UBE2T基因對卵巢癌細胞增殖的調控作用及其機制

趙楠，鄒麗娟，蘇晗，薛暉

（中國醫(yī)科大學 1.附屬第一醫(yī)院婦科，沈陽 110001；2.附屬第四醫(yī)院檢驗科，沈陽 110032；3.附屬盛京醫(yī)院設備科，沈陽 110004）

卵巢癌是最致命的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤［1］，盡管手術技術、化療和免疫療法取得了重大進展，但目前的治療效果仍不理想［2］。由于卵巢癌缺乏特定的早期癥狀和有效的早期檢測策略，只有不到一半的女性在診斷后存活時間超過5年［3］。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)高靈敏度和特異度的生物標志物并闡明其在卵巢癌中的作用。

腫瘤微環(huán)境由多種與腫瘤生長相關的細胞和非細胞成分組成，其在腫瘤進展中的作用以及與癌癥免疫治療的相關性已被廣泛證明［4］。泛素化相關酶是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，這些酶包括泛素激活酶E1、泛素結合酶E2（ubiquitin binding enzyme E2，UBE2）和泛素連接酶E3，它們促進腫瘤細胞泛素化并導致蛋白酶體介導的蛋白質降解［5］。UBE2家族由40個成員組成，它們被認為是泛素化級聯(lián)反應的關鍵，并參與各種促腫瘤過程。研究［6］表明，UBE2家族成員可以作為腫瘤診斷和治療標志物。

腫瘤微環(huán)境中，UBE2失調會影響患者的預后和化療耐藥性。最近的研究［7］結果表明，UBE2A、UBE2B和UBE2C上調與卵巢癌患者的不良預后相關。此外，UBE2F、UBE2M和UBE2N的異常表達與卵巢癌中紫杉醇化學抗性有關［8］。同時有研究［9］表明，UBE2S和UBE2V2參與婦科腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，包括乳腺癌。UBE2T是UBE2家族的成員，多項研究證實UBE2T在肝細胞癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等多種癌癥中具有致癌作用，但其在卵巢癌中的表達水平和調控機制仍不清楚。本研究檢測了UBE2T在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達，并通過細胞實驗探討其作用機制，從而為卵巢癌的診斷和治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本收集：收集2010年1月至2020年12月于中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦科行卵巢切除術的52例卵巢癌患者的卵巢癌組織和癌旁組織樣本。患者年齡35～73歲，平均61.4歲；臨床分期按1997年國際抗癌聯(lián)盟TNM分期，Ⅰ期20例，Ⅱ期32例；有淋巴結轉移 29例，無淋巴結轉移23例。所有患者術前均未接受放化療。本研究獲得中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準。

1.1.2 細胞系：人卵巢癌細胞SKOV3購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.1.3 主要試劑：McCoy’s 5A培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（天津市灝洋生物制品科技有限責任公司）；TRIzol試劑、Lipofectamine2000、cDNA-UBE2T和陰性對照（美國Invitrogen公司）；PrimeScript逆轉錄試劑盒、SYBR PCR Master Mix（寶生物工程有限公司）；MTT試劑（美國Sigma公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、化學發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；PVDF膜（美國Millipore公司）；UBE2T、GAPDH抗體、HRP標記二抗（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析：基因表達譜交互分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）是來自癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和基因型-組織表達數(shù)據(jù)庫（Genotype-Tissue Expression Dataset，GTEx）的RNA測序表達數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫，包括33種腫瘤類型、9 736個腫瘤樣本和超過8 726個正常樣本。檢索GEPIA數(shù)據(jù)庫，獲得426例卵巢癌組織和88例正常組織的生物學信息，在mRNA水平比較UBE2T在癌組織和正常組織中的表達差異。

1.2.2 細胞培養(yǎng)和轉染：采用10% FACS的McCoy’s 5A完全培養(yǎng)基進行SKOV3細胞培養(yǎng)，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)和傳代。參照Lipofectamine 2000說明書轉染cDNA-UBE2T，誘導UBE2T過表達。

1.2.3 細胞分組：將SKOV3細胞分為陰性轉染組（NC組）和UBE2T過表達轉染組（cDNA-UBE2T組），分別轉染陰性質粒和cDNA-UBE2T質粒。

1.2.4 實時熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR）：采用TRIzol試劑提取細胞內(nèi)總RNA，逆轉錄獲取 cDNA后進行qRT-PCR，定量分析采用2-ΔΔCt法，選取GAPDH為內(nèi)參，目的基因和內(nèi)參擴增產(chǎn)物熒光強度比值代表目的基因相對表達水平，實驗重復3次，H2O作為陰性對照。根據(jù)試劑盒說明書要求的體系（5 μL 2× SYBR，0.2 μL上游引物，0.2 μL下游引物，0.2 μL ROX，1 μL cDNA，3.4 μL DEPC 水），進行PCR檢測。擴增條件：95 ℃預變性15 min，94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。引物序列：UBE2T，正向5’-GGCAAGATAAAGAC CAAATGGA-3’，反 向5’-CCTACTAGCTGACTGGCC TT-3’；GAPDH，正向5’-ATCACTGCCACCCAGAAG ACT-3’，反 向5’-CTGTTGAAGTCAGAGGAGACCA C-3’。

1.2.5 Western blotting：將轉染和未轉染UBE2T的細胞培養(yǎng)48 h后，使用RIPA裂解液充分裂解細胞，高速低溫離心后收集上清液，并用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。配置10% SDS-PAGE凝膠，取45 μg變性蛋白樣品上樣，于110 V電壓下電泳75 min。利用濕轉法將蛋白轉印在PVDF膜上，將膜置于3%牛血清白蛋白中室溫下封閉60 min。隨后，4 ℃下與一抗（1 ∶1 000稀釋）孵育16 h，TBST清洗3次后，再與二抗（1 ∶10 000稀釋）室溫孵育1 h，發(fā)光顯色以檢測目標蛋白的表達。

1.2.6 MTT法檢測細胞增殖：細胞以6×103/孔密度在96孔板中鋪板，培養(yǎng)24、48、72、96 h后，加入MTT（5 mg/mL），隨后溶于DMSO（100 μL/孔），酶標儀檢測吸光度值，波長490 nm，實驗重復3次。

1.2.7 彗星實驗（單細胞凝膠電泳）測定細胞DNA損傷斷裂情況：破壞細胞膜、細胞核后，將細胞與低熔點瓊脂糖充分混合，鋪于載玻片上。凝固后裂解、解螺旋、電泳。2.5 mmol/L碘化丙啶染色后，熒光顯微鏡下觀察并拍照，用CASP1.01軟件分析處理。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad 7.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，2組比較采用Studentt檢驗。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 UBE2T在卵巢癌組織中的表達

通過GEPIA網(wǎng)站分析TCGA和GTEx兩個數(shù)據(jù)庫中卵巢癌組織和正常組織的基因表達（|log2FC|＞1，卵巢癌組織426例，正常組織88例），結果顯示，卵巢癌組織中UBE2TmRNA的表達量明顯高于正常組織（P＜ 0.01）。見圖1。

圖1 GEPIA網(wǎng)站分析卵巢癌組織和正常組織中UBE2T的表達水平Fig.1 UBE2T expression in ovarian cancer and normal tissues analyzed in the GEPIA website

通過qRT-PCR檢測UBE2T在52對卵巢癌組織和癌旁組織的差異表達，結果顯示，卵巢癌組織中UBE2TmRNA的表達水平明顯高于癌旁組織（P＜0.05）。見圖2。

圖2 qRT-PCR檢測卵巢癌組織和癌旁組織中UBE2T的表達水平Fig.2 UBE2T expression in ovarian cancer and adjacent tissues detected by qRT-PCR

2.2 UBE2T過表達后SKOV3細胞增殖能力增加

上述結果提示，UBE2T可能具有癌基因作用，因此進行體外細胞實驗確認。將cDNA-UBE2T質粒轉染入SKOV3細胞中，Western blotting結果顯示，與陰性對照組比較，細胞轉染cDNA-UBE2T后，UBE2T表達明顯增加（圖3A），表明UBE2T高表達細胞模型成功建立。采用MTT法檢測卵巢癌細胞增殖水平的變化，結果表明，UBE2T基因過表達可使SKOV3細胞增殖活性增加（圖3B），提示UBE2T促卵巢癌作用與其對細胞增殖的影響有關。

圖3 UBE2T過表達對SKOV3細胞增殖的影響Fig.3 Effect of UBE2T overexpression on the proliferation of SKOV3 cells

2.3 UBE2T過表達后可抑制SKOV3細胞FA/BRCA通路活化

UBE2T可作為FA/BRCA通路重要成員參與DNA損傷修復，為了初步探討UBE2T促進卵巢癌細胞增殖的分子機制，采用Western blotting檢測FA/BRCA通路關鍵蛋白FANCF和FANCD2表達的變化。結果發(fā)現(xiàn)，UBE2T過表達后，SKOV3細胞中FANCF和FANCD2蛋白表達均增加（圖4），提示UBE2T可能通過影響FA/BRCA通路活性表達調控細胞增殖。

圖4 UBE2T過表達對SKOV3細胞中FANCF和FANCD2蛋白表達的影響Fig.4 Effect of UBE2T overexpression on the expression of FANCF and FANCD2 proteins in SKOV3 cells

2.4 UBE2T過表達后可抑制SKOV3細胞DNA損傷

上述結果提示，UBE2T過表達后可促進SKOV3細胞FA/BRCA通路活化，進一步給予化療藥物順鉑（CDDP組）處理SKOV3細胞，通過彗星實驗檢測DNA損傷。與陰性對照組（NC組）相比，CDDP組拖尾長度增加，UBE2T過表達后（CDDP+cDNA-UBE2T組）SKOV3細胞拖尾長度明顯減少。見圖5。

圖5 彗星實驗檢測UBE2T過表達對卵巢癌細胞DNA損傷情況的影響Fig.5 Effect of UBE2T overexpression on DNA fragmentation in ovarian cancer cells detected by comet assay

3 討論

在全世界范圍內(nèi)，卵巢癌是每年死亡人數(shù)最多的婦科癌癥。盡管在過去幾十年中，卵巢癌的治療取得了重大進展，但其復發(fā)率仍然很高。目前，卵巢癌的治療旨在延緩疾病進展，并延長每次化療間的時間間隔，使患者推遲并避免與進一步化療相關的毒性反應。因此，越來越多的研究人員致力于尋找與卵巢癌相關的生物標志物，進而探索潛在的治療靶點。

研究［10］表明，UBE2T（又稱HSPC150）是泛素-蛋白酶體途徑的E2家族成員，位于染色體1q32.1，UBE2T泛素化FANCD2并誘導DNA損傷反應，DNA損傷反應在范科尼貧血通路中起重要作用。UBE2結合酶在各種腫瘤的形成和進展中起核心作用。研究［11］表明，UBE2T在肝癌、結直腸癌等癌癥中表達顯著上調，UBE2T通過p53泛素化促進肝癌和結直腸癌細胞生長。UBE2T通過誘導上皮-間質轉化和泛素化介導的FOXO1降解，促進非小細胞肺癌的抗輻射能力［12］，但其在卵巢癌中的作用尚不清楚。本研究結果提示，UBE2T在卵巢癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織，并通過細胞實驗進一步驗證了卵巢癌細胞過表達UBE2T后細胞增殖活性增加，提示其可能發(fā)揮促癌作用。

UBE2T發(fā)揮促癌作用的分子機制目前尚未完全闡明。最新的研究［13］發(fā)現(xiàn)，一種新的UBE2T抑制劑通過阻斷RACK1泛素化，抑制Wnt/β-catenin信號通路的過度激活和胃癌進展。研究［14］報道，UBE2T可作為FA/BRCA通路重要成員參與DNA損傷修復，正常情況下DNA損傷后可激活FA/BRCA通路，泛素激活酶E1將泛素分子傳遞UBE2T，UBE2T將泛素分子傳遞給FA/BRCA通路核心復合體（FANCA、FANCB、FANCC、FANCE、FANCF、FANCG、FANCL和FANCM）；核心復合體將泛素分子傳遞給FANCD2，誘導FANCD2單泛素化，進而向細胞核DNA損傷點聚集，促進DNA損傷修復，維持基因組完整性。本研究發(fā)現(xiàn)，UBE2T過表達可誘導DNA損傷修復FA/BRCA通路關鍵蛋白FANCF和FANCD2表達增加，提示FA/BRCA通路途徑可能是UBE2T在卵巢癌中發(fā)揮促癌作用的重要機制之一。本課題組后續(xù)將開展該靶點的藥物設計，為卵巢癌的治療提供新的化合物。

綜上所述，本研究結果表明，UBE2T是調控卵巢癌細胞增殖的重要基因，其作用機制可能與對DNA損傷修復通路FA/BRCA的調控作用有關。