樂兒康糖漿的質(zhì)量控制

張毅，王仲，楊貴生

(1.武漢市第四醫(yī)院、華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430034；2.武漢華夏理工學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，武漢 430070)

樂兒康糖漿由太子參、桑枝、黃芪、黨參、山藥、麥冬、制何首烏、大棗等13味中藥組成，用于食欲不振、面黃、身瘦等脾胃氣虛、厭食及營(yíng)養(yǎng)不良癥的治療[1]。臨床研究表明，樂兒康制劑能明顯改善小兒食欲差、多汗、夜驚、煩躁、睡眠不安、體質(zhì)量增加緩慢等癥狀[2]；能夠提高患兒免疫球蛋白水平，改善反復(fù)性呼吸道疾病患兒免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體抗病能力，降低呼吸道感染發(fā)生率[3]。中藥及其制劑是多成分的集合體，各種成分具有不同的化學(xué)性質(zhì)和藥理作用，相互協(xié)調(diào)、相互制約，最終達(dá)到臨床的治療效果，多指標(biāo)成分控制模式近年來已廣泛應(yīng)用于中藥及其制劑的質(zhì)量控制中[4-5]。樂兒康糖漿現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]單一成分質(zhì)量控制難以全面反映其整體質(zhì)量，筆者暫未檢索到對(duì)該制劑多成分質(zhì)量控制的文獻(xiàn)報(bào)道，為全面評(píng)價(jià)樂兒康糖漿的整體質(zhì)量，在本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜(HPLC)梯度洗脫法對(duì)樂兒康糖漿中太子參環(huán)肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，同時(shí)采用SPSS 26.0 版軟件對(duì)多組分含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行聚類分析和主成分分析，有利于指導(dǎo)藥品生產(chǎn)企業(yè)不斷改進(jìn)生產(chǎn)工藝過程控制，穩(wěn)定原藥材產(chǎn)地來源，最終達(dá)到產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性和臨床療效的一致性。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Shimadzu LC-20AT型高效液相色譜儀，配備SPD-10AVP可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器(日本Shimadzu公司)；BT-25S型電子天平(德國(guó)Sartorius公司，感量：0.01 mg)；Agilent TC-C18色譜柱(美國(guó)Agilent公司)。

1.2試藥 毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品(批號(hào)：111920-201907，含量：96.8%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；太子參環(huán)肽B對(duì)照品(批號(hào)：18031328，含量：99.9%)、桑皮苷A對(duì)照品(批號(hào)：17060822，含量：99.5%)購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司；芒柄花苷對(duì)照品(批號(hào)：PRF8081121，含量：99.6%)、芒柄花素對(duì)照品(批號(hào)：PRF8091225，含量：99.9%)、桑辛素對(duì)照品(批號(hào)：14030714，含量：99.6%)均購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；二氫桑色素對(duì)照品(批號(hào)：CFS201802，含量：98.0%)、桑辛素M對(duì)照品(批號(hào)：CFS201801，含量：98.0%)均購自武漢天植生物技術(shù)有限公司；乙腈為色譜純(德國(guó)Merck公司)，其他試劑為分析純；樂兒康糖漿(規(guī)格：每瓶裝100 mL；批號(hào)：20181202，20190101，20190201，20190301，20190501，20190901，20190902，編號(hào)：S1～S7，購自長(zhǎng)春英平藥業(yè)有限公司；批號(hào)：190203，190401，200102，編號(hào)：S8～S10，購自通藥制藥集團(tuán)股份有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1對(duì)照品貯備液及混合對(duì)照品溶液 精密稱取太子參環(huán)肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素對(duì)照品適量，用甲醇制成濃度分別為0.172，0.438，0.374，0.152，0.528，0.342，0.994和0.236 mg·mL-1混合對(duì)照品貯備液；精密量取混合對(duì)照品貯備液2.5 mL，置50 mL量瓶，用甲醇稀釋至刻度，制成濃度分別為8.6，21.9，18.7，7.6，26.4，17.1，49.7和11.8 μg·mL-1混合對(duì)照品溶液。

2.1.2供試品溶液及陰性樣品溶液 精密量取樂兒康糖漿5.0 mL，置25 mL量瓶，用甲醇稀釋至刻度，經(jīng)孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，制得樂兒康糖漿供試品溶液；按《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部中樂兒康糖漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下的處方工藝，分別制備缺太子參、缺桑枝、缺黃芪的陰性樣品，再上述方法制成陰性樣品溶液。

2.2色譜條件及專屬性實(shí)驗(yàn) Agilent TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫25 ℃；流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～9.0 min，38.0%A；9.0～14.0 min，38.0%A～46.0%A；14.0～23.0 min，46.0%A～55.0%A；23.0～37.0 min，55.0%A～72.0%A；37.0～44.0 min，72.0%A～80.0%A；44.0～50.0 min，80.0%A～38.0%A)，流速0.8 mL·min-1；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)分別為203 nm[6-7](0～14.0 min檢測(cè)太子參環(huán)肽B)、305 nm[8-9](14.0～23.0 min檢測(cè)桑皮苷A、桑辛素M和二氫桑色素)和254 nm[10-11](23.0～50.0 min檢測(cè)毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素)。精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液及“2.1.2”項(xiàng)下各溶液依法進(jìn)樣檢測(cè)，色譜圖見圖1。由此可知，在與混合對(duì)照品色譜圖中8種成分色譜峰的相應(yīng)保留時(shí)間處，供試品色譜圖中太子參環(huán)肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素色譜峰峰形對(duì)稱，分離度均>1.5，理論板數(shù)按各成分色譜峰計(jì)均≥4500；太子參陰性樣品色譜圖中未見太子參環(huán)肽B色譜峰，桑枝陰性樣品色譜圖中未見桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素和桑辛素色譜峰，黃芪陰性樣品色譜圖中未見毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和芒柄花素色譜峰，表明陰性樣品對(duì)樂兒康糖漿中8種成分的同時(shí)測(cè)定無干擾，該方法專屬性良好。

2.3線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)混合對(duì)照品貯備液0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0 mL，分別用甲醇稀釋至20 mL，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下依次進(jìn)樣檢測(cè)太子參環(huán)肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素的峰面積，以質(zhì)量濃度(C，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1。表明太子參環(huán)肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 8種成分的線性關(guān)系

2.4精密度實(shí)驗(yàn)、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得太子參環(huán)肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素峰面積RSD分別為1.21%，1.08%，1.10%，1.33%，0.85%，0.99%，0.62%和1.14%。

按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備同一批次樂兒康糖漿樣品6份供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定太子參環(huán)肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素的峰面積，計(jì)算得8種成分含量的RSD分別為1.74%，1.59%，1.63%，0.87%，1.32%，1.71%，1.06%和1.54%。

取臨用新配的同一份樂兒康糖漿供試品溶液，于制備后0，2，4，6，12，18 h進(jìn)樣檢測(cè)太子參環(huán)肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素的峰面積，結(jié)果樂兒康糖漿供試品溶液18 h內(nèi)穩(wěn)定，8種成分峰面積的RSD分別為1.20%，1.06%，1.14%，1.35%，0.89%，1.01%，0.59%和1.11%。

2.5加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取8種成分含量已知的同一批次樂兒康糖漿樣品適量，精密量取2.5 mL，共9份，置25 mL量瓶，按照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部要求分別精密加入根據(jù)8種成分含量另行配制的混合對(duì)照品溶液(太子參環(huán)肽B 0.118 mg·mL-1、桑皮苷A0.292 mg·mL-1、桑辛素M 0.206 mg·mL-1、二氫桑色素0.084 mg·mL-1、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.346 mg·mL-1、芒柄花苷0.242 mg·mL-1、芒柄花素0.654 mg·mL-1和桑辛素0.172 mg·mL-1)0.5，1.0，1.5 mL各3份，使各成分對(duì)照品加入量約為樣品含量的50%，100%和150%，再按“2.1.2”項(xiàng)方法制成加樣供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)太子參環(huán)肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素的峰面積，計(jì)算8種成分的含量，結(jié)果8種成分的平均加樣回收率分別為98.51%，99.38%，97.72%，96.96%，98.70%，97.91%，100.08%和99.03%，RSD分別為1.15%，0.92%，1.36%，1.25%，1.47%，1.12%，0.76%和0.83%。

2.6含量測(cè)定 取樂兒康糖漿樣品10批，按“2.2.2”項(xiàng)方法制備樣品溶液(每批制備樣品溶液3份)，在上述色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)，采用外標(biāo)法計(jì)算太子參環(huán)肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素的含量，檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 樂兒康糖漿中8種成分含量測(cè)定結(jié)果

2.7基于化學(xué)計(jì)量學(xué)的樂兒康糖漿質(zhì)量分析

2.7.1聚類分析 以10批樂兒康糖漿中太子參環(huán)肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素含量為變量，采用SPSS 26.0版軟件組間聯(lián)接系統(tǒng)聚類方法，以歐氏距離為測(cè)量區(qū)間進(jìn)行聚類分析，考察不同廠家樂兒康糖漿的含量差異，聚類分析結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，當(dāng)類間距離為15時(shí)，10批樂兒康糖漿樣品聚為2類，S4、S6、S1、S7、S2、S5和S3聚為第Ⅰ類；S8、S10和S9聚為第Ⅱ類。

圖2 10批樂兒康糖漿聚類分析圖

2.7.2主成分分析 將10批樂兒康糖漿中太子參環(huán)肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素含量測(cè)定結(jié)果導(dǎo)入SPSS 26.0版軟件，進(jìn)行主成分分析，計(jì)算特征值和方差貢獻(xiàn)率，得到特征值和方差貢獻(xiàn)率(表3)、主成分分析碎石圖(圖3)。以特征值>1為標(biāo)準(zhǔn)，得到2個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為88.113%，大于85%，表明主成分1～2是影響樂兒康糖漿質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要因子。

圖3 主成分分析碎石圖

表3 特征值和方差貢獻(xiàn)率

3 討論

3.1成分選擇 黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素等黃酮類以及黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅱ等皂苷類為其主要活性成分；太子參為石竹科植物孩兒參的干燥塊根，太子參環(huán)肽B、太子參環(huán)肽A等環(huán)肽類為其特征性處分；桑枝為?？浦参锷５母稍锬壑?，主要含有多酚類、生物堿類成分，其中桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、桑辛素等為其多酚類代表性成分。同時(shí)考慮到黃芪皂苷類化合物沒有紫外吸收或只在200 nm處有微弱吸收，常規(guī)的樣品處理方法難以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，且黃芪皂苷種類較多，紫外檢測(cè)器難以有效分離，本實(shí)驗(yàn)參考中藥標(biāo)志物確認(rèn)原則，選取君藥黃芪所含活性成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和芒柄花素，臣藥太子參特征成分太子參環(huán)肽B，佐藥桑枝的代表性成分桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素和桑辛素為定量測(cè)定目標(biāo)成分，為全面評(píng)價(jià)樂兒康糖漿的整體質(zhì)量提供支持。

3.2流動(dòng)相選擇 本實(shí)驗(yàn)考慮到甲醇存在末端吸收，首先選用乙腈-水[6-7，11]流動(dòng)相體系進(jìn)行梯度洗脫同時(shí)檢測(cè)樂兒康糖漿中的太子參環(huán)肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基線漂移嚴(yán)重，檢測(cè)用時(shí)較長(zhǎng)，部分色譜峰對(duì)稱度不佳?？紤]加入酸溶液加以糾正和改善，進(jìn)而對(duì)乙腈-0.1%醋酸溶液[8]、乙腈-0.1%磷酸溶液[9]和乙腈-0.1%甲酸溶液[10]3個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相系統(tǒng)時(shí)，色譜圖基線平移，供試品中8種待測(cè)成分峰形對(duì)稱，與相鄰色譜峰能夠達(dá)到有效分離。故采用乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相按照正文“2.2”項(xiàng)下流動(dòng)相比例對(duì)樂兒康糖漿中太子參環(huán)肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。

筆者在本實(shí)驗(yàn)采用HPLC梯度洗脫法對(duì)樂兒康糖漿中太子參環(huán)肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素含量進(jìn)行了同時(shí)測(cè)定，建立了樂兒康糖漿多指標(biāo)成分質(zhì)量控制方法，所建立的方法簡(jiǎn)便快捷，準(zhǔn)確度高，專屬性強(qiáng)，能夠?yàn)槿嬖u(píng)價(jià)樂兒康糖漿整體質(zhì)量提供參考依據(jù)。從8種成分含量檢測(cè)結(jié)果及化學(xué)計(jì)量學(xué)分析結(jié)果來看，同一廠家生產(chǎn)的樂兒康糖漿產(chǎn)品質(zhì)量差異較小，不同廠家樂兒康糖漿產(chǎn)品質(zhì)量存在一定差異，可能與樂兒康糖漿制劑生產(chǎn)過程控制參數(shù)以及原藥材產(chǎn)地、采收季節(jié)等差異有關(guān)，需引起生產(chǎn)企業(yè)關(guān)注，同時(shí)也表明建立多成分質(zhì)量控制模式對(duì)確保中成藥復(fù)方制劑質(zhì)量穩(wěn)定性和臨床療效的一致性具有重要意義。