 在合成脂肪酸酯時表現(xiàn)出高度穩(wěn)定性, 可運行數(shù)百小時. 但傳統(tǒng)固定化方法制備過程繁瑣, 固定化酶的機械性能較差并且酶易失活［8-9］.

因此, 開發(fā)一種新型的高效酶固定化方法成為了目前研究的熱點［10］. 新型固定化酶方法主要有兩種: 一是基于改良酶的固定化開發(fā)技術(shù), 如微波輻射輔助固定化技術(shù)、 膜固定化技術(shù)等［11］; 二是選擇優(yōu)良的載體, 進行固定化酶. 載體材料主要包括無機材料、 有機材料和復合材料［11-12］. 其中無機載體是一種可以直接從自然界中獲得或可以通過簡單的無機材料固定酶的載體. Xu等［13］制備了鋱金屬-有機框架@二氧化錳納米復合材料, 并將由膽固醇氧化酶和磷酸銅自組裝制備的雜化納米花混合, 與游離酶相比, 固定化酶對膽固醇表現(xiàn)出相似的敏感性和特異性. 但無機雜化材料合成的過程相對復雜、在高濃度鹽、 高濃度底物和高溫的環(huán)境下易發(fā)生解吸等問題, 如介孔二氧化硅雖具有較大的比表面積和孔隙率, 但卻面臨著酶易浸出和變性等穩(wěn)定性的問題［14］. 因此, 通常在對酶進行固定化時需要考慮操作情況、 成本以及是否會破壞酶活和穩(wěn)定性等方面［15］的問題.

近年來, 隨著納米技術(shù)的發(fā)展, 納米無機材料載體因其原料易得、 價格低廉、 不易分解且無毒無害等特點逐漸成為酶固定化的選擇. 2012年, 一種創(chuàng)新性雜化納米花固定化酶被提出［16］. 游離脂肪酶參與形成的脂肪酶雜化納米花（Lipase Hybrid Nanoflower, Lip-hNF）彌補了固定化酶技術(shù)的不足,為酶的固定化技術(shù)發(fā)展開辟了新的方向［17］. 該方法是由酶分子和金屬鹽無機自組裝形成的, 其合成過程分為3步: 成核、 異向生長和形成花形［16,18］. 與其他固定化方法不同的是, 無機雜化納米花具有獨特的多孔花狀結(jié)構(gòu)及較大的表面積, 有利于傳質(zhì)過程的發(fā)生［19］, 還能夠有效地提升酶的利用率, 減少游離酶的浪費, 合成的固定化酶具有易回收可重復使用等優(yōu)點, 可以降低酶的使用成本, 同時可以改善酶的活性及儲存穩(wěn)定性［18-20］. Zhong等［21］制備了高活性、 可循環(huán)利用的磁性活性的雜化酶, 與游離脂肪酶相比, 雜化酶的活性恢復率高達190%, 貯藏穩(wěn)定性和甲醇耐受性均有提高. Li等［22］研究了不同合成條件對雜化酶形狀和活性的影響, 其中用2價金屬離子合成的雜化酶活性高于用1價金屬離子或3價金屬離子合成的雜化酶催化活性. Jia等［23］采用反相微乳液法合成了帶有-NH2基團的介孔二氧化硅納米花并將脂肪酶固定在合成無機納米材料上,制備的固定化酶表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和可回收性.

雜化酶的形成主要是基于金屬離子與酶分子胺基之間的相互作用, 不同種類的金屬離子會影響酶在雜化酶納米花中的活性, 能夠改變游離脂肪酶的結(jié)構(gòu)和形貌特征, 從而改變雜化酶的穩(wěn)定性和催化活性［24-25］. 我們利用酶-無機雜化技術(shù)對洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶進行固定化, 系統(tǒng)考察4種2價金屬離子Ca2+、 Zn2+、 Mn2+和Cu2+對合成雜化酶的二級結(jié)構(gòu)、 最佳反應(yīng)條件下的催化活性、 耐受性和重復性的影響. 目的是制備出催化活性和穩(wěn)定性好、 耐受性和重復性高的雜化酶, 為探究固定化酶在實際中的應(yīng)用提供依據(jù).

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶水解活力為1828 U/mg; 氯化鈣, 購自天津市風船化學試劑科技有限公司; 硫酸鋅、 磷酸氫二鈉、 磷酸二氫鈉和無水乙醇,購自天津市天力化學試劑有限公司; 硫酸錳, 購自天津博迪化工股份有限公司; 硫酸銅, 購自汕頭市西隴化工廠有限公司; 棕櫚酸對硝基苯酯, 購自阿拉丁試劑有限公司; 對硝基苯酚, 購自上海麥克林生化科技有限公司; 甲醇, 購自天津市福晨化學試劑廠; 尿素, 購自天津市光復科技發(fā)展有限公司. 所有試劑均為分析純.

XT 220A 精密電子天平、 Z-16K 冷凍離心機、 UV-2550 紫外-可見分光光度計、 PerkinElmer Spectrum Two傅里葉變換紅外光譜儀、 JEM-2100 型透射電子顯微鏡、 SU1510 掃描電子顯微鏡、 TGL-16高速臺式離心機、 HWS24電熱恒溫水浴鍋.

1.2 雜化脂肪酶制備

10 mL離心管中放入6 mL 100 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS, pH=7.5）, 加入1 mL 1 mg/mL的脂肪酶和200 μL 200 mmol/L金屬鹽溶液（CaCl2, ZnSO4,MnSO4, CuSO4）, 混勻, 室溫下放置24 h. 離心, 蒸餾水洗滌3次, 凍干, 收集雜化脂肪酶［22］.

1.3 催化反應(yīng)條件對雜化脂肪酶活性的影響

1.3.1 反應(yīng)時間對雜化脂肪酶活性的影響

為了選擇合適的反應(yīng)時間, 稱取0.002 g 雜化酶添加到2.8 mL 100 mmol/L PBS（pH=8.0）中, 加入0.2 mL 10 mmol/L棕櫚酸對硝基苯酯（P-NPP）, 在不同反應(yīng)時間下（1、 5、 10、 15、 20、 30、 35和40 min）檢測反應(yīng)體系在400 nm處的吸光值, 確定最佳反應(yīng)時間［26］.

1.3.2 反應(yīng)溫度對雜化脂肪酶活性的影響

為了優(yōu)化反應(yīng)溫度, 稱取0.002 g 雜化酶, 添加到2.8 mL 100 mmol/L PBS（pH=8.0）中, 加入0.2 mL 10 mmol/L P-NPP, 在不同反應(yīng)溫度下（25、 30、 40、50、 60和70 ℃）水浴, 檢測反應(yīng)體系在400 nm處的吸光值, 確定最佳反應(yīng)溫度［27-28］.

1.3.3 pH值對雜化脂肪酶活性的影響

為了檢測pH值對反應(yīng)的影響, 稱取0.002 g 雜化酶, 添加到2.8 mL 100 mmol/L PBS中, 加入0.2 mL 10 mmol/L P-NPP, 在最佳反應(yīng)溫度下, 不同pH值緩沖溶液中（7、 8、 9和10）檢測反應(yīng)體系在400 nm處的吸光值, 確定反應(yīng)最佳pH值［28］.

1.4 雜化脂肪酶包封率

采用紫外分光光度計法測定雜化酶制備過程中游離脂肪酶的包封率［24］. 配制一系列含不同濃度（0.0、 0.1、 0.3、 0.5、 0.8和1.0 mg/mL）游離脂肪酶的PBS標準溶液, 在270 nm下測定吸光度, A270nm為縱坐標, 游離脂肪酶濃度為橫坐標繪制標準曲線, 得到線性回歸方程:y= 0.2919x+ 0.0683. 分別測定不同金屬離子固定化酶反應(yīng)后上清液在270 nm處吸光度, 根據(jù)標準曲線線性方程計算出上清液中游離脂肪酶的濃度, 通過公式（1）計算雜化酶制備過程中游離脂肪酶的包封率.

式中:X為包封率;C0為游離脂肪酶濃度;Csample為上清液中游離脂肪酶的濃度.

1.5 雜化脂肪酶酶活測定

1.5.1 標準曲線的繪制

配置不同濃度（0、 0.03、 0.06、 0.09 和0.12 μg/L）的的對硝基苯酚（P-NP）乙醇溶液, 在紫外分光光度計400 nm下檢測, 并記錄吸光值. 以P-NP 的濃度為橫坐標, A400nm為縱坐標, 得到線性回歸曲線:y=13.776x+ 0.036, 用于脂肪酶酶活的計算［29］.

1.5.2 對硝基苯酚法測酶活

酶活性測定建立在Zhang等［30］的檢測方法上:將0.002 g的雜化酶添加到2.8 mL 100 mmol/L PBS（pH=8.0）中, 加入0.2 mL 10 mmol/LP-NPP, 40 ℃孵育10 min, 加入1.5 mL丙酮以終止反應(yīng). 最后, 用紫外分光光度計在400 nm處檢測反應(yīng)溶液, 記錄吸光值A(chǔ)400nm, 以100 mmol/L PBS（pH=8.0）為空白溶液,400 nm處檢測記錄吸光值A(chǔ)0, 記算出酶活. 1個酶活力單位（U）定義為1 min內(nèi)生成1 μmol/L P-NP所需的脂肪酶的酶量.

1.6 雜化脂肪酶催化性能及反應(yīng)動力學參數(shù)測定

配置不同濃度（6、 8和10 mmol/L）的底物P-NPP,稱取0.002 g 雜化酶置于4 mL離心管中, 加入 2.8 mL 100 mmol/L PBS（pH=8.0）和0.2 mL不同濃度的P-NPP, 最適溫度下雜化脂肪酶的酶促反應(yīng)速率, 利用米氏函數(shù)擬合數(shù)據(jù), 分別以1/V為縱坐標, 1/［S］為橫坐標作圖, 根據(jù)雙倒數(shù)作圖法公式（2）、 公式（3）計算出Vm、Km和Kcat［31］.

式中:V為酶促反應(yīng)速率;Vm為最大反應(yīng)速率;Km為米氏常數(shù); ［S］為底物濃度.

式中:Kcat為催化常數(shù);Vm為最大反應(yīng)速率; ［S］為底物濃度.

1.7 雜化脂肪酶耐受性分析

取0.002 g的游離脂肪酶和雜化酶, 置于4 mL離心管中, 分別向每個離心管中加入1 mL的變性劑溶液（95%無水乙醇、 甲醇和6 mmol/L尿素）, 常溫下放置30 min后, 按1.5.2的方法直接測定酶活［25］.

1.8 雜化脂肪酶重復性分析

取2 mg 雜化酶, 置于4 mL離心管中, 向離心管中分別加入2.8 mL 100 mmol/L的PBS緩沖溶液（pH 8）和0.2 mL的底物, 振蕩混勻, 將離心管置于40 ℃的水浴鍋中反應(yīng)10 min后, 離心分離回收雜化酶,上清液用分光光度計在400 nm下讀取其吸光值. 回收的雜化酶用蒸餾水清洗3遍后, 加入2.8 mL 100 mmol/L的PBS緩沖溶液（pH=8）和0.2 mL的底物, 重復以上操作過程, 再次測定酶活, 連續(xù)測定3次. 將首次測定的雜化酶的酶活定義為100%. 其余次數(shù)測定的雜化酶的酶活, 計算其剩余酶活［32］.

2 結(jié)果與討論

2.1 雜化脂肪酶表征

2.1.1 雜化脂肪酶紅外光譜表征

傅立葉紅外光譜圖用于表征制備雜化酶化學鍵的變化. 圖1（a）所示游離脂肪酶在1415～1657 cm-1處的3個特征峰, 是肽鍵及其蛋白質(zhì)延伸的特征,如-NH2和C＝O; 3000～3200 cm-1處的寬而強的特征峰歸屬于-CH2和-CH3. 圖1（b）為Ca脂肪酶雜化納米花（Ca/hNF）, 與游離脂肪酶相比在928～1091 cm-1處觀察到多個P－O振動和拉伸特征峰, 相對較小的波段在554～643 cm-1是PO43-的反對稱和對稱伸縮振動弱吸收峰, 證明了在雜化脂肪酶中磷酸根的存在; Ca/hNF的特征峰在1642和3000～3200 cm-1有所增強, 表明游離脂肪酶被固定在Ca/hNF中, 1538和1425 cm-1處的酰胺特征峰消失, 說明在雜化酶的形成過程中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化. 這些結(jié)果表明所制備Ca/hNF中既含有磷酸根, 又含有游離脂肪酶.

圖1 游離脂肪酶和雜化納米花的傅立葉紅外光譜Fig.1 Fourier infrared spectroscopy of free-lipase and Ca/hNF（a）: free-lipase; （b）: Ca/hNF

采用紅外光譜圖探究由不同種金屬離子形成雜化酶二級結(jié)構(gòu)的影響. 從圖2可知, 形成的Lip-hNF均觀察到PO43-和蛋白質(zhì)的特征峰, 證明了Ca2+、Zn2+、 Mn2+、 Cu2+這4種金屬離子均能與游離脂肪酶無機雜化, 改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu), 但其特征峰有著不同程度的增強或削弱, 其中Ca/hNF的磷酸根特征峰,酰胺Ⅰ帶特征峰最強, 納米花結(jié)構(gòu)形成的最為明顯,Mn/hNF的磷酸根特征峰要強于Zn/hNF, Cu/hNF的納米花結(jié)構(gòu)較弱. 以上結(jié)果表明, 不同種的金屬離子對雜化酶的二級結(jié)構(gòu)有不同程度的改變, 對合成Lip-hNF催化活性的影響不同.

圖2 雜化脂肪酶的傅立葉紅外光譜Fig.2 Fourier infrared spectroscopy of hybrid lipases（a）: Ca/hNF; （b）: Zn/hNF; （c）: Mn/hNF; （d）: Cu/hNF

2.1.2 雜化脂肪酶電鏡表征

為了進一步了解脂肪酶雜化的納米花微觀形態(tài), 借助了掃描電鏡（SEM）、 透射電鏡（TEM）和激光掃描共聚焦顯微鏡（CLSM）（如圖3所示）. 從圖3（a）, （b）可以看到該固定化酶體系的微觀結(jié)構(gòu)為花狀, 具有層級結(jié)構(gòu), 每一個納米花的大小約為1 μm. 透射電子顯微鏡圖3（c）進一步顯示出的這種花狀結(jié)構(gòu), Ca/hNF為層級片狀結(jié)構(gòu), 可以看到金屬鹽離子的存在,具有較大的比表面積, 說明了該結(jié)構(gòu)下的固定化酶相比游離酶會增加酶的活性. 此外, 為了確定脂肪酶分子在雜化酶中的固定情況, 在CLSM圖3（d）圖像中可以清楚地觀察到脂肪酶的熒光成像, 進一步說明脂肪酶在Ca/hNF中成功固定.

圖3 Ca/hNF的電鏡掃描圖Fig.3 Electron microscopic scan of Ca/hNF（a）, （b）: SEM; （c）: TEM; （d）: CLSM

2.2 催化反應(yīng)條件對雜化脂肪酶活性的影響

2.2.1 反應(yīng)時間對雜化脂肪酶活性的影響

考察反應(yīng)時間對雜化酶催化活性的影響, 以確定雜化酶的反應(yīng)速率. 從圖4可看出4種Lip-hNF在反應(yīng)1～10 min內(nèi)吸光值在反應(yīng)體系中的濃度均隨著時間增長而增加, 呈現(xiàn)顯著上升的趨勢（P＜0.01）, 10 min后反應(yīng)速率開始降低, 并趨于平穩(wěn). 其中Ca/hNF的水解速率要大于Zn/hNF、 Mn/hNF和Cu/hNF. 因此, 雜化酶催化水解反應(yīng)的最優(yōu)反應(yīng)時間為10 min.

圖4 不同反應(yīng)時間對雜化酶酶活的影響Fig.4 Effects of different reaction times on enzyme activity of hybrid enzymes

2.2.2 反應(yīng)溫度對雜化脂肪酶活性的影響

反應(yīng)溫度會影響雜化酶的催化活性和熱穩(wěn)定性, 它是影響化學平衡常數(shù)的一個重要參數(shù). 結(jié)果如圖5所示, 4種Lip-hNF在反應(yīng)溫度為25～40 ℃時吸光值在反應(yīng)體系中的濃度均隨著溫度的增長而增加, 呈現(xiàn)顯著上升的趨勢（P＜0.01）, 40 ℃后溫度升高, 反應(yīng)速率開始下降. 總體呈現(xiàn)出反應(yīng)速率均隨溫度的增高而先升高后降低的趨勢, 與Li等［22］其自組裝制備的Ca/hNF變化趨勢一致. 這是因為隨著溫度升高, 會加快雜化酶的催化反應(yīng)進程, 但隨著溫度的持續(xù)升高, 酶的活性中心結(jié)構(gòu)會被破壞, 導致雜化酶的水解活性下降或失活. 其中Ca/hNF在50 ℃時其水解活性為游離脂肪酶的197%, Mn/hNF的水解活性在50 ～70 ℃時要低于Cu/hNF. 表明了雜化酶的納米花結(jié)構(gòu)對脂肪酶有保護作用, 展示出良好的熱穩(wěn)定性. 因此, 雜化酶的最優(yōu)反應(yīng)溫度為40 ℃.

圖5 不同反應(yīng)溫度對雜化酶酶活的影響Fig.5 Effects of different reaction temperatures on enzyme activity of hybrid enzymes

2.2.3 pH值對雜化脂肪酶活性的影響

考察pH值分別為7、 8、 9、 10的緩沖溶液對雜化酶催化水解能力的影響. 從圖6可知, 雜化酶在堿性條件下水解效果最佳, 在pH值為7～8范圍內(nèi),雜化酶的水解產(chǎn)物在反應(yīng)體系中的濃度隨著pH值的增加, 呈現(xiàn)顯著上升的趨勢（P＜0.01）. Ca/hNF、 Zn/hNF在緩沖溶液pH值為10時的水解活性分別為最佳水解活性的84.75%和78.86%, 能較好地維持雜化酶水解活力的穩(wěn)定性. Mn/hNF、 Cu/hNF在緩沖溶液pH值變化時, 其穩(wěn)定性為最佳反應(yīng)pH的57.49%和58.98%. 可以得出不同種金屬離子不會改變水解反應(yīng)的最佳pH值, 與Zhang等［30］制備Zn/hNF呈現(xiàn)相同的趨勢. 可以看出, 當pH值為8時雜化酶的活力最大, 并在極端堿性的pH條件下, 其納米花結(jié)構(gòu)仍能保護脂肪酶不被破壞, 維持一定的酶活力. 實驗結(jié)果表明, 雜化酶在催化環(huán)境變化下, 4種雜化酶的催化活性變化趨勢相近. Lip-hNF的最優(yōu)pH值為8.

圖6 不同反應(yīng)pH對雜化酶酶活的影響Fig.6 Effects of different pH on enzyme activity of hybrid enzymes

2.3 雜化脂肪酶包封率

根據(jù)公式（1）計算出雜化酶中游離脂肪酶的包封率如圖7 所示. 其中Ca/hNF的包封率為95.78%,大于其余3 種Lip-hNF, Mn/hNF中固定脂肪酶的含量要大于Zn/hNF, Cu/hNF的固定化效率最低為91.89%. 雜化酶的包封率根據(jù)金屬離子的不同, 包封率無顯著差異（P＜0.01）, 均大于90%, 體現(xiàn)出良好的固定化效率.

圖7 雜化脂肪酶包封率Fig.7 Encapsulation rate of hybrid lipases

2.4 雜化脂肪酶酶活測定

固定化酶會與底物接觸受到限制, 通常游離脂肪酶被固定化后活性會下降, 活性是評價固定化酶的一個重要指標. 結(jié)果如圖8所示, 雜化酶的水解活性均大于游離脂肪酶, 活性從高到低的順序依次為:Ca/hNF ＞Zn/hNF ＞Mn/hNF ＞Cu/hNF. 其中Ca/hNF的酶活為游離脂肪酶活性的187%, Zn/hNF的酶活為游離脂肪酶活性的148% , Mn/hNF的酶活為游離脂肪酶活性的137% , Cu/hNF的為游離脂肪酶活性的108%. 從生長機理來講, 金屬離子能通過協(xié)調(diào)相互作用與酶分子形成復合物, 這是雜化酶形成的關(guān)鍵.不同金屬離子雜化酶活性增強的原因可以歸于較高的比表面積和二級結(jié)構(gòu)的改變, 其中Ca2+作為生物體中一種重要的元素, 參與整個生命的新陳代謝.對于脂肪酶有激發(fā)作用, 使得酶分子更容易與底物接觸, 進一步提高雜化酶的催化活性.

2.5 雜化脂肪酶催化性能及反應(yīng)動力學參數(shù)

為了進一步了解雜化酶的性質(zhì), 測定了游離脂肪酶和Ca/hNF、 Zn/hNF、 Mn/hNF、 Cu/hNF的動力學參數(shù), 結(jié)果如表1所示.

Km值通常用于評估親和力. 表1 顯示游離脂肪酶的Km值小于雜化酶, 表明底物和脂肪酶之間的擴散阻力較高, 從而導致雜化酶的Km增大. 其中Ca/hNF的Km要小于其它3 種Lip-hNF. 然而, 較高的Vmax表明雜化酶相對于游離脂肪酶具有較高的催化效率.Kcat/Km常用來衡量酶的催化效率, 被稱為特異性常數(shù), 能夠綜合反映酶對底物的親和力和催化能力［29］. 4 種Lip-hNF的反應(yīng)速率Kcat/Km從高到低的順序依次為: Ca/hNF ＞Zn/hNF ＞Mn/hNF ＞Cu/hNF. 與游離脂肪酶相比, 雜化酶的Vm/Km值高于游離脂肪酶, 說明雜化酶的催化效率要強于游離脂肪酶, 雜化酶的Km值和催化效率與Li等［22］和Talbert等［33］制備的雜化納米花呈現(xiàn)相同的趨勢, 固定化酶的Km大于游離脂肪酶, 但雜化酶的Kcat/Km高于游離脂肪酶, 這可能與脂肪酶納米花獨特的花狀結(jié)構(gòu)所具有的高比表面積有關(guān)［34］, 表明納米花狀的雜化酶使酶分子朝著有利于催化水解反應(yīng)速率的方向而改變.

表1 游離脂肪酶和雜化脂肪酶的動力學參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of free lipase and Lip-hNF

2.6 雜化脂肪酶耐受性

雜化酶對于變性劑耐受性如圖9所示, 對于甲醇的耐受性由大到小為: Ca/hNF ＞ Zn/hNF ＞ Mn/hNF ＞Cu/hNF; 對乙醇的耐受性由大到小為: Ca/hNF ＞Cu/hNF ＞ Mn/hNF ＞ Zn/hNF; 在尿素中的酶活均保持在90%以上, 對尿素的耐受性由大到小為Ca/hNF ＞Zn/hNF ＞ Cu/hNF ＞ Mn/hNF. 結(jié)果顯示, 雜化酶在變性劑中維持著良好的水解活性, 對于這3種變性劑的耐受性由高到低的排序為: 尿素 ＞ 乙醇 ＞ 甲醇, 在尿素中的水解活性顯著高于其余3種雜化酶（P＜0.01）.

圖9 雜化脂肪酶在不同變性劑下的耐受性Fig.9 Tolerance of hybrid lipases to different denaturing agents

2.7 雜化脂肪酶重復利用性

脂肪酶被開發(fā)利用, 良好的重復次數(shù)可以極大地降低使用成本, 擴大在工業(yè)上的應(yīng)用, 雜化酶可通過離心的方法重復使用. 如圖10所示, 在重復使用3次后, 4種Lip-hNF的活性仍能保持在60%以上,具有良好的重復使用性.

圖10 雜化脂肪酶的重復利用性Fig.10 Reusability of hybrid lipases

制備的雜化酶催化活性與其他新型固定化酶方法的比較見表2. 與文獻報道的其它固定化酶方法相比, 本法制備出的雜化酶包封率高, 催化活性高,具有良好的重復性和耐受性.

表2 不同方法固定化酶催化性能比較Table 2 Comparison of catalytic performance of immobilized enzymes by different methods

3 結(jié)論

采用Ca、 Mn、 Zn、 Cu 4種金屬鹽對游離脂肪酶進行固定化, 討論了反應(yīng)時間、 反應(yīng)溫度、 pH值對雜化酶水解活性的影響, 得到最優(yōu)反應(yīng)體系: 雜化酶在10 min, 40 ℃, pH=8時的反應(yīng)條件下, 催化水解活性最佳, 為游離脂肪酶催化活性的187%. 經(jīng)紅外光譜及電鏡的表征結(jié)果證明金屬鹽離子改變游離脂肪酶的結(jié)構(gòu)為片狀層級, 增大了比表面積, 有效地提高脂肪酶催化水解活性. 雜化酶的催化活性從大到小的排序為: Ca＞Zn＞Mn＞Cu, 對其動力學參數(shù)進行研究后發(fā)現(xiàn), 4種Lip-hNF的反應(yīng)速率常數(shù)Kcat/Km大于游離脂肪酶, 表現(xiàn)出更高的催化效率. 雜化酶對甲醇、 乙醇、 尿素的耐受性和重復性的考察結(jié)果表明, 在4種Lip-hNF中Ca/hNF具有更高的耐受變性劑能力; 在重復使用3次后, 雜化酶的活性仍能保持在60%以上, 可以看出雜化納米花具有良好的重復使用性. 經(jīng)過4種金屬鹽修飾后脂肪酶的性能均得到有效改善, 其中Ca雜化酶因Ca2+良好的生物相容性對于脂肪酶催化水解性能的改善更佳. 我們制備的雜化納米花狀脂肪酶固定化方法簡單, 綠色高效, 包封率高, 具有良好的應(yīng)用前景.