α-半乳糖苷酶A基因敲除豬胎兒成纖維細胞系的建立

冷允俊，劉曉蕊，李琳，王盈，楊海元，戴一凡

（南京醫(yī)科大學江蘇省異種移植重點實驗室，南京 211166）

Fabry病，又稱彌漫性血管角質(zhì)瘤，是一種X連鎖隱性遺傳的溶酶體貯積病，致病基因為α-半乳糖苷酶A（α-galactosidase A，GLA）基因，位于Xq22.1，由7個外顯子和6個內(nèi)含子構成［1］。GLA基因編碼α-Gal A，該酶位于溶酶體內(nèi)，是一種同源二聚體蛋白，為神經(jīng)酰胺三己糖苷（globotriaosylceramide，Gb3）分解代謝所必須。GLA基因的突變可引起α-Gal A功能部分或完全喪失，導致其代謝底物Gb3和相關鞘糖脂在人體的各器官、組織內(nèi)積聚，造成多系統(tǒng)損害［2］。流行病學研究［3］顯示，F(xiàn)abry病的患病率為1 ∶117 000～1 ∶40 000，但這一患病率可能被低估，在一些國家的新生兒篩查中，患病率在1 ∶8 882～1 ∶1 368之間［4］。一項荷蘭的隊列研究［5］顯示，受影響男性和女性的預期壽命的中位數(shù)分別為57歲和72歲。目前，F(xiàn)abry病尚無治愈方法，主要采用人工重組α-Gal A治療［6-7］。

目前，F(xiàn)abry病的動物模型只有小鼠和大鼠，而小鼠和大鼠距離人類的親緣關系較遠，不能很好地復制Fabry病的病理過程。豬是除靈長類動物外與人類親緣關系最近的物種之一，其解剖結構、生理生化指標、藥物代謝和疾病發(fā)生發(fā)展等與人類十分相似。因此，豬是Fabry病模型的良好選擇。建立人類Fabry病豬模型，有助于研究該病的病理過程，篩選藥物和尋找特異性的生物標志等［8-9］。本研究通過生物信息學分析，比較了人/豬α-Gal A的相似性，并鑒別了豬α-Gal A的催化殘基位置，為Fabry病豬模型的構建提供了理論支持；利用CRISPR/Cas9技術構建了GLA基因敲除的巴馬公豬胎兒成纖維細胞（porcine fetal fibroblasts，PFFs），為構建Fabry病動物模型提供實驗材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：35 d的巴馬公豬PFFs為本實驗室留存。

1.1.2 主要試劑與儀器：pX330質(zhì)粒（貨號42230）購自美國Addgene公司；DH5α感受態(tài)細胞和質(zhì)粒抽提試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司；BbsⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶和T7E1酶均購自美國New England Biolabs公司；Basic NucleofectorTMKits購自德國Lonza公司；DMEM培養(yǎng)液、G418藥物、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青鏈霉素雙抗和DPBS緩沖液均購自美國賽默飛世爾科技公司。單孔細胞核轉(zhuǎn)染儀購自德國Lonza公司；生物安全柜購自美國賽默飛世爾科技公司。引物合成與DNA測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 人/豬α-Gal A的生物信息學分析：在NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載包括人和豬在內(nèi)的16個物種的α-Gal A的氨基酸序列，采用MEGA X軟件繪制系統(tǒng)進化樹。采用DNAMAN軟件對人和豬α-Gal A氨基酸序列進行比對，再用BLAST在線工具（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中的Global Align程序計算二者的一致性和相似性。采用DNASTAR軟件中的Protein模塊，對人/豬α-Gal A進行二級結構分析，使用Chou-Fasman算法預測人/豬α-Gal A的α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角的比例。使用 Swiss Model在線工具（https：//swissmodel.expasy.org/）對人/豬α-Gal A進行三維結構模擬，然后采用PyMOL軟件比較兩者三維結構的相似度，計算均方根偏差（root mean square displacement，RMSD）值。

1.2.2 豬α-Gal A催化殘基的鑒別：使用在線工具BLAST中的CD-search程序，尋找豬α-Gal A的結構域和催化殘基。輸入豬α-Gal A的氨基酸序列，數(shù)據(jù)庫選擇保守結構域數(shù)據(jù)庫（conserved domain database，CDD），為避免假陽性的出現(xiàn)，E值選擇默認值0.01。

1.2.3 CRISPR/Cas9的靶點設計和打靶載體構建：根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的GLA基因序列，針對第三外顯子設計擴增引物（反向引物序列為CCTGCCTGGAG TGTTTTTCTC；正向引物序列為TACTGAGGAAAGC CAGGGATG），進行PCR擴增測序，確定真實序列與數(shù)據(jù)庫中GLA基因的差異。為確保酶完全失活，根據(jù)在線工具CRISPOR（http：//crispor.tefor.net/），在編碼催化殘基前的區(qū)域設計單鏈向?qū)NA（single guide RNA，sgRNA），并設計Oligo合成（GLA_sgRNA反向引物序列為CACCGTTGATCTGCTCAAATTCGA，GLA_sgRNA正向引物序列為AAACTCGAATTTGAGCAGA TCAAC）。載體構建的步驟包括引物退火、載體酶切和連接。用去離子水將sgRNA Oligo稀釋至100 μmol/L。反應體系包括正鏈Oligo 1 μL，負鏈Oligo 1 μL，去離子水8 μL。37℃ 30 min，95 ℃ 5 min，再以-5 ℃/min的速度降至25 ℃。用BbsⅠ限制性內(nèi)切酶對pX330質(zhì)粒進行線性化，連接退火產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細胞。挑取單菌落，測序鑒定。對連接成功的菌株進行擴增，利用試劑盒提取質(zhì)粒。

1.2.4 細胞轉(zhuǎn)染與單克隆細胞的篩選：在6 cm培養(yǎng)皿內(nèi)復蘇原代巴馬豬PFFs（約2.6×106個），用含16%胎牛血清的全培養(yǎng)基（42 mL DMEM培養(yǎng)液、8 mL胎牛血清和500 μL青鏈霉素雙抗），38.5 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)約24 h，至細胞融合度達到90%以上。用0.05%胰酶消化2 min，1 200 r/min離心收集細胞。取5 μg打靶載體pX330-GLA和1 μg抗性質(zhì)粒pHY54 SV40-neo，按照Lonza核轉(zhuǎn)染試劑盒說明書轉(zhuǎn)染細胞，程序為U-023。轉(zhuǎn)染結束后，將細胞分盤至10 cm培養(yǎng)皿中，密度控制在4倍鏡視野下細胞數(shù)約為30～40個。細胞培養(yǎng)24 h后，加1 mg/mL G418進行篩選。根據(jù)細胞狀態(tài)降低藥物濃度，藥物篩選約9～12 d，四倍鏡下觀察細胞狀態(tài)，單克隆長滿1個四倍鏡視野時，用記號筆在皿底圈出。DPBS清洗2遍，在標記處放置克隆環(huán)，加入0.25%胰蛋白酶，消化約2 min。無藥全培養(yǎng)基終止消化，細胞懸液移至24孔板中，待細胞長滿后，消化至12孔板中培養(yǎng)。留部分細胞在24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，長滿后消化并用NP40裂解細胞，提取基因組DNA用于PCR測序鑒定。

1.2.5 T7E1酶切法檢測突變效率：將轉(zhuǎn)染后未分盤的細胞放入6 cm培養(yǎng)皿中，24 h后換藥培養(yǎng)，待細胞長滿后，消化提取基因組。PCR擴增并回收目的片段。T7E1酶切體系包括純化產(chǎn)物200 ng，10×NEB Buffer 2 2 μL，去離子水補至19 μL。PCR儀中退火，95 ℃ 5 min，-2 ℃/s，降至85 ℃；-0.1 ℃/s，降至25℃；4 ℃保存。體系中加入1 μL T7E1酶，37 ℃孵育15 min。之后每管加入4 μL 6×loading buffer，2%瓊脂糖凝膠電泳1.5 h。計算突變效率，InDel（%）=［1-（1-裂解產(chǎn)物占比）1/2］×100。

2 結果

2.1 人/豬α-Gal A的相似性

用MEGA X軟件繪制系統(tǒng)進化樹，結果顯示，與小鼠、大鼠和多種常見家畜相比，豬的進化距離與人更近（圖1）。二者的氨基酸序列一致性為81%，相似性為89%。使用Chou-Fasman算法預測的人/豬α-Gal A的二級結構比例結果顯示，人α-Gal A的α螺旋占29.4%，β折疊占19.8%，β轉(zhuǎn)角占35.4%；豬α-Gal A的α螺旋占28.9%，β折疊占21.5%，β轉(zhuǎn)角占35.1%（圖2B）。二級結構的比例和排布十分相似，提示其三維結構也可能極其相似。采用Swiss Model在線工具對人/豬α-Gal A進行三維建模，再利用PyMOL軟件比較兩者三維結構的相似度，結果顯示，RMSD值為0.012，亦說明其三維結構極其相似（圖2C）。通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)人/豬α-Gal A在結構上高度相似，推測豬α-Gal A的功能和特征也可能與人高度相似，還需在體水平進一步驗證。

圖1 不同物種α-Gal A的系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of α-Gal A in different species

圖2 人/豬α-Gal A的一級、二級和三級結構分析Fig.2 Analysis of α-galactosidase A primary，secondary，and three-dimensional structures between human and pig

2.2 豬α-Gal A催化殘基的鑒別

人α-Gal A的結構已被揭示，是一種同源二聚體蛋白，每個單體由2個結構域組成，分別是含有活性位點的一個（β/α）8桶狀結構域和一個靠近C端含8條反向平行β折疊的結構域［10］。通過BLAST的CDsearch程序查詢，找到豬α-Gal A的結構域也有2個，分別是43～326位殘基的含活性位點的結構域和靠近C端的329～415位殘基的結構域（圖3A）。糖苷酶的催化機制是通過雙重置換催化機制實現(xiàn)的，其中人α-Gal A的2次親核攻擊來自于第170位和第231位的天冬氨酸，對應于豬則是第174位和第235位的天冬氨酸（圖3B）［10-11］。

圖3 豬α-Gal A的結構域和催化殘基的鑒別Fig.3 Identification of domains and catalytic residues of pig α-Gal A

2.3 CRISPR/Cas9打靶載體的構建

為確保豬GLA基因編碼的α-Gal A完全失活，選擇在編碼第174位催化殘基前的外顯子區(qū)設計sgRNA［12］。測序結果如圖4所示，pX330載體中成功插入了豬GLA基因靶點的sgRNA序列。

圖4 GLA基因靶點和重組載體測序Fig.4 Target of GLA gene and sequencing of recombinant vectors

2.4 GLA基因敲除細胞系的鑒定

經(jīng)測序鑒定，共獲得52個陽性單克隆細胞。圖5和表1展示了5種突變型，均造成移碼突變，導致編碼催化殘基的區(qū)域被破壞。

表1 GLA敲除PFFs的基因型Tab.1 Genotypes of GLA-knockout PFFs

圖5 GLA敲除PFFs的測序結果Fig.5 Sequencing results of GLA-knockout PFFs

2.5 T7E1酶切實驗驗證sgRNA的突變效率

PCR產(chǎn)物退火，再經(jīng)過T7E1酶切后行凝膠電泳，結果顯示目的片段被切成2段（圖6）。通過公式計算得出突變效率為17.17%。

圖6 sgRNA突變效率的T7E1酶切驗證Fig.6 T7E1 cleavage assay of sgRNA mutation efficiency

3 討論

Fabry病是一種X連鎖的溶酶體貯積病。目前，F(xiàn)abry病的動物模型只有小鼠和大鼠，但其病理表現(xiàn)，如血管角質(zhì)瘤、眼部和腦血管等并發(fā)癥均表現(xiàn)不完全［13-15］。因此，開發(fā)一種更好的動物模型有助于深入研究Fabry病的病理機制和診療策略。豬的心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、皮膚、營養(yǎng)需要、骨骼發(fā)育及礦物質(zhì)代謝等與人相似，體型大小與人接近，繁殖數(shù)量多，周期短，是極佳的模型動物［16］。豬模型不僅能很好地復制多種小鼠不能準確和全面體現(xiàn)的人類疾病，還能提供更好的后期實驗或試藥條件［17-18］。本實驗室已制備了ApoE基因敲除豬，成功復制了動脈粥樣硬化模型［19］。還實現(xiàn)了GGTA1、β4GalNT2和CMAH三基因敲除的豬，為異種移植提供了可能［20］。

由于GLA基因位于X染色體，本研究選擇巴馬公豬的細胞進行敲除，以避免雜合敲除的情況。本研究利用生物信息學方法對人/豬GLA基因編碼的α-Gal A相似性進行分析，并鑒定出豬α-Gal A的催化殘基位置。為確保酶完全失活，通過在線工具在豬α-Gal A編碼催化殘基前的外顯子區(qū)制造移碼突變，成功構建CRISPR/Cas9打靶載體，將打靶載體與抗性質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至巴馬公豬胎兒PFFs，用G418藥物篩選出單克隆細胞，并行PCR測序鑒定其基因型。結果顯示，人/豬α-Gal A的氨基酸序列一致性為81%，相似性為89%；三維結構的RMSD值為0.012。豬α-Gal A的催化殘基是第174位和第235位的天冬氨酸。

綜上所述，本研究成功地構建了GLA基因敲除的巴馬公豬PFFs，為后續(xù)體細胞核移植和胚胎移植提供了供體細胞，為構建人類Fabry病豬模型奠定了研究基礎，為人類Fabry病的進一步探索提供了合適的動物模型。