清解化攻方調節(jié)重癥急性胰腺炎模型大鼠腸道菌群及對腸黏膜屏障的影響Δ

秦百君，唐曦平，楊昕，楊蕾，馮敏超，張馳，洪曉華，藍艷梅，陳國忠（1.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院脾胃科，南寧 500；.廣西中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，南寧 50001；.廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院胰腺內(nèi)科，南寧 5001；.仁壽縣中醫(yī)院內(nèi)科，四川 眉山 60500）

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是由胰蛋白酶異常激活、炎癥因子大量釋放入血而引發(fā)的胰腺水腫壞死及胰周組織液積聚。該病可并發(fā)腸梗阻、胃腸功能衰竭等疾病，嚴重者會出現(xiàn)全身炎癥反應綜合征和多器官功能障礙等急危重癥[1]。SAP在亞洲國家的發(fā)病率為0.036%～0.125%，病死率為6.5%～26%，且進展迅速，預后兇險[2－3]。腸道是SAP早期受損的功能器官之一，生理狀態(tài)下，腸道菌群與腸黏膜屏障相互作用，共同維持腸道穩(wěn)態(tài)并促進組織代謝、調節(jié)免疫等；疾病狀態(tài)下，腸道屏障功能障礙及腸道菌群失衡是SAP的重要病理機制之一，菌群的結構、相對豐度、位置變化均可能破壞腸黏膜屏障的完整性，從而進一步誘發(fā)菌群移位，加重炎癥水平，損害靶器官[4－5]。因此，在SAP早期修復腸黏膜屏障功能，并及時抑制菌群移位，對降低全身炎癥水平、遏制病情進展具有重要意義。清解化攻方（Qingjie huagong decoction，QJHGD）是廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院脾胃科治療SAP的院內(nèi)制劑，臨床應用多年，已獲國家發(fā)明專利（專利號ZL201811021893.2）。本課題組前期研究表明，QJHGD聯(lián)合化學藥治療早期SAP的臨床療效較好，可抑制炎癥因子表達，降低胰腺組織壞死程度，保護腸黏膜屏障，但具體機制未完全闡明[6－8]。

本研究采用雨蛙素聯(lián)合脂多糖腹腔注射法復制SAP大鼠模型，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA）法和Western blot法觀察QJHGD對SAP模型大鼠炎癥水平及腸黏膜屏障調節(jié)蛋白的影響；并基于16S rRNA高通量測序，初步探究該藥對SAP模型大鼠腸黏膜屏障的保護作用及調節(jié)腸道菌群、修復腸黏膜屏障的分子機制。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Centrifuge5804R型離心機（德國Eppendorf公司），CKX41型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），RM2016型病理切片機（德國Leica公司），Thermo HistoStar型組織包埋機（江蘇維林科生物技術有限公司），Qubit 3.0 Fluromete型熒光定量儀、Multiskan GO型全波長酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），Amersham Imager 600型超靈敏多功能成像儀（美國GE公司），Agilent 2100 Bioanalyzer型生物芯片分析系統(tǒng)（美國Agilent公司）。

1.2 主要藥品與試劑

QJHGD藥材飲片均購自廣西仙茱中藥科技有限公司，分別為柴胡（批號17010267）、大黃（批號17010163）、厚樸（批號16060431）、黃芩（批號16060117）、木香（批號16080375）、桃仁（批號16282049）、枳實（批號16182144），經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學中藥真?zhèn)舞b定技術中心鑒定為真品，符合《中國藥典》相關規(guī)定[9]。將上述藥材加10倍蒸餾水浸泡24 h后，武火煮沸，再以文火煮30 min，過濾；藥渣繼續(xù)加水煎煮3次，合并3次濾液，以旋轉蒸發(fā)儀濃縮，制成質量濃度為1 g/mL的藥液（以生藥量計）。

其他藥品與試劑有注射用烏司他?。◤V東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，批號032005103，規(guī)格10×104U/支），雨蛙素、脂多糖（上海源葉生物科技有限公司，批號分別為S62702、S11060），蘇木素-伊紅染色試劑盒、兔閉合蛋白（Occludin）多克隆抗體（北京索萊寶科技有限公司，批號分別為G1120、K106466P），血清淀粉酶試劑盒（北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司，批號DG96286Q），白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號ER008-96），IL-18 ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號EEL-R0567c），IL-10 ELISA試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司，批號211070825），兔高遷移率族蛋白B1（HMGB1）多克隆抗體（武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號PAB46173），兔閉鎖連接蛋白1（ZO-1）多克隆抗體、兔GAPDH多克隆抗體、HRP標記的山羊抗兔免疫球蛋白G抗體、ECL發(fā)光試劑盒（美國Affinity公司，批號分別為 AF5145、AF7021、S0001、KF003），RIPA 裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號分別為P0013B、P0010S）。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF級SD大鼠，8周齡，雄性，體質量為（200±20）g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可合格證號為SCXK（湘）2019-0004。大鼠飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學分子生物學實驗中心SPF級實驗室，動物使用許可證號為SYXK（桂）2019-0001。實驗室環(huán)境濕度為55%～65%，溫度為（24±2）℃，光暗循環(huán)12 h/12 h，實驗前適應性喂養(yǎng)1周，期間自由飲水和進食。本研究符合動物實驗倫理要求。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將60只SD大鼠隨機分為空白對照組、模型組、陽性藥對照組、QJHGD治療組，每組15只。造模前24 h大鼠禁食不禁水，采用雨蛙素聯(lián)合脂多糖腹腔注射法[10]，并參考《藥理實驗方法學（第4版）》[11]造模。模型組、陽性藥對照組、QJHGD治療組大鼠腹腔注射雨蛙素（50 μg/kg），每小時1次，連續(xù)6次，第7次注射脂多糖（10 mg/kg）以復制SAP模型。末次注射后，各組取3只大鼠，剖取大鼠胰腺組織，當胰腺發(fā)生水腫滲出、局部呈暗紅色且被膜下有出血點時，表明造模成功[12]。造模成功后，QJHGD治療組大鼠灌胃QJHGD藥液（7 g/kg，劑量根據(jù)臨床等效劑量換算而得），陽性藥對照組大鼠腹腔注射烏司他丁（5 U/kg，劑量根據(jù)臨床等效劑量換算而得），空白對照組、模型組大鼠灌胃與QJHGD治療組腹腔注射等體積的生理鹽水，每天2次，連續(xù)3 d。

2.2 生存狀態(tài)觀察及指標檢測

2.2.1 大鼠生存狀態(tài)的觀察 觀察并記錄各組大鼠造模及給藥后的精神狀態(tài)、呼吸、活動、飲食、腹部膨脹情況等方面的變化，統(tǒng)計大鼠3 d內(nèi)的死亡情況，然后從各組剩余大鼠中分別抽取10只進行后續(xù)實驗。

2.2.2 大鼠血清中血清淀粉酶及炎癥因子水平的檢測 大鼠末次給藥后1 h，腹主動脈取血約5 mL，室溫靜置2 h，以3 000 r/min離心10 min，取上清液分裝于試管中，采用全自動生化檢測儀檢測大鼠血清中血清淀粉酶水平，采用ELISA法檢測大鼠血清中IL10、IL-18、IL-1β水平。

2.2.3 大鼠胰腺及小腸組織的病理學觀察 采用蘇木素-伊紅染色法進行觀察。各組大鼠取血完成后，腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）進行麻醉，處死。取大鼠胰頭組織及距回盲部2 cm左右的小腸組織（并收集其小腸內(nèi)容物，備用），部分固定于4%多聚甲醛溶液中（另外部分用無酶、無菌管收集后于－80℃冰箱中保存），再進行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片（厚度4μm）。切片以蘇木素染色5 min，依次洗滌、分化后，再以伊紅染色30 s，然后進行脫水、透明，用中性樹膠密封，置于顯微鏡下觀察胰腺及小腸組織的病理變化。采用Schmidt法進行胰腺組織病理評分[13]，采用Chiu等[14]報告的標準化評分方法進行小腸組織病理評分。病理切片由廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院和廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院病理科2位主任醫(yī)師進行雙盲觀察，綜合兩者意見得到最終評分。

2.2.4 大鼠小腸組織中HMGB1、Occludin、ZO-1蛋白表達水平的檢測 取“2.2.3”項下保存于－80℃冰箱的小腸組織適量，加入600 μL RIPA裂解液研磨，于4℃下以12 000 r/min離心15 min，取上清液，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。將上清液加入適量蛋白上樣緩沖液煮沸15 min后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳，轉膜；以脫脂奶粉封閉2 h，加入HMGB1、Occludin、ZO-1一抗（稀釋度均為1∶1 000）和GAPDH一抗（稀釋度為1∶3 000），4℃孵育過夜；以TBST洗滌重復3次，每次5 min，加入二抗（稀釋度為1∶5 000），常溫孵育1 h；以ECL發(fā)光液顯影曝光，并用凝膠成像系統(tǒng)成像。采用Image J軟件進行條帶定量分析，以目的蛋白與內(nèi)參的灰度值比值表示其表達水平。

2.3 腸道菌群分析

2.3.1 腸道菌群16S rRNA測序 取“2.2.3”項下各組大鼠的小腸內(nèi)容物至對應編號的無菌凍存管中，置于－80℃冰箱凍存后，送至上海中科新生命生物科技有限公司進行16S rRNA高通量測序。由于取材時陽性藥對照組大鼠小腸內(nèi)容物污染嚴重，故未進行測序。

2.3.2 腸道菌群多樣性分析 將“2.3.1”項下測序得到的原始數(shù)據(jù)用FLASH軟件進行序列拼接、過濾及去嵌合體，得到有效數(shù)據(jù)?；谟行?shù)據(jù)進行分類操作單元聚類（operational taxonomic units，OTUs）和物種分類：采用UPARSE軟件包結合UPARSE-otu和UPARSE-oturef算法分析α多樣性（樣本內(nèi)）和β多樣性（樣本間），將相似性≥97%的序列歸為相同OTUs；采用Shannon、Simpson、Ace、Coverage、Chao1 指數(shù)表征菌群多樣性。對OTUs多樣性指數(shù)進行分析，并基于Bray-Curtis算法對微生物結構組間差異進行分析。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 QJHGD對SAP模型大鼠生存狀態(tài)的影響

空白對照組大鼠精神較佳，飲食規(guī)律，活動自如；模型組大鼠造模后狀態(tài)較差，出現(xiàn)精神萎靡、呼吸急促、嗜睡、食欲差、蜷縮顫抖、腹部膨脹等癥狀；陽性藥對照組和QJHGD治療組較模型組大鼠腹部膨脹癥狀明顯減輕，飲食及活動增加，精神狀態(tài)恢復較好?？瞻讓φ战M大鼠無死亡現(xiàn)象；模型組大鼠造模24 h后開始死亡，造模后共死亡6只大鼠（模型組最后死亡的1只大鼠在造模后第3天，為保證后續(xù)實驗各組大鼠數(shù)量一致、基線可比，筆者在其瀕臨死亡時，立即麻醉取材）；陽性藥對照組大鼠共死亡4只；QJHGD治療組大鼠共死亡3只。綜上，QJHGD可改善SAP模型大鼠的生存狀態(tài)，降低其死亡率。

3.2 QJHGD對SAP模型大鼠血清中血清淀粉酶和炎癥因子水平的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠血清中血清淀粉酶、IL-10、IL-18、IL-1β水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥對照組和QJHGD治療組大鼠血清中血清淀粉酶、IL-18、IL-1β（QJHGD治療組除外）水平均顯著降低（P＜0.05），IL-10水平顯著升高（P＜0.05）。結果見表1。

表1 各組大鼠血清中血清淀粉酶和炎癥因子水平的檢測結果（±s，n＝10）

表1 各組大鼠血清中血清淀粉酶和炎癥因子水平的檢測結果（±s，n＝10）

a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別空白對照組模型組陽性藥對照組QJHGD治療組IL-1β/（pg/mL）24.81±9.39 115.38±34.23a 93.13±13.95b 108.42±8.33血清淀粉酶/（U/L）2 094.21±341.07 9 062.05±2 497.23a 3 394.00±456.93b 3 079.81±834.62b IL-10/（ng/L）14.15±2.11 37.34±14.25a 59.34±9.23b 55.47±11.84b IL-18/（pg/mL）89.59±31.06 567.19±42.19a 189.65±34.69b 193.28±85.13b

3.3 QJHGD對SAP模型大鼠胰腺及小腸組織病理的影響

蘇木素-伊紅染色結果顯示，空白對照組大鼠胰腺組織排列緊密、結構完整，胰管走形正常，未見小葉間隙增寬，無出血壞死；腸上皮細胞無水腫，腸黏膜無脫落。模型組大鼠胰腺結構彌漫性破壞，細胞腫脹，實質性出血明顯，并伴有炎癥細胞浸潤；腸上皮細胞結構紊亂，間隔稀疏，水腫增加，腸黏膜上皮脫落，并伴有炎癥細胞浸潤。陽性藥對照組、QJHGD治療組大鼠的胰腺組織壞死區(qū)域、炎癥細胞浸潤較模型組減少，胰腺小葉水腫減輕、出血壞死灶減少；腸上皮細胞結構稍紊亂，可見炎癥細胞浸潤，少許腸黏膜上皮脫落。組織病理學損傷評分結果顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠胰腺及小腸組織的病理評分均顯著升高；與模型組比較，陽性藥對照組大鼠小腸組織的病理評分和QJHGD治療組大鼠胰腺及小腸組織的病理評分均顯著降低（P＜0.05）。結果見表2、圖1。

圖1 各組大鼠胰腺及小腸組織的病理學觀察顯微圖（蘇木素-伊紅染色，×200）

表2 各組大鼠胰腺及小腸組織的病理評分結果（±s，n＝10）

表2 各組大鼠胰腺及小腸組織的病理評分結果（±s，n＝10）

a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別空白對照組模型組陽性藥對照組QJHGD治療組小腸組織0.63±0.14 5.24±1.81a 3.84±0.33b 2.55±0.21b胰腺組織0.62±0.23 10.29±3.45a 8.12±2.95 7.57±2.31b

3.4 QJHGD對SAP模型大鼠小腸組織中HMGB1、Occludin、ZO-1蛋白表達的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠小腸組織中HMGB1蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），Occludin、ZO-1蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥對照組、QJHGD治療組大鼠小腸組織中HMGB1蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05），Occludin、ZO-1蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）。結果見圖2。

圖2 QJHGD對SAP模型大鼠小腸組織中HMGB1、Occludin、ZO-1蛋白表達的影響

3.5 腸道菌群測序及分析結果

3.5.1 測序樣本合理性考察結果 稀釋曲線是評估OTUs數(shù)量是否趨近于飽和以及樣品物種豐富程度的重要指標，Shannon曲線是根據(jù)各樣本測序量在不同測序深度時的微生物多樣性指數(shù)所繪制的曲線[15]。本研究收集了空白對照組、模型組、QJHGD治療組共30只大鼠的小腸內(nèi)容物樣本，通過微生物稀釋曲線圖、Shannon曲線圖考察測序樣本的合理性，結果見圖3。由圖3可見，稀釋曲線和Shannon曲線均逐漸趨向平坦，各樣本有效序列大于70 000，觀測到的OTUs數(shù)量約為1 000，這表明本研究測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息。

圖3 測序數(shù)據(jù)量合理性評估圖

3.5.2 組間群落結構差異檢驗 基于Bray-Curtis算法對微生物結構組間差異進行Anosim非參數(shù)檢驗，結果表明，空白對照組、模型組、QJHGD治療組大鼠小腸內(nèi)容物樣本兩兩比較，P值均小于0.01，相關變量系數(shù)R2分別為0.546（空白對照組vs.模型組）、0.681（模型組vs.QJHGD治療組）、0.898（空白對照組vs.QJHGD治療組），均大于0，提示這3組樣本組間差異明顯，分組合理有意義。

3.5.3 OTUs分析和菌群組成分析 對30個小腸內(nèi)容物樣本進行高通量測序分析，得到2 361 942條測序數(shù)據(jù)，每個樣品平均78 731條，共聚類得到2 620個OTUs。其中，空白對照組和模型組共有的OTUs數(shù)量為1 377個，模型組和QJHGD治療組共有的OTUs數(shù)量為675個。經(jīng)鑒定，小腸內(nèi)容物樣本中的腸道菌群涉及16個門、211個屬。根據(jù)物種注釋結果，選取各組在門水平和屬水平上相對豐度排名前10位的菌群，得到菌群相對豐度堆積柱形圖，具體見圖4。

圖4 各組樣本在門水平和屬水平上的物種組成分布

在門水平上，樣本腸道菌群涉及厚壁菌門Firmicutes、變形菌門Proteobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、放線菌門Actinobacteria、軟壁菌門Tenericutes、ε-變形菌門ε-Proteobacteria、藍藻門Cyanophyta、髕骨菌門Patescibacteria、脫鐵桿菌門 Deferribacteres、螺旋體門Spirochaetes等。其中，厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門是各組大鼠腸道菌群門水平的主要構成物種。在空白對照組、模型組、QJHGD治療組中，厚壁菌門的相對豐度分別為56.2%、55.1%、50.2%，變形菌門的相對豐度分別為33.3%、20.5%、2.3%，擬桿菌門的相對豐度分別為4.4%、17.2%、40.2%，放線菌門的相對豐度分別為4.8%、3.9%、6.9%。

在屬水平上，各組樣本相對豐度較高的菌屬為擬桿菌屬Bacteroides、真桿菌屬Eubacteriumprévot、普雷沃氏菌屬PrevotellaShanandCollins、乳酸桿菌屬Lactobacillus、瘤胃球菌屬Ruminococcus、埃希氏-志賀氏菌屬Escherichia-Shigella、梭狀芽孢桿菌屬Clostridium、羅斯氏菌屬Rothia、毛螺菌科NK4A136組Lachnospiraceae_NK4A136group等。其中，真桿菌屬、普雷沃氏菌屬、乳酸桿菌屬和瘤胃球菌屬是各組大鼠腸道菌群屬水平的主要構成物種。在空白對照組、模型組、QJHGD治療組中，真桿菌屬的相對豐度分別為28.5%、40.2%、36.1%，普雷沃氏菌屬的相對豐度分別為6.3%、19.5%、33.7%，乳酸桿菌屬的相對豐度分別為9.4%、10.1%、21.3%，瘤胃球菌屬的相對豐度分別為14.1%、4.6%、0.9%。

3.5.4 腸道菌群的α多樣性分析 對各組大鼠腸道菌群的整體群落結構差異進行α多樣性分析，結果如表3所示。3組樣本的測序深度指數(shù)Coverage均達到0.996±0.001，這表明本研究測序深度足夠深，絕大多數(shù)細菌能得到有效檢測和覆蓋。菌群豐度指數(shù)Ace和Chao1是表征菌群相對豐度的指標[16]。本研究結果顯示，與空白對照組比較，模型組Ace指數(shù)顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，QJHGD治療組Ace、Chao1指數(shù)顯著降低（P＜0.05），這表明大鼠腸道菌群整體結構發(fā)生了變化。Shannon、Simpson是可以反映α多樣性的指數(shù)，可表征微生物多樣性的豐富程度；二者值越大，表明群落中微生物多樣性越高，反之，表明微生物多樣性越低[17]。本研究結果顯示，與空白對照組比較，模型組Shannon指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，QJHGD治療組Shannon、Simpson指數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。

表3 各組樣本α多樣性分析的相關指數(shù)統(tǒng)計結果（±s，n＝10）

表3 各組樣本α多樣性分析的相關指數(shù)統(tǒng)計結果（±s，n＝10）

a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別空白對照組模型組QJHGD治療組Simpson 0.949±0.026 0.925±0.120 0.693±0.251b Coverage 0.996±0.001 0.996±0.001 0.996±0.001 Ace 995.131±87.267 972.319±184.121a 385.374±90.838b Chao1 963.937±80.068 950.334±186.453 390.509±95.783b Shannon 5.447±0.506 6.166±1.523a 3.245±1.503b

3.5.5 腸道菌群β多樣性分析 腸道菌群β多樣性分析結果顯示（圖5），各組組內(nèi)聚集性良好，表明同組樣本內(nèi)部菌群結構的相似性較強?？瞻讓φ战M和模型組之間的菌群結構有一定差異；QJHGD治療組與模型組呈現(xiàn)出明顯的分離趨勢，且給藥后菌屬分布的離散程度大于給藥前，這表明經(jīng)QJHGD干預后，組間樣本菌群結構差異較大，這也與“3.5.2”項下分析結果一致。

圖5 各組樣本β多樣性分析結果

4 討論

SAP是多種病因影響下由急性胰腺炎發(fā)展來的臨床急危重癥，也是胃腸道疾病患者住院的主要原因之一，目前無特效治療藥物。根據(jù)2021年中國急性胰腺炎指南推薦，SAP早期治療策略之一是使用質子泵抑制劑來抑制胃酸分泌，減少胰腺分泌[17]。胃酸屏障是維持胃腸道微生物穩(wěn)態(tài)的關鍵，抑酸劑及其他藥物的頻繁使用會改變消化道內(nèi)腔環(huán)境，使得腸道菌群失調和固有免疫系統(tǒng)失衡，從而加重炎癥級聯(lián)反應，導致胰腺壞死、腸黏膜損傷加重[18]。有研究表明，腸道菌群失調與SAP明顯相關，其機制之一是腸道菌群紊亂引起腸黏膜的過度免疫反應和持續(xù)炎癥，使得腸黏膜屏障破壞、腸內(nèi)細菌移位，繼而導致胰腺、胰周感染及膿毒血癥等，引起SAP患者“第2個死亡高峰”，因此及時有效地維持腸道屏障生理功能、糾正腸道菌群失衡對于防治SAP極為關鍵[19]。中醫(yī)藥全程干預不僅可以抑制炎癥因子過度釋放，遏制瀑布樣級聯(lián)效應，還可在改善SAP腸梗阻、修復腸屏障、抑制腸道菌群移位等方面發(fā)揮有益作用[20]。中醫(yī)理論認為，SAP屬濕熱瘀濁絞結于中焦，腑氣不通，耗氣傷陰，日久成毒；針對早期SAP的“熱、毒、濕、瘀”濁邪，治療當“清熱化濕解毒、化瘀攻下存陰”并舉[21]。QJHGD是遵從上述治則、長期廣泛使用且確有療效的臨床協(xié)定處方，由柴胡、大黃、厚樸、黃芩、木香、桃仁、枳實等組合而成，具有清熱化濕、解毒化瘀的功效。

本研究結果顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠血清中促炎因子血清淀粉酶、IL-10、IL-18、IL-1β水平顯著升高，胰腺和小腸組織結構破壞、水腫分裂，表明造模成功；經(jīng)QJHGD干預后，治療組大鼠血清中血清淀粉酶、IL-18水平較模型組顯著降低，胰腺和小腸組織病理形態(tài)得到改善。

腸黏膜屏障是腸道防止腸內(nèi)有害物質如細菌和毒素穿過腸黏膜進入體內(nèi)組織、器官和血液循環(huán)的統(tǒng)稱，由生物屏障、化學屏障、機械屏障和免疫屏障構成[22]。腸上皮細胞是維持腸黏膜機械屏障的結構基礎，包含了Occludin、ZO-1及黏附連接分子等組成的緊密連接復合體。Occludin是內(nèi)皮細胞屏障功能正常的象征性蛋白，主要參與腸壁通透性的調節(jié)；ZO-1屬于膜結合鳥苷酸激酶家族，在維持腸屏障緊密連接體系中發(fā)揮關鍵作用，是評價腸道通透性的重要指標[23]。HMGB1是高遷移率蛋白家族成員之一，是組織激發(fā)炎癥反應的主要因子，與晚期糖基化終產(chǎn)物受體、Toll樣受體結合后，可激活下游炎癥信號通路參與病情進展，可作為急性胰腺炎病情嚴重程度的標志性反應因子，同時也是腸黏膜屏障損害的重要參考指標[24]。本研究結果顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠小腸組織中HMGB1蛋白表達水平顯著升高，Occludin、ZO-1蛋白表達水平顯著降低，這表明模型組大鼠腸黏膜緊密連接完整性和屏障功能受損；經(jīng)QJHGD干預后，大鼠小腸組織中HMGB1蛋白表達水平顯著降低，Occludin、ZO-1蛋白表達水平均顯著升高，這表明QJHGD可有效恢復腸黏膜屏障損傷。

作為腸道菌群中的兩大優(yōu)勢微生物，厚壁菌和擬桿菌參與了機體能量代謝、脂肪存儲等過程，厚壁菌/擬桿菌的比值（F/B）反映了機體能量吸收與貯存的能力，是腸道穩(wěn)態(tài)的生理性指標之一，該比值越低則腸道菌群越穩(wěn)定[25]。本研究結果顯示，QJHGD治療組厚壁菌相對豐度較模型組降低，而擬桿菌相對豐度較模型組升高，由此可知QJHGD治療組F/B數(shù)值降低，這說明QJHGD可調節(jié)腸道菌群紊亂，改善腸道微生態(tài)失衡。擬桿菌作為革蘭氏陰性菌之一，其死亡后會裂解脫落形成脂多糖，脂多糖與結合蛋白、細胞表面CD14結合后，可激活以核因子κB為代表的癌癥信號轉導通路，促進多種促炎因子的釋放，進而導致內(nèi)毒素血癥及全身炎癥級聯(lián)反應[26]。變形菌包含了很多潛在的致病菌，其相對豐度升高可增加腸道對炎癥的敏感性，該類菌群相對豐度升高也是腸道菌群失調的標志[27]。但本研究卻發(fā)現(xiàn)，相比于空白對照組，模型組變形菌相對豐度明顯降低，這與理論情況不一致。筆者推測可能是樣本量較少而引起的測序誤差，后續(xù)可重復實驗進一步考察該菌群結果的可靠性。普雷沃氏菌能夠利用富含纖維的碳水化合物產(chǎn)生短鏈脂肪酸，從而發(fā)揮抗炎作用；乳酸桿菌可參與機體的免疫調節(jié)，其繁殖過程可產(chǎn)生低能脂肪酸，從而有效降低腸道pH值，抑制大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜菌等有害菌群的生長[28－29]。乳酸桿菌還可通過刺激免疫相關Toll樣受體、T細胞轉錄因子等的活化，抑制促炎因子如IL-6、IL-1β的釋放，進而保護腸黏膜屏障的完整性，影響?zhàn)つっ庖吖δ躘30]。本研究結果顯示，QJHGD可上調SAP模型大鼠腸道普雷沃氏菌屬、乳酸桿菌屬等菌落結構；在ELISA實驗中也得出，QJHGD可下調促炎因子血清淀粉酶、IL-18、IL-1β水平，并上調抑炎因子IL-10水平，這與胡煒等[31]研究結果一致，表明QJHGD可增加益生菌群的相對豐度，減少有害菌群定植，減少炎癥因子釋放，從而維護腸穩(wěn)態(tài)。在菌群α多樣性分析中，與空白對照組比較，模型組Simpson反而降低，基于菌群真實世界測序結果，我們推測這種反差可能是由樣本抽樣誤差和群落內(nèi)部菌群分布不均勻引起，后續(xù)本課題組將加大測序樣本量，以驗證該結果。綜上，QJHGD對SAP模型大鼠菌群的相對豐度和多樣性均有一定的調節(jié)作用，能夠改善腸道菌群結構，優(yōu)化物種多樣性。

總之，QJHGD可有效抑制SAP模型大鼠胰腺及小腸組織的炎癥反應，可通過上調小腸組織中ZO-1、Occludin的表達，下調HMGB1蛋白的表達，改善腸黏膜屏障損傷；并通過升高擬桿菌門、乳酸桿菌屬等益生菌群的相對豐度，減少厚壁菌門等有害菌群的定植發(fā)揮保護腸道的作用。