結(jié)核分枝桿菌CFP10-ESAT6融合蛋白免疫小鼠效果初步評價

欒秀麗，范雪亭，王瑞歡，李馬超，于晉杰,2，錢程宇，3，曹 斌,2，趙秀芹，劉志廣，劉海燦，李桂蓮，萬康林

結(jié)核病(tuberculosis，TB)是一種主要經(jīng)呼吸道傳播結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染導致的全身性慢性傳染病，以肺結(jié)核為主，在世界范圍內(nèi)造成了沉重的疾病負擔。疫苗接種可以降低人類結(jié)核病感染的發(fā)病率和嚴重程度，在全世界范圍內(nèi)獲批使用的卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin vaccine,BCG)雖然具有部分保護作用，但未能充分保護青少年和成人免受結(jié)核分枝桿菌感染[1]。因此，迫切需要開發(fā)新的更有效的抗結(jié)核疫苗。

培養(yǎng)濾液蛋白-10(Culture filtrate protein-10, CFP-10)和早期分泌抗原靶6kDa蛋白(early secretary antigentic target 6kDa protein, ESAT-6)是結(jié)核分枝桿菌基因組RD1區(qū)基因編碼的早期分泌的蛋白質(zhì)，是與毒力相關的T細胞蛋白抗原，其T細胞表位覆蓋率達100%。CFP10和ESAT6基因在MTB中同時轉(zhuǎn)錄[2]，CFP10位于ESAT6的上游，兩個基因同屬于一個操縱子，由同一個啟動子調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。當MTB被巨噬細胞吞噬時，CFP10和ESAT6形成異質(zhì)二聚體(EsxAB)共同分泌[3], 該復合物可通過CFP10的c端形成的長柔性臂與巨噬細胞和單核細胞表面特異性結(jié)合[4]，并且CE復合物可以抑制吞噬溶酶體融合[5]，利于其在宿主細胞內(nèi)生存，增強致病性分枝桿菌的毒力。因為CFP10與ESAT6具有相同的免疫學特性，并且在體內(nèi)能按1∶1緊密連接形成雜二聚體[6]，體外模仿這種結(jié)構(gòu)構(gòu)建的CE融合蛋白比單個蛋白在疫苗和診斷方面更具研究和應用價值[7-9]。

以往對于CE融合蛋白的研究多集中于蛋白的抗原性與免疫機制方面的研究，CE融合蛋白可以通過皮試診斷結(jié)核感染[10]或者鑒別致敏機體的不同分枝桿菌[11]，以及通過ELISA實驗對結(jié)核病進行血清學輔助診斷[12-14]，并且有研究發(fā)現(xiàn)CE融合蛋白能夠活化巨噬細胞[15]，在感染早期可能具有重要的抗結(jié)核保護作用[16]，上述研究證明了CE融合蛋白具有特異的免疫原性，為CE融合蛋白作為免疫優(yōu)勢抗原在結(jié)核病診斷與參與疫苗研制方面提供了一定參考。與CE抗原基因排列順序相反的EC融合蛋白，同樣在血清學診斷與皮膚試驗中具有良好的表現(xiàn)[17-18]，除此之外還有研究對EC融合蛋白誘導小鼠的免疫應答及其保護力進行了評價，通過檢測EC融合蛋白誘導產(chǎn)生的IFN-γ與IL-2以及攻擊感染H37Rv后的脾臟菌落計數(shù)認為EC可以誘導機體產(chǎn)生特異性細胞免疫應答[19]，并且融合表達ESAT6-CFP10蛋白的重組恥垢分枝桿菌能誘導小鼠產(chǎn)生特異性體液和細胞免疫應答,并對感染小鼠有一定保護力[20]。

佐劑與人體產(chǎn)生的免疫反應程度相關，對亞單位疫苗的質(zhì)量也有著重要影響。研究發(fā)現(xiàn)鋁佐劑以促進抗體介導的保護性免疫應答為主[21-22]，但其本身不具備免疫原性，而是作為吸附劑起作用。鋁佐劑在疫苗溶液中能強烈吸附抗原形成沉淀[23]，接種此類疫苗后可在機體內(nèi)形成抗原貯存庫，緩釋抗原以延長疫苗發(fā)揮作用的時間，并促進注射部位的巨噬細胞反應以及促炎NLRP3通路的激活。鋁佐劑安全性高[24]，目前已廣泛應用于人類疫苗中。本研究擬采用鋁佐劑作為給藥系統(tǒng)，探討CE融合蛋白免疫小鼠引起的免疫應答特性。

本研究使用CE融合蛋白混合鋁佐劑免疫小鼠，以BCG免疫組為陽性對照、PBS免疫組作為空白對照、單純鋁佐劑免疫組為陰性對照，結(jié)合體外MGIA及小鼠特異性抗體和9種細胞因子變化，初步評價CE免疫效果。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株和載體 H37Rv (ATCC 27294)、BCG-China (D2PB302)、含MTB融合蛋白CE對應基因的重組pET32a(+)質(zhì)粒與含重組質(zhì)粒的E.coliBL21(DE3)大腸桿菌均由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所傳代、培養(yǎng)和保存。

1.1.2 主要試劑 氫氧化鋁佐劑(簡稱鋁佐劑)購自美國賽默飛世爾科技公司，小鼠IFN-γ與IL-4檢測ELISpot預包被板購自北京達科為生物技術有限公司，Luminex多細胞因子檢測試劑盒購自美國RD-Biotechne公司，小鼠淋巴細胞分離液購自北京達科為生物技術有限公司，辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)標記的羊抗鼠IgG、IgG1和IgG2a抗體購自蘇州博奧龍科技有限公司。

1.1.3 BABL/c小鼠 6～8周齡、雌性、SPF級, 購自維通利華公司，飼養(yǎng)于中國疾病預防控制中心動物中心。

1.2 方 法

1.2.1 CE抗原的誘導與表達純化 實驗室前期已將CFP10與ESAT6編碼基因串聯(lián)，并經(jīng)EcoR I與Hind III酶切位點連接在pET32a(+)質(zhì)粒上，構(gòu)成重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)大腸桿菌。本實驗挑取LB固體平板生長的新鮮重組菌落加入含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min搖床擴菌培養(yǎng)至OD600值達到0.6～0.8，向菌液中加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-d-galactoside，IPTG，終濃度為1 mmol/L)，繼續(xù)振搖培養(yǎng)誘導4 h。提取重組菌中蛋白并用SDS-PAGE確認目的蛋白表達后，用Ni-NTA層析進行純化，使用ToxinEraser內(nèi)毒素清除試劑盒去除重組蛋白中的內(nèi)毒素，然后使用BCA蛋白定量試劑盒測定濃度后用0.22 μm濾器過濾除菌，用PBS將蛋白稀釋定量至333 μg/mL。

1.2.2 BCG的菌落計數(shù)與全菌蛋白提取

1.2.2.1 BCG-China菌懸液 刮取生長于羅氏培養(yǎng)基的新鮮BCG-China菌落置于PBS中，用超聲分散儀分散菌體：1)調(diào)整其濃度至OD600值為1后，進行10倍梯度稀釋，將不同稀釋度的菌液涂布7H10平板，兩周后獲得各稀釋濃度的細菌計數(shù)(CFU)，計算出OD600=1的菌液對應的菌落個數(shù)，用于推算實驗中使用的菌落數(shù)；2)反復離心洗滌后用PBS調(diào)整菌液濃度為5×106/mL，用于免疫小鼠。

1.2.2.2 BCG-China全菌蛋白提取 從羅氏培養(yǎng)基上刮取適量新鮮菌體，PBS反復清洗后，80 ℃水浴滅活，冰上超聲，隨后離心收集上清液，測定上清液中的全菌蛋白濃度后用0.22 μm濾器將蛋白過濾除菌。

1.2.3 小鼠免疫 將BALB/c小鼠隨機分為4組，每組6只。CE組，每只每次免疫采用含25%(體積百分濃度，V/V)鋁佐劑的333 μg/mL CE蛋白/鋁佐劑混合物200 μL；陰性對照組即佐劑組，每只每次免疫采用含25%(V/V)鋁佐劑的0.01 mol/L pH7.2 PBS 200 μL；空白對照組，每只每次免疫采用0.01 mol/L pH7.2 PBS 200 μL；陽性對照即BCG組，免疫采用BCG菌液200 μL (5×106個菌/mL)[19]。 一免前采集小鼠本底血，BCG組小鼠于背部皮下多點注射免疫1次。其余各組小鼠于第1、11和21 d分3次背部皮下多點注射免疫。末次免疫結(jié)束后7 d統(tǒng)一處死所有BALB/c小鼠，采集血液和脾臟標本，進行免疫學檢測。

1.2.4 體液免疫水平檢測 采用ELISA法測定小鼠血清中特異性總IgG以及IgGl和IgG2a的抗體滴度。用2 μg/mL的CE融合蛋白或BCG全菌蛋白作為抗原，每孔100 μL包被96孔ELISA板，一抗為PBS倍比稀釋的免疫試驗小鼠血清，二抗為HRP標記的羊抗鼠IgG和IgG1、IgG2a抗體。OD600值大于佐劑組或PBS組血清的2.1倍時，即是(蛋白免疫組OD600值-同體本底OD600值)/(佐劑組OD600值-同體本底OD600值)>2.1，結(jié)果判定為陽性，該樣品的稀釋倍數(shù)為對應的抗體滴度。每次試驗設置復孔，并檢測3個生物學重復。

1.2.5 ELISpot法檢測IFN-γ與IL-4的分泌情況 小鼠處死后，用淋巴細胞分離液提取脾臟淋巴細胞，調(diào)整淋巴細胞至終濃度為1×106個細胞/mL。按照ELISpot預包被板的說明書操作，活化板子后每孔加入100 μL細胞。CE和佐劑組細胞均用2 μg CE融合蛋白抗原刺激，BCG組細胞用2 μg BCG全菌蛋白抗原刺激，PBS組用2 μg CE融合蛋白抗原刺激。每組均設陽性對照孔和空白對照孔，分別加入500 ng ConA和100 μL培養(yǎng)基。將上述處理后的細胞置37 ℃、5% CO2靜置培養(yǎng)20 h后，加入生物素標記的IFN-γ與IL-4抗體以及酶聯(lián)親和素，進而檢測分泌特異性IFN-γ與IL-4的細胞數(shù)。每次試驗設置復孔，并檢測3個生物學重復。

1.2.6 Luminex細胞因子檢測 準備96孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入100 μL濃度為1×106個細胞/mL的小鼠脾淋巴細胞。CE和佐劑組細胞均用10 μg CE融合蛋白抗原刺激，BCG組用10 μg BCG全菌蛋白抗原刺激，PBS組用10 μg CE融合蛋白抗原刺激。將以上細胞置37 ℃、5% CO2靜置培養(yǎng)20 h后，收集孔內(nèi)液體與細胞。按照小鼠多重細胞因子分析試劑盒的說明書操作，同時檢測IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、IL-2、IL-12p70、IL-6、IL-10、IL-4和IL-17/IL-17A共9種細胞因子的表達水平。簡言之，向96孔檢測板每孔加入50 μL樣品或標準品后，各加入50 μL微球混合物，室溫震蕩培養(yǎng)2 h后，分別孵育生物素抗體以及PE標記鏈霉親和素，進而檢測各孔的細胞因子濃度。每次試驗設置復孔，并檢測3個生物學重復。

1.2.7 結(jié)核分枝桿菌體外生長抑制試驗 收集小鼠脾淋巴細胞，用含1×非必需氨基酸、10 mmol/L Hepes、1 mmol/L丙酮酸鈉和5×10-5M 2-巰基乙醇的完全1640細胞培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度至2×106個細胞/mL。從羅氏培養(yǎng)基刮下新鮮的H37Rv，用重懸細胞的完全1640細胞培養(yǎng)基梯度稀釋H37Rv，并于1 h內(nèi)將500 μL 100 CFU/mL 的H37Rv添加到含500 μL 2×106個脾細胞/mL的24孔板中，置37 ℃、5% CO2共培養(yǎng)4 d。培養(yǎng)第4 d時取出24孔板，收集每孔的培養(yǎng)物離心棄上清。同時向24孔板每孔加入500 μL無菌組織培養(yǎng)級水，室溫孵育至少5 min，然后將水完全移出，加到上述沉淀中，進行10倍和100倍稀釋，然后將原液與稀釋后的樣品涂布7H10平板，每組脾細胞檢測均設置復孔，并檢測4個生物學重復。約14 d后計算每板CFU (colony-forming unit)數(shù)，最終實驗數(shù)據(jù)以每孔樣品的log10CFU表示并進行組間比較。

2 結(jié) 果

2.1 蛋白的純化結(jié)果 SDS-PAGE結(jié)果顯示，CE融合蛋白主要以可溶性蛋白的形式表達(圖1)。重組蛋白分子中含有的質(zhì)粒pET-32a上攜帶的融合表達的His標簽、S標簽和Trx標簽(分子量共約為19 kDa)。包含標簽的重組蛋白CE，總分子量約為40 kDa，電泳結(jié)果顯示蛋白分子量與預期相符且純度較高(圖1)，可用于后續(xù)的免疫實驗。

注：圖中M為蛋白Marker；列1為未誘導的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的pET32a-CE；列2,3分別為誘導后的pET32a-CE經(jīng)超聲離心的包涵體沉淀和上清；列4為純化后的重組蛋白CE。圖1 SDS-PAGE分析重組蛋白CE的表達純化結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE analysis of the purification and expression of recombinant protein CE

2.2 抗原的特異性體液免疫應答 由于佐劑免疫組與PBS組在ELISA檢測中吸光度相近且較低，我們選擇前者作為陰性對照組。CE組誘導的特異性IgG、IgG1和IgG2a滴度均高于陰性對照組；且前者的IgG1與IgG2a水平均高于BCG組(t值分別為19.1和8.7，P值均<0.000 1)，見圖2A，但兩組間IgG水平和IgG1/IgG2a值的差異無統(tǒng)計學意義(2.1vs.2.0，t=0.87，P>0.05)，見圖2B。

注：(A) CE組和BCG組總IgG、IgG1和IgG2a抗體滴度的比較結(jié)果；(B) CE組和BCG組抗體IgG1/IgG2a的比較結(jié)果。④P<0.000 1。圖2 CE與BCG免疫BALB/c小鼠血清IgG、IgG1和IgG2a的比較Fig.2 Comparisons on the IgG, IgG1 and IgG2a isotypes in the sera between CE and BCG immunized BALB/c mice

2.3 不同免疫組分泌IFN-γ與IL-4的細胞數(shù)檢測 CE組分泌IFN-γ與IL-4的斑點形成細胞(Spot Forming Cell，SFC)數(shù)均分別高于PBS組與佐劑組；CE組與BCG組相比，分泌IFN-γ的SFC數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(t=0.4，P>0.05)，見圖3A，但CE組分泌IL-4的SFC數(shù)高于BCG組(t=8.0,P<0.000 1)，見圖3B。

注：A. 小鼠脾細胞經(jīng)體外抗原刺激后產(chǎn)生的IFN-γ的SFC數(shù)；B. 產(chǎn)生的IL-4的SFC數(shù)。CE組和BCG組之間的統(tǒng)計學顯著性差異用兩組間線上的數(shù)字表示，CE組與PBS組和佐劑組之間的統(tǒng)計學差異用PBS組和佐劑組柱上的數(shù)字表示，①P<0.05, ④P<0.000 1。圖3 不同免疫組的BALB/c小鼠分泌IFN-γ與IL-4的細胞數(shù)差異Fig.3 Difference of IFN-γ- and IL-4-secreting cells between BALB/c mice in different immune groups

2.4 不同免疫組細胞因子表達水平檢測 用LUMINEX檢測不同免疫組小鼠脾淋巴細胞經(jīng)CE或BCG全菌蛋白刺激后9種細胞因子表達水平的組間差異。如圖4所示， CE組刺激誘導產(chǎn)生的9種細胞因子均高于PBS和佐劑組。CE組刺激誘導產(chǎn)生的GM-CSF、IL-6、IL-10、IL-4高于BCG組(tGM-CSF=8.4，P<0.000 1；tIL-6=8.3，P<0.000 1；tIL-10=2.5，P<0.05；tIL-4=7.0，P<0.000 1)，而IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-12 p70、IL-17/IL-17A等細胞因子未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計學意義，然而，CE組的IFN-γ/IL-4值低于BCG組(2.3vs6.1,t=3.4,P<0.05)。

注：小鼠脾細胞經(jīng)體外抗原刺激后產(chǎn)生的A. IFN-γ濃度；B. TNF-α濃度；C. GM-CSF濃度；D. IL-2濃度；E. IL-12 p70濃度；F. IL-6濃度；G. IL-10濃度；H. IL-4濃度；I. IL-17/IL-17A濃度。CE組與BCG組之間的統(tǒng)計學差異用兩組間線上的數(shù)字表示，CE組與PBS組和佐劑組之間的差異用PBS組和佐劑組柱上方的數(shù)字表示，①P<0.05, ②P<0.01, ③P<0.001, ④P<0.000 1。圖4 免疫小鼠脾細胞釋放的抗原特異性細胞因子水平Fig.4 Antigen specific cytokine levels released from the splenocytes of the immunized mice

2.5 不同免疫組的分枝桿菌體外生長抑制試驗結(jié)果 將不同免疫組的脾細胞與分枝桿菌共培養(yǎng)4 d后，用水裂解細胞釋放胞內(nèi)的分枝桿菌并涂板，計算結(jié)核分枝桿菌生長菌落數(shù)，并比較不同組間菌落數(shù)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CE組CFU數(shù)均低于PBS與佐劑組(tPBS=8.2，t佐劑組=7.4，均P<0.000 1)，CE組與BCG組間的CFU數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(t=0.8，P>0.05，圖5)。

注：小鼠脾細胞體外與H37Rv共培養(yǎng)后，各免疫組的分支桿菌生長抑制情況，CE組與PBS組和佐劑組之間的差異用PBS組和佐劑組柱上方的數(shù)字表示，④P<0.000 1。圖5 免疫小鼠體外抑制分枝桿菌生長的結(jié)果Fig.5 Results of in vitro inhibition of Mycobacterium tuberculosis growth in immunized mice

3 討 論

亞單位疫苗的主要缺點之一是單一抗原導致的弱免疫原性，因而將強免疫原性的蛋白融合表達是提高蛋白疫苗免疫原性和保護效率的有效策略[24]。ESAT6具有潛在的溶細胞活性，曾有研究將ESAT6與Ag85B一同構(gòu)建融合蛋白，此舉雖然減弱了ESAT6的細胞溶解活性，提高了抗原的免疫原性，但是沒有明顯提高免疫保護作用[25]。CFP10和ESAT6兩個基因位置毗鄰，能夠同時轉(zhuǎn)錄，協(xié)同表達，并在功能上也以復合物的形式發(fā)揮作用[4]。CFP10與ESAT6的單個蛋白分子量較小，但兩者串聯(lián)融合后分子量增大，穩(wěn)定性較好，有利于提高蛋白的免疫原性。有研究將CFP10和ESAT6這兩個強T細胞免疫優(yōu)勢抗原融合表達，形成保持在結(jié)核分枝桿菌中的天然位置順序的CE融合蛋白，經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)具有良好的抗原性[26]，且被證明能夠輔助診斷結(jié)核[14,27]。為系統(tǒng)評價2個蛋白融合后的免疫反應表現(xiàn)，本研究使用CE融合蛋白，并結(jié)合傾向誘導體液免疫反應的鋁佐劑免疫小鼠，以初步探討CE融合蛋白的免疫效果。

雖然人體對MTB的防御以細胞免疫為主，但近年來的研究發(fā)現(xiàn)體液免疫與細胞免疫相互協(xié)調(diào)，共同參與對MTB的免疫防御：與抗體結(jié)合的MTB復合物更容易被巨噬細胞通過結(jié)晶段受體(FcRs)和補體受體吞噬[28]；針對MTB的特異性抗體可促進吞噬溶酶體融合；MTB特異性抗體也可通過自然殺傷(NK)細胞介導的抗體依賴的細胞毒性刺激殺傷MTB感染的宿主細胞，此外，MTB特異性抗體可能具有直接殺滅菌體的能力或中和活性，這種特異性抗體已被證明能夠促進巨噬細胞中的炎性小體激活。我們的研究結(jié)果表明，CE融合蛋白免疫小鼠后可誘導高水平的抗原特異性IgG、IgG1和IgG2a的分泌。IgG2a是CD4+Th1型抗體，而IgG1是CD4+Th2型抗體，當IgG1/IgG2a比值大于1時，免疫反應傾向于Th2型。本研究雖然CE融合蛋白誘導的IgG1與IgG2a水平均高于BCG組，但CE組與BCG組的IgG1/IgG2a比值均大于1，且差異無統(tǒng)計學意義, 表明CE誘導了類似BCG的偏向CD4+Th2型的細胞免疫反應，提示CE融合蛋白與鋁佐劑混合具有較強誘導體液免疫應答的能力。

本研究利用ELISpot和ELISA技術檢測了與機體免疫防御MTB有關的9種細胞因子，包括IFN-γ，TNF-α，GM-CSF，IL-2，IL-12p70，IL-6，IL-10，IL-4和IL-17/IL-17A。目前已知樹突狀細胞、巨噬細胞、B細胞等抗原提呈細胞在機體先天免疫和適應性免疫之間中具有重要的作用。粒細胞-巨噬T細胞分泌的細胞集落刺激因子(GM-CSF)可以促進樹突狀細胞的增殖和成熟[29]，成熟的樹突狀細胞可分泌多種已被證實具有保護作用的細胞因子如IL-12、TNF-α和IFN-γ，這些細胞因子作用于天然CD4+T細胞(Th0細胞)使其分化為Th1細胞。Th1細胞產(chǎn)生的IFN-γ、IL-2和TNF-α能有效激活CD8+T細胞和巨噬細胞，CD8+T細胞通過產(chǎn)生穿孔素、顆粒酶、活性氧和活性氮等清除細胞內(nèi)MTB。成熟的樹突狀細胞還可以產(chǎn)生IL-4，使Th0細胞分化為Th2細胞，Th2細胞通過分泌IL-4、IL-5和IL-10等介導體液免疫反應，從而影響B(tài)淋巴細胞的功能[30]。此外，促炎細胞因子IL-17的產(chǎn)生以及Th17的反應性對于控制小鼠MTB感染很重要，IL-17可誘導多種分子的產(chǎn)生[31]，包括與粒細胞生成、中性粒細胞或淋巴細胞募集和先天免疫反應相關的促炎細胞因子(如IL-6、TNF-α和IL-1β，這些參與巨噬細胞向促炎性殺菌Ⅰ型極化的細胞因子，可將單核細胞招募到感染損傷部位并激活單核細胞參與殺死病原體，從而啟動抑制分枝桿菌生長的一系列事件)和一些趨化因子及抗菌分子。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CE組誘導產(chǎn)生的IFN-γ無論是檢測SFC數(shù)量還是細胞因子濃度，與BCG組比較，均未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計學意義，但是CE組IL-4的SFC數(shù)量以及細胞因子濃度均高于BCG組，且CE組的IFN-γ/IL-4 比值顯著低于BCG組，表明雖然實驗使用了誘導偏向CD4+Th2型細胞免疫的鋁佐劑，CE抗原經(jīng)細胞因子檢測仍舊體現(xiàn)出類似BCG免疫的偏向CD4+Th1型的細胞免疫反應，只是程度稍弱，因此CE抗原與鋁佐劑混合免疫引起了Th1與Th2混合型免疫反應。此外，CE組誘導產(chǎn)生了與BCG組相同水平的保護性細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-12、IL-17，而且CE組誘導產(chǎn)生的GM-CSF、IL-6、IL-10、IL-4高于BCG組，表明了CE融合蛋白與鋁佐劑混合免疫，具有誘導小鼠產(chǎn)生高水平細胞免疫應答的能力。

目前尚無明確的可評價肺結(jié)核保護性免疫的相關檢測指標，因此常采用觀察接種疫苗動物經(jīng)攻毒實驗后，抑制分枝桿菌復制能力的方法來評價疫苗保護效果。而且由于MTB的胞內(nèi)生存方式，能夠抑制體內(nèi)分枝桿菌復制的免疫反應從邏輯上可定義為保護性反應，研究發(fā)現(xiàn)體外分枝桿菌生長抑制試驗(Mycobacterial growth inhibion assay，MGIA)可將多種體外功能試驗與保護效果相聯(lián)系，如從BCG免疫小鼠的脾細胞可觀察到重復的分枝桿菌生長抑制現(xiàn)象，并且抑制效果與免疫后攻毒實驗的體內(nèi)抑菌效果一致[32]。因此，借助MGIA評價疫苗效果被認為是選擇候選疫苗或快速進入昂貴的疫苗臨床開發(fā)階段的篩選策略[33]。需要注意的是，盡管MGIA實驗有一定的評價效果，但其還不能取代體內(nèi)攻毒實驗。

采用MGIA觀察疫苗抑制MTB增殖的效果，雖然與免疫-動物攻毒-細菌載量評價具有一定的差距，但也為抗原的免疫保護性能預測提供了一定的依據(jù)。本研究的MGIA結(jié)果顯示，CE組小鼠脾淋巴細胞與H37Rv共培養(yǎng)后的CFU均顯著低于PBS與佐劑組，表明CE組可以在體外抑制H37Rv的生長，并且CE組的CFU與BCG組未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計學意義，表明這種體外抑制程度與BCG組相當，提示CE融合蛋白與鋁佐劑混合免疫具有誘導小鼠產(chǎn)生抗MTB感染免疫保護性的能力。

綜上所述，在對CFP10和ESAT6串聯(lián)融合表達的CE融合抗原免疫小鼠效果的初步探索中，我們發(fā)現(xiàn)CE融合抗原具有良好的免疫原性，與鋁佐劑混合使用可以誘導小鼠產(chǎn)生類似BCG的Th1與Th2混合型免疫反應，并且具有與BCG免疫相當?shù)捏w外抑制MTB生長的能力，表明CE具有良好的結(jié)核疫苗研制應用價值，可作為研制結(jié)核病新疫苗的候選成分之一，為進一步研究結(jié)核病新疫苗提供了科學基礎。本研究檢測了與機體免疫防御MTB有關的9種細胞因子，并使用了鋁佐劑增強免疫效果，但是本研究僅對于各項檢測指標在免疫后29 d進行了檢測，而且本次研究使用了同一批次的小鼠并在評估CE抑制MTB生長的能力的時候使用了MGIA這一體外實驗，因此在后續(xù)的研究中我們將進行不同批次小鼠的免疫，檢測多個時間點，并進一步采用體內(nèi)攻毒實驗觀察CE聯(lián)合其他免疫優(yōu)勢抗原接種動物模型后是否使其擁有抑制MTB在體內(nèi)生長的能力，并進行免疫效果的評價。

利益沖突：無

引用本文格式：欒秀麗，范雪亭，王瑞歡，等. 結(jié)核分枝桿菌CFP10-ESAT6融合蛋白免疫小鼠效果初步評價[J]. 中國人獸共患病學報，2022，38(7)：589-596. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.093