溫陽(yáng)化濁通絡(luò)方含藥血清抑制硬皮病患者Th17細(xì)胞增殖的作用機(jī)制研究Δ

郭克磊，李穎利，卞博，韓立，李凱，張紅，卞華#（.南陽(yáng)理工學(xué)院張仲景國(guó)醫(yī)國(guó)藥學(xué)院，河南 南陽(yáng) 47004；2.南陽(yáng)理工學(xué)院河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽(yáng) 47004；.南陽(yáng)市中心醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，河南 南陽(yáng) 47000）

硬皮病又名系統(tǒng)性硬化病，是以皮膚和內(nèi)臟器官纖維化為主要特征的自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制主要包括纖維化、免疫炎癥、血管損傷等，而免疫系統(tǒng)失調(diào)特別是輔助性 T 細(xì)胞 17（T helper lymphocytes 17，Th17）/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T regulatory cell，Treg）失衡在硬皮病發(fā)病及病程進(jìn)展中起著重要作用[1]。表觀遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子RORγt（又名RORC或RORC2）基因啟動(dòng)子低甲基化水平會(huì)導(dǎo)致維甲酸相關(guān)孤核受體（retinoic acid related nuclear orphan receptor，RORγt）的高表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)Th17分化，如在硬皮病患者Th17細(xì)胞中就存在RORγt基因低甲基化、蛋白高表達(dá)的現(xiàn)象[2－3]。

中醫(yī)學(xué)中無(wú)硬皮病這個(gè)病名，其應(yīng)屬皮痹等范疇。本課題組前期突破硬皮病的傳統(tǒng)治療觀點(diǎn)，率先提出“肺脾腎-皮毛”相關(guān)理論。結(jié)合硬皮病的臨床表現(xiàn)，本課題組認(rèn)為硬皮病病性屬本虛標(biāo)實(shí)——本虛是肺脾腎三臟之陽(yáng)氣虛，標(biāo)實(shí)是寒邪凝結(jié)、濕痰瘀等濁邪阻絡(luò)，脈絡(luò)不通；病位在絡(luò)脈，與肺脾腎密切相關(guān)[4]。溫陽(yáng)化濁通絡(luò)方是以黃芪桂枝五物湯、補(bǔ)肺湯、二仙湯等為基礎(chǔ)創(chuàng)制而成，由黃芪、黨參、桂枝、淫羊藿、積雪草、白芥子等10味藥材組成。諸藥相伍，通補(bǔ)并用，標(biāo)本兼顧，具有補(bǔ)肺健脾益腎、化濁通絡(luò)之效，共奏扶正祛邪之功，對(duì)硬皮病具有良好的療效[5]。本課題組前期研究表明，溫陽(yáng)化濁通絡(luò)方能夠調(diào)節(jié)硬皮病患者外周血Th17/Treg失衡，降低Th17細(xì)胞數(shù)量及白細(xì)胞介素17（interleukin 17，IL-17）水平，同時(shí)其還可通過(guò)下調(diào)微小核糖核酸-155、IL-6及酪氨酸激酶2、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3等的表達(dá)，從而抑制Th17細(xì)胞增殖[6－8]。本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用血清藥理學(xué)的方法，通過(guò)觀察溫陽(yáng)化濁通絡(luò)方含藥血清對(duì)Th17細(xì)胞增殖、RORγt mRNA及其蛋白表達(dá)、RORγt基因甲基化的影響，探討其治療硬皮病的作用機(jī)制，為溫陽(yáng)化濁通絡(luò)方防治硬皮病提供理論參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器包括ABI Veriti 96W型梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀、ABI ViiA7型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、NanoDrop 2000型核酸蛋白濃度分析儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），Synergy H1型全功能酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司），GloMax 20/20型發(fā)光檢測(cè)儀（美國(guó)Promega公司），Mini-PROTEAN 3型蛋白電泳儀、Gel Doc XR+型凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio Rad公司），F(xiàn)ACSCelesta型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.2 主要藥品與試劑

黃芪（批號(hào)180830，產(chǎn)地為山西）、黨參（批號(hào)20180701，產(chǎn)地為山西）、山藥（批號(hào)180601，產(chǎn)地為河南）、淫羊藿（批號(hào)181001，產(chǎn)地為四川）、熟地黃（批號(hào)180301，產(chǎn)地為河南）、桂枝（批號(hào)180901，產(chǎn)地為廣西）、積雪草（批號(hào)180804，產(chǎn)地為云南）、白芥子（批號(hào)180802，產(chǎn)地為河南）等飲片均購(gòu)自河南省張仲景大藥房，經(jīng)南陽(yáng)理工學(xué)院張仲景國(guó)醫(yī)國(guó)藥學(xué)院張超云副教授鑒定均為真品。甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑地西他濱（decitabine，DCA）原料藥（批號(hào)S1200，純度＞99.93%）購(gòu)自美國(guó)Selleck公司；CCK-8試劑盒（批號(hào)C0038）、BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)P0012）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒（批號(hào)E1960）購(gòu)自美國(guó)Promega公司；第一鏈cDNA合成試劑盒（批號(hào)K1622）、LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑（批號(hào)1887047）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；熒光定量PCR試劑SYBR Green（批號(hào)04913914001）購(gòu)自德國(guó)Roche公司；DNA提取試劑盒（批號(hào)B618503）、DNA純化試劑盒（批號(hào)B610367）、瓊脂糖（批號(hào)A600014）、UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒（批號(hào)B511321）均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；人IL-17酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（批號(hào)E-EL-H0103c）購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；RORγt兔多克隆抗體（批號(hào)DF3196）購(gòu)自江蘇親科生物研究中心有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）鼠單克隆抗體（批號(hào)AC002）購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號(hào)5220-0336）、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗（批號(hào)074-1806）購(gòu)自美國(guó)KPL公司；DNA甲基化修飾試劑盒（批號(hào)D5030）購(gòu)自美國(guó)Zymo公司；熱啟動(dòng)DNA聚合酶（批號(hào)M0490S）購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs公司；其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為健康SPF級(jí)Wistar雌性大鼠，共60只，7～8周齡，體質(zhì)量為220～250 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2016-0011。大鼠飼養(yǎng)于溫度為（24±2）℃、相對(duì)濕度為（50±10）%、晝夜交替（12 h/12 h）的環(huán)境中。飼養(yǎng)期間大鼠自由攝食、飲水。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)南陽(yáng)理工學(xué)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為南理工動(dòng)倫審〔2018〕011號(hào)。

1.4 Th17細(xì)胞

Th17細(xì)胞來(lái)源于2018年3月－2019年7月在南陽(yáng)市中心醫(yī)院確診并接受治療的硬皮病患者血液樣本。經(jīng)患者知情同意后，抽取其外周血5 mL，由南陽(yáng)理工學(xué)院張仲景國(guó)醫(yī)國(guó)藥學(xué)院韓立老師分選Th17細(xì)胞并通過(guò)流式細(xì)胞儀驗(yàn)證其純度為96%～98%[9]。本研究臨床血液樣本的獲取符合相關(guān)臨床試驗(yàn)研究法規(guī)、規(guī)范及《赫爾辛基宣言》要求，并經(jīng)南陽(yáng)市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查、批準(zhǔn)后實(shí)施（倫理批件號(hào)為2017-11-10-01）。

1.5 質(zhì)粒

pGL3-Basic-luc載體質(zhì)粒（批號(hào)E1751）、海腎熒光素酶RL-TK質(zhì)粒（批號(hào)E2241）均購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

2 方法

2.1 溫陽(yáng)化濁通絡(luò)方水煎液的制備

按溫陽(yáng)化濁通絡(luò)方組成稱取相應(yīng)量飲片，加10倍量水（mL/g，下同）浸泡1 h，武火煎煮開(kāi)以后文火煎30 min，收集藥液；藥渣再加10倍量水以文火煎30 min，收集藥液。合并2次煎煮液，濃縮得到生藥量為1.5 g/mL的水提物（得率為43.44%）。經(jīng)高分辨質(zhì)譜法測(cè)定，其中主要含淫羊藿苷（0.98%）、積雪草苷（0.20%）、芥子堿（0.07%）、黃芪甲苷（0.01%）等成分。

2.2 動(dòng)物分組、給藥及含藥血清的制備

將60只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組和溫陽(yáng)化濁通絡(luò)方低、中、高劑量組，每組15只。溫陽(yáng)化濁通絡(luò)方低、中、高劑量組大鼠分別按照15、30、60 g/（kg·d）[分別為成人臨床等效劑量的1、2、4倍，按照成人臨床日用劑量（141 g/d）及大鼠與成人體質(zhì)量劑量折算系數(shù)（6.25）計(jì)算出大鼠的日用藥量為15 g/kg（141 g/60 kg×6.25≈15 g/kg）]灌胃給藥，空白對(duì)照組大鼠灌胃等體積生理鹽水。早晚各給藥1次，連續(xù)灌胃7 d。各組大鼠分別于末次灌胃給藥30 min后，在麻醉狀態(tài)下于股動(dòng)脈采血，將各組大鼠的血樣混合后在4℃下靜置2 h，再以3 000 r/min離心10 min，吸取上清液，即得空白血清和含藥血清。將血清用0.45 μm濾器過(guò)濾除菌，分裝后置于－80℃冰箱中保存，備用。

2.3 CCK-8法檢測(cè)Th17細(xì)胞增殖

將Th17細(xì)胞按每孔100 μL（2×103個(gè)細(xì)胞）接種到96孔板中，分為空白血清對(duì)照組，溫陽(yáng)化濁通絡(luò)方含藥血清低、中、高劑量組（后文簡(jiǎn)稱含藥血清低、中、高劑量組）和DAC組（陽(yáng)性對(duì)照組），每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔；并另外設(shè)置空白孔（加100 μL無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基）。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，空白血清對(duì)照組加入10%體積空白對(duì)照血清，含藥血清低、中、高劑量組分別加入10%體積對(duì)應(yīng)含藥血清，DAC組加入1 μmol/L DAC和10%體積空白血清，處理48 h。每孔加入10%體積CCK-8溶液，于37℃下孵育2 h。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率（%）＝（A給藥組－A空白孔）/（A空白對(duì)照組－A空白孔）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中RORγt、IL-17 mRNA的表達(dá)水平

將Th17細(xì)胞按每孔500 μL（1×105個(gè)細(xì)胞）接種到24孔板中，分組同“2.3”項(xiàng)下，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，按“2.3”項(xiàng)下方法加藥處理。處理48 h后，收集細(xì)胞，按照RNA抽提試劑盒步驟提取細(xì)胞中總RNA，并測(cè)定總RNA的濃度。取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（20 μL）如下：cDNA模板1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，SYBR Green 試劑10 μL，超純水8 μL。反應(yīng)條件如下：95℃熱啟動(dòng)15 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法計(jì)算各目的基因mRNA的表達(dá)水平。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

表1 引物序列及產(chǎn)物擴(kuò)增長(zhǎng)度

2.5 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中RORγt蛋白表達(dá)水平

將Th17細(xì)胞按每孔1 mL（2×105個(gè)細(xì)胞）接種到12孔板中，細(xì)胞分組及給藥處理方法同“2.3”項(xiàng)下。處理48 h后，在4℃下以2 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞。使用RIPA裂解液提取細(xì)胞中總蛋白，以BCA法測(cè)定總蛋白的濃度，加入上樣緩沖液將總蛋白煮沸10 min變性。配制10%聚丙烯酰胺凝膠，取40 μg總蛋白上樣，先在80 V電壓下電泳30 min，待樣品進(jìn)入分離膠后，在120 V電壓下電泳1 h；在200 mA電流下轉(zhuǎn)移1 h至聚偏二氟乙烯膜上，以5%牛血清白蛋白在室溫下封閉1 h；分別加入RORγt一抗（稀釋比例為1∶2 000）、GAPDH一抗（稀釋比例為1∶5 000），4℃孵育過(guò)夜；TBST漂洗5 min×5次，分別加入對(duì)應(yīng)二抗（稀釋比例均為1∶10 000），室溫孵育1.5 h；TBST漂洗5 min×5次，ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色并用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照。使用Image J 1.52 a軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示RORγt蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-17蛋白表達(dá)水平

將Th17細(xì)胞按每孔1 mL（2×105個(gè)細(xì)胞）接種到12孔板中，細(xì)胞分組及給藥處理方法同“2.3”項(xiàng)下。處理48 h后，在4℃下以12 000 r/min離心10 min，收集細(xì)胞上清液。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中IL-17蛋白表達(dá)水平。

2.7 甲基化特異性PCR法檢測(cè)細(xì)胞中RORγt基因啟動(dòng)子甲基化水平

將Th17細(xì)胞按每孔1 mL（2×105個(gè)細(xì)胞）接種于12孔板中，細(xì)胞分組、給藥處理方法同“2.3”項(xiàng)下。處理48 h后，收集細(xì)胞，采用柱式法提取細(xì)胞中總DNA，根據(jù)DNA甲基化修飾試劑盒方法進(jìn)行DNA重亞硫酸鹽處理將非甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ║），甲基化的胞嘧啶（C）保持不變，回收并純化DNA。使用在線工具M(jìn)ethPrimer 2.0（http：//www.urogene.org）設(shè)計(jì)RORγt基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化（methylated，M）與非甲基化（methylated，U）引物，甲基化特異性PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1）。使用熱啟動(dòng)DNA聚合酶進(jìn)行甲基化特異性PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系如下：DNA模板5 μL，dNTPs（10 mmol/L）1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，熱啟動(dòng)DNA聚合酶0.25 μL，反應(yīng)緩沖液10 μL，用水補(bǔ)至總體積50 μL。反應(yīng)條件如下：95℃熱啟動(dòng)30 s；95℃變性15 s，58℃退火30 s，68℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后68℃延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物上樣于2%瓊脂糖凝膠，在120 V電壓下電泳20 min，使用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照成像，并采用Image J 1.52 a軟件分析DNA電泳條帶的灰度值，并計(jì)算RORγt基因啟動(dòng)子甲基化水平：RORγt基因啟動(dòng)子甲基化水平＝給藥組條帶灰度值/空白對(duì)照組條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 雙熒光素酶法檢測(cè)細(xì)胞中RORγt基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性

先將RORγt基因啟動(dòng)子片段克隆構(gòu)建到pGL3-Basic-luc載體上，命名為pGL3-RORγt-luc，經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序正確后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將Th17細(xì)胞按每孔500 μL（1×105個(gè)細(xì)胞）接種于24孔板中，細(xì)胞分組同“2.3”項(xiàng)下。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，每孔轉(zhuǎn)染0.5 μg pGL3-RORγt-luc及10 ng RL-TK質(zhì)粒，6 h后更換為新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)細(xì)胞給藥處理同“2.3”項(xiàng)下。處理48 h后，按照雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)細(xì)胞中RORγt基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 含藥血清對(duì)Th17細(xì)胞增殖的影響

與空白血清對(duì)照組[（100.700±6.500）%]比較，含藥血清低、中、高劑量組和DAC組細(xì)胞的增殖率[（88.040±2.970）%、（75.182±4.216）%、（58.440±5.575）%、（58.440±5.575）%、（44.461±3.147）%，n＝6]均顯著降低（P＜0.05），并且具有一定的劑量依賴趨勢(shì)。

3.2 含藥血清對(duì)細(xì)胞中RORγt、IL-17 mRNA表達(dá)的影響

與空白血清對(duì)照組比較，含藥血清各劑量組和DAC組細(xì)胞中RORγt mRNA表達(dá)水平以及含藥血清中、高劑量組和DAC組細(xì)胞中IL-17 mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞（上清液）中RORγt、IL-17 mRNA及其蛋白表達(dá)水平的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝3）

表2 各組細(xì)胞（上清液）中RORγt、IL-17 mRNA及其蛋白表達(dá)水平的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝3）

a：與空白血清對(duì)照組比較，P＜0.05

組別空白血清對(duì)照組含藥血清低劑量組含藥血清中劑量組含藥血清高劑量組DAC組蛋白/（pg/mL）80.730±2.113 73.380±2.304a 64.270±3.415a 57.190±2.119a 55.120±4.334a RORγt mRNA 1.050±0.099 0.778±0.058a 0.584±0.061a 0.355±0.054a 0.244±0.040a蛋白1.645±0.035 1.151±0.042a 0.953±0.017a 0.652±0.063a 0.151±0.041a IL-17 mRNA 1.000±0.156 0.915±0.035 0.742±0.062a 0.672±0.080a 0.464±0.039a

3.3 含藥血清對(duì)細(xì)胞（上清液）中RORγt、IL-17蛋白表達(dá)的影響

與空白血清對(duì)照組比較，含藥血清各劑量組、DAC組細(xì)胞（上清液）中RORγt、IL-17蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖1、表2。

圖1 各組細(xì)胞中RORγt蛋白表達(dá)的電泳圖

3.4 含藥血清對(duì)細(xì)胞中RORγt基因啟動(dòng)子甲基化的影響

與空白血清對(duì)照組比較，含藥血清中、高劑量組和DAC組細(xì)胞中RORγt基因啟動(dòng)子甲基化水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖2、表3。

圖2 各組細(xì)胞中RORγt基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)的電泳圖

3.5 含藥血清對(duì)細(xì)胞中RORγt基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響

與空白血清對(duì)照組比較，含藥血清各劑量組和DAC組細(xì)胞中RORγt基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性均顯著降低（P＜0.05），且具有一定的劑量依賴趨勢(shì)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞中RORγt基因啟動(dòng)子甲基化水平及其轉(zhuǎn)錄活性測(cè)定結(jié)果（±s，n＝3）

表3 各組細(xì)胞中RORγt基因啟動(dòng)子甲基化水平及其轉(zhuǎn)錄活性測(cè)定結(jié)果（±s，n＝3）

a：與空白血清對(duì)照組比較，P＜0.05

組別空白血清對(duì)照組含藥血清低劑量組含藥血清中劑量組含藥血清高劑量組DAC組轉(zhuǎn)錄活性7.323±0.505 6.565±0.398a 5.600±0.450a 5.170±0.332a 4.140±0.512a甲基化水平1.000±0.050 1.017±0.032 1.133±0.031a 1.223±0.025a 1.467±0.061a

4 討論

在血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)中，研究者通常會(huì)選擇雄性大鼠或雌雄各半的大鼠來(lái)制備含藥血清，但也有部分研究?jī)H選用雌性大鼠來(lái)進(jìn)行含藥血清的制備[10]。因硬皮病的發(fā)病對(duì)象以女性為主（男女發(fā)病率之比為1∶3～1∶8）[11]，為了避免雄性大鼠血清中某些成分對(duì)細(xì)胞的影響，也為了與臨床研究對(duì)象保持一致[12]，故本研究?jī)H選用了雌性大鼠作為研究對(duì)象。DAC為DNA甲基化酶抑制劑，其可通過(guò)抑制DNA甲基化酶的表達(dá)起到抑制DNA甲基化的作用[13]，因此本研究選擇DAC作為陽(yáng)性對(duì)照藥。

Th17細(xì)胞是以分泌IL-17A為主的CD4+T細(xì)胞亞群，Th17細(xì)胞的異常增殖會(huì)促進(jìn)IL-17等促炎因子的產(chǎn)生，引起組織損傷及纖維化[14]。轉(zhuǎn)錄因子RORγt是調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞分化和發(fā)育的關(guān)鍵因子，其可與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)節(jié)IL-17等炎癥因子的表達(dá)，在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[15]。萬(wàn)琳琳等[16]研究發(fā)現(xiàn)，硬皮病患者外周血中Thl7細(xì)胞數(shù)量以及IL-17、RORγt表達(dá)水平明顯高于非活動(dòng)期硬皮病患者和正常人，并與活動(dòng)期硬皮病患者病情活動(dòng)度呈正相關(guān)。Okamoto等[17]研究發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，博來(lái)霉素誘導(dǎo)的硬皮病模型小鼠的皮膚和肺組織中Th17細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，血清、皮膚和肺組織中IL-17A和RORγt表達(dá)水平顯著升高。上述研究表明，Th17細(xì)胞異常增殖及IL-17、RORγt在硬皮病患者體內(nèi)表達(dá)上調(diào)在疾病進(jìn)程中起著重要作用。由此可見(jiàn)，通過(guò)RORγt調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞平衡可能是治療硬皮病的潛在靶點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，溫陽(yáng)化濁通絡(luò)方含藥血清可抑制硬皮病患者外周血來(lái)源Th17細(xì)胞的增殖以及IL-17、RORγt mRNA及其蛋白的表達(dá)。梁娟等[18]發(fā)現(xiàn)，紅花水煎液可通過(guò)降低硬皮病模型小鼠皮膚組織中RORγt蛋白的表達(dá)，抑制免疫炎癥反應(yīng)來(lái)發(fā)揮其抗皮膚纖維化的作用。其結(jié)果也表明，中醫(yī)藥可通過(guò)干預(yù)Th17細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)來(lái)發(fā)揮治療硬皮病的作用。但本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，溫陽(yáng)化濁通絡(luò)方含藥血清對(duì)正常人Th17細(xì)胞中RORγt mRNA及蛋白表達(dá)也有一定的抑制作用，說(shuō)明溫陽(yáng)化濁通絡(luò)方含藥血清對(duì)硬皮病患者Th17細(xì)胞的作用可能是非特異性的。

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)修飾之一，在基因表達(dá)調(diào)控中起著重要作用，基因DNA高度甲基化會(huì)導(dǎo)致基因低表達(dá)，而低甲基化則使基因高表達(dá)[19]。Mazzoni等[2]發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞中RORC2基因啟動(dòng)子呈低甲基化水平，而初始T細(xì)胞和Th1細(xì)胞中RORC2基因啟動(dòng)子呈高甲基化水平，這提示RORC2基因甲基化水平的降低可能是初始T細(xì)胞和Th1細(xì)胞向Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)化的必要條件。由此可見(jiàn)，從調(diào)節(jié)RORγt基因甲基化的表觀遺傳學(xué)角度出發(fā)來(lái)調(diào)控Th17細(xì)胞數(shù)量，可作為硬皮病防治的新思路。本研究發(fā)現(xiàn)，溫陽(yáng)化濁通絡(luò)方含藥血清可以升高Th17細(xì)胞中RORγt基因啟動(dòng)子甲基化水平，并可抑制RORγt基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性，說(shuō)明溫陽(yáng)化濁通絡(luò)方含藥血清可通過(guò)調(diào)節(jié)RORγt基因甲基化影響Th17細(xì)胞數(shù)量。

綜上，溫陽(yáng)化濁通絡(luò)方含藥血清可通過(guò)促進(jìn)RORγt基因啟動(dòng)子甲基化及下調(diào)RORγt基因轉(zhuǎn)錄活性，抑制RORγt表達(dá)及IL-17分泌，從而抑制Th17細(xì)胞的增殖。但是本研究也可能存在如下問(wèn)題：（1）雖然通過(guò)制備含藥血清可以更好地模擬中藥的有效成分，更準(zhǔn)確、科學(xué)地進(jìn)行中藥復(fù)方體外藥效學(xué)和藥理學(xué)評(píng)價(jià)[20]，但是在血清中檢測(cè)到的成分是否為有效成分很難確定，而且血清中化學(xué)成分含量復(fù)雜，給鑒定帶來(lái)了巨大的困難[21]。（2）溫陽(yáng)化濁通絡(luò)方含藥血清對(duì)Th17細(xì)胞的作用具有非特異性，而Th17細(xì)胞的增殖及RORγt的表達(dá)受到多種方式的調(diào)節(jié)，后續(xù)還需深入研究溫陽(yáng)化濁通絡(luò)方含藥血清是否通過(guò)其他途徑調(diào)節(jié)正常人及硬皮病患者Th17細(xì)胞增殖。