外泌體中circ-RPPH1通過circ-RPPH1/miR-146b-3p/MUC19通路軸調控乳腺癌對紫杉醇的耐藥性

趙玥， 付永強， 周真林， 楊明， 黃維超， 方雅蘭

據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究中心(IARC)發(fā)布的全球癌癥負擔數(shù)據(jù)顯示，2020年全球乳腺癌新發(fā)病例高達226萬例，成為全球第一大癌癥[1]。手術、放療、化療、靶向治療是乳腺癌的主要治療手段[2]，其中化療在乳腺癌綜合治療中占有不可替代的地位，但是幾乎不可避免的化療耐藥一直是限制乳腺癌治療的瓶頸[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌耐藥與乳腺癌患者復發(fā)及轉移緊密相關，耐藥乳腺癌更易發(fā)生遠處轉移，而轉移的乳腺癌更具藥物耐受性[4]，這也成為乳腺癌治療過程中的主要障礙和難題。

外泌體可以參與腫瘤及腫瘤耐藥的調節(jié)[5]，外泌體是細胞分泌的納米級膜微粒，它是包含了復雜RNA、蛋白質、細胞因子、轉錄因子受體等活性物質的小膜泡(30～150 nm)[6]。機體的多種細胞均可分泌外泌體，其廣泛分布于唾液、血漿、乳汁等體液中。外泌體可以參與細胞間通訊，是轉移物質及信息蛋白質、信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)的優(yōu)良中介，而不需要直接的細胞間接觸[7]。研究表明，腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境中的基質細胞均可分泌攜帶有耐藥相關分子的外泌體，并通過外泌體在腫瘤微環(huán)境中相互作用，從而調節(jié)腫瘤細胞對藥物的耐受性[8]。

環(huán)狀RNA(circRNA)是具有環(huán)形結構的內源性非編碼RNA，它通過外顯子環(huán)化或內含子環(huán)化將3′和5′末端連接起來，形成完整的環(huán)形結構[9]。circRNA可通過充當miRNA海綿，或是與蛋白質相結合，從而參與基因表達調控并影響蛋白質的功能。有研究發(fā)現(xiàn)circRNA與腫瘤存在緊密關聯(lián)[10]。其高度穩(wěn)定性和特異性使之有望成為腫瘤潛在的預測及治療靶點[11]。本研究通過研究外泌體中circ-RPPH1對乳腺癌耐藥細胞生物學功能的影響，以期探究circ-RPPH1在乳腺癌耐藥中的分子調節(jié)機制。

1 資料與方法

1.1 生物信息數(shù)據(jù)檢索

檢索高通量基因表達數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus，GEO)，分析乳腺癌患者腫瘤組織與正常組織間差異表達的circRNA，通過circular RNA interactome數(shù)據(jù)庫預測目標circRNA的靶向miRNA，通過TargetScan數(shù)據(jù)庫預測靶向miRNA的下游靶向關系。

1.2 病例資料

收集2020年2月至2021年10月遵義醫(yī)科大學附屬貴航三OO醫(yī)院診治的53例乳腺癌患者，均經病理學證實，均使用紫杉醇行新輔助化療，依據(jù)化療過程中腫瘤體積的變化程度進行分類：腫瘤體積縮小為紫杉醇敏感組(24例)，腫瘤體積不變或進展為紫杉醇耐藥組(29例)；另選擇同期我院收治的非乳腺癌患者(33例)作為正常組。取3組患者的血清學樣本及手術切除組織樣本，存放于液氮中，冷凍過夜后再轉移至-80 ℃低溫冰箱中保存。

1.3 主要細胞和試劑

乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231和正常乳腺上皮細胞MCF-10A均購自美國ATCC公司。MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX細胞、小干擾RNA(siRNA)和慢病毒均由泰安華啟生物科技有限公司構建。全外泌體純化試劑(Total Exosome Isolation Reagent)購自美國Thermo公司。miRNA分離試劑盒(miRNA Isolation Kit)、TRIzol RNA試劑盒購自美國Invitrogen公司。多合一miRNA RT-qPCR檢測試劑盒購自美國GeneCopoeia公司。反轉錄試劑盒(ReverTra Ace qPCR RT Kit)購自日本Toyobo公司。熒光素酶活性檢測試劑盒、Magna RIP RNA結合蛋白免疫沉淀試劑盒、Imax轉染試劑及MTT試劑盒購自英國Abcam公司。黏蛋白19(MUC19)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自美國MyBioSource公司。RIPA緩沖液、超敏ECL化學發(fā)光試劑盒和蛋白質定量試劑盒均購自南京維諾贊公司。Transwell小室購自美國Corning公司。10只BALB/c-nu型裸鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

1.4 方法

1.4.1 circ-RPPH1/miR-146b-3p/MUC19篩選

通過GEO數(shù)據(jù)庫分析乳腺癌患者腫瘤組織與正常組織差異表達的circRNA，借助circRNA表達譜熱圖分析篩選出circ-RPPH1；通過circular RNA interactome數(shù)據(jù)庫預測circ-RPPH1靶向miRNA的為miR-146b-3p；通過TargetScan數(shù)據(jù)庫預測靶向miR-146b-3p的下游靶向為MUC19。

1.4.2 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測circ-RPPH1和miR-146b-3p表達水平 于53例乳腺癌患者中隨機選取33例作為乳腺癌組，分別取乳腺癌組與正常組、紫杉醇敏感組與耐藥組患者血清，應用TRIzol RNA試劑盒分別提取細胞RNA，將RNA反轉錄生成cDNA，以GAPDH為內參，使用SYBR Green Ⅰ進行RT-qPCR檢測各組血清circ-RPPH1表達水平。使用miRNA分離試劑盒分離miR-146b-3p，miRNA RT-qPCR 檢測試劑盒反轉錄miR-146b-3p，TRIzol RNA試劑盒提取總RNA，反轉錄為cDNA，以U6為內參，qRT-PCR檢測miR-146b-3p表達情況，以2-ΔΔCt計算其表達水平。circ-RPPH1正向引物：5′-TTGGGAAGGTCTGAGACTAGGG-3′;反向引物5′-CCACTGATGAGCTTCCCTCC-3′。GAPDH正向引物：5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′;反向引物：5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3′。miR-146b-3p正向引物：5′-TGAGAACTGAATTCCATAGGCT-3′;反向引物：5′-GCACTGTCAGACCGAGACAAG-3′。U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT3′;反向引物：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC3′。

1.4.3 ELISA測定MUC19水平 使用MUC19 ELISA試劑盒按照說明書操作，測定450 nm波長處的吸光度值，記錄MUC19濃度。

1.4.4 外泌體分離 使用全外泌體純化試劑盒，選取狀態(tài)較好的乳腺癌耐藥細胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX細胞，培養(yǎng)48 h后，加入新鮮的不含外泌體血清的細胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集20 ml細胞培養(yǎng)液，4 ℃、300 ×g離心30 min，取上清液，經0.22 μm濾過膜過濾后，加入50 kd超濾管中，4 ℃、4 000 ×g離心10 min，吸取2 ml濃縮細胞培養(yǎng)液至新的離心管中，加入1 ml外泌體提取試劑，混勻后4 ℃過夜，4 ℃、10 000 ×g離心1 h，棄上清液，用200 μl PBS重懸沉淀，用于后續(xù)鑒定分析。

1.4.5 外泌體鑒定 用透射電鏡觀察外泌體形態(tài)：取20 μl外泌體懸液，均勻涂布在電鏡銅網(wǎng)上，室溫放置10 min；用濾紙吸干液體，然后用30 μl磷鎢酸(20 mg/ml)對外泌體樣品室溫負染1 min，濾紙吸干液體后，放于烤燈下烤干，安裝銅網(wǎng)于樣品槽中，在透射電鏡下觀察外泌體的形態(tài)并拍照；采用Western blotting法檢測外泌體標志蛋白，將提取的細胞外泌體蛋白經BCA法蛋白定量后，取20 μg樣品，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質，轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂牛奶封閉，PBS洗滌，將膜與CD63、CD9、CD81及TSG101一抗孵育，4 ℃過夜，然后與二抗孵育 1 h，與ECL試劑溫育后分析印跡。

1.4.6 外泌體攝取實驗 取耐藥細胞外泌體200 μl，與1 ml細胞膜熒光標志試劑(PKH67)混勻，室溫孵育5 min后，加入2 ml BSA(0.5%)結合過量的PKH67終止染色，然后使用外泌體沉淀液沉淀出PHK67標記的外泌體，用9.6 ml基礎培養(yǎng)基重懸沉淀；取250 μl PKH67標記的外泌體，與乳腺癌細胞在37 ℃共孵育3 h，PBS清洗細胞后，室溫固定1 h，DAPI染色10 min，利用熒光顯微鏡觀察外泌體攝入情況。

1.4.7 circ-RPPH1外結構驗證 將紫杉醇耐藥乳腺癌細胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX分為3組，不加入試劑者為對照組，加入核酸內切酶(RNaseA)者為RNaseA組，加入核酸內切酶+去垢劑(RNaseA+Trition X100)者為RNaseA+Trition X100組，檢測每組細胞中的circ-RPPH1含量。

1.4.8 紫杉醇耐藥性檢測 以半數(shù)抑制濃度(IC50)表示細胞系對紫杉醇的耐藥性，用GraphPad Prism7軟件計算乳腺癌細胞系、乳腺癌耐藥細胞系及敲低circ-RPPH1表達后乳腺癌耐藥細胞系的IC50值。

1.4.9 細胞培養(yǎng) 將紫杉醇耐藥乳腺癌細胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX培養(yǎng)于含有10%胎牛血清及0.1%的雙抗青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。然后置于37 ℃含5%CO2的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，根據(jù)細胞的情況更換新鮮的培養(yǎng)基。待細胞融合度達80%左右進行傳代培養(yǎng)。

1.4.10 siRNA轉染 待細胞融合度達30%～50%，加入5 μl siRNA轉染，培養(yǎng)24 h后，收集細胞并提取RNA，作為si-circ-RPPH1組，以空白質粒(si-NC)作參照為si-NC組，使用RT-qPCR法檢測各組circRNA的量。siRNA正向引物：5′-CGGGGAGGGAAGCUCAUCATT-3′；反向引物：5′-UGAUGAGCUUCCCUCCCCGTT-3′。

1.4.11 細胞增殖實驗 將細胞以合適的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，分別選取培養(yǎng)不同時間的細胞進行增殖能力測定。分別向每個細胞孔中加入20 μl MTT溶液(5 μg/ml)，孵育4 h。輕輕吸取上層培養(yǎng)基后，向每孔中加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，以充分溶解結晶物，于490 nm波長處測定吸光度值，為了便于統(tǒng)計分析，將吸光度值乘以100倍。

1.4.12 細胞遷移及侵襲實驗 ①遷移實驗：用2 ml含1%FBS的新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞接種于12孔板中，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，用PBS清洗2次，加入4%多聚甲醛固定，于4 ℃冰箱中固定30 min，經PBS清洗后以結晶紫染色20 min，在顯微鏡下拍照3個視野，計數(shù)其細胞數(shù)并取其平均數(shù)。②侵襲實驗：基質膠4 ℃過夜融化后，用無血清培養(yǎng)基稀釋至1 mg/ml，取100 μl稀釋后，將基質膠加入Transwell上室，于37 ℃培育4 h使之形成膠狀，后續(xù)步驟同遷移實驗。

1.4.13 克隆形成實驗 將細胞消化重懸后計數(shù)，以1 000個/孔接種于6孔板中，每組設3個復孔。將細胞放入培養(yǎng)箱孵育2周，用結晶紫染色30 min，PBS沖洗3次，統(tǒng)計克隆形成數(shù)。

1.4.14 流式細胞儀檢測細胞周期 將細胞接種于6孔板，濃度調整為2×106/ml，于37 ℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)細胞周期檢測試劑盒說明書加入試劑處理細胞，置于流式細胞儀中檢測細胞周期。

1.4.15 RNA結合蛋白免疫沉淀(RIP) 收集細胞，用磁珠和抗Ago2抗體孵育24 h后，洗滌后用蛋白酶K消化蛋白，依次用酚-氯仿-異戊醇試劑純化RNA，用RT-qPCR檢測RNA，以IgG作為陰性對照。用3′-生物素化miRNA模擬物轉染細胞，然后裂解細胞并與鏈霉抗生物素蛋白偶聯(lián)珠孵育，形成生物素-miRNA-circRNA復合物，用蛋白酶K消化后，用RT-qPCR檢測circRNA含量，以此證實miRNA與circRNA結合。

1.4.16 雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測熒光素酶活性 根據(jù)circ-RPPH1、miRNA和mRNA結合位點，利用軟件設計對應引物，并構建野生型、突變型circ-RPPH1熒光素酶載體，收集各組轉染48 h的細胞，用熒光素酶活性檢測試劑盒檢測熒光素酶的活性。

1.4.17 裸鼠移植瘤模型體內腫瘤生長情況及其與circ-RPPH1的關系 于裸鼠背部右側皮下注射穩(wěn)轉circ-RPPH1的細胞，構建裸鼠移植腫瘤模型，實驗分為2組：空白對照組(sh-NC組)、質粒包裹的circ-RPPH1組(sh-circ-RPPH1組)，每組各3例，每3天測一次裸鼠的腫瘤體積，待腫瘤生長到一定體積，取出腫瘤，測定小鼠腫瘤的體積及質量，繪制腫瘤生長曲線，同時檢測circ-RPPH1的表達情況。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 circ-RPPH1在乳腺癌組織與正常組織中的表達情況

circRNA表達譜熱圖及GEO數(shù)據(jù)分析circ-RPPH1表達圖譜結果顯示，circ-RPPH1在乳腺癌患者與正常組織中存在差異化表達，見圖1。

圖1 circ-RPPH1在乳腺癌組織與正常組織中存在差異化表達

2.2 乳腺癌與非乳腺癌患者血清中circ-RPPH1的表達水平比較

乳腺癌組血清中的circ-RPPH1表達水平高于正常組(3.16±0.79vs.1.30±0.51，t=11.421，P<0.001)；紫杉醇耐藥組患者血清中的circ-RPPH1表達水平高于紫杉醇敏感組(9.27±1.22vs.2.73±0.84，t=23.062，P<0.001)，見圖2。

圖2 乳腺癌與非乳腺癌患者血清中circ-RPPH1的表達水平比較

2.3 circ-RPPH1在乳腺癌細胞系及紫杉醇耐藥乳腺癌細胞系中的表達水平

乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231中circ-RPPH1的表達水平為(1.89±0.15)、(2.56±0.25)，均高于正常乳腺上皮細胞MCF-10A中circ-RPPH1的表達水平(1.00±0.08)，差異有統(tǒng)計學意義(t=8.810、10.163，P<0.001)。紫杉醇耐藥乳腺癌細胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX中circ-RPPH1的表達水平為(3.69±0.35)、(5.32±0.55)，均高于乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231中circ-RPPH1的表達水平(t=8.187、7.902，P<0.001，圖3)。

圖3 circ-RPPH1在正常乳腺上皮細胞、乳腺癌細胞系及紫杉醇耐藥乳腺癌細胞系中的表達水平比較

2.4 circ-RPPH1在乳腺癌紫杉醇耐藥組和紫杉醇敏感組患者血清外泌體中的表達水平

乳腺癌紫杉醇耐藥組患者血清外泌體中的circ-RPPH1水平高于乳腺癌紫杉醇敏感組(11.23±1.37vs.3.93±0.86)，差異有統(tǒng)計學意義(t=7.886，P<0.001)。

2.5 外泌體觀察和鑒定

透射電鏡掃描可見，乳腺癌耐藥細胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX細胞中的外泌體均表現(xiàn)為典型的直徑60～100 nm的囊泡狀結構；且血清及細胞外泌體中均表達CD63、CD9、CD81和TSG101，上清液中則無此4種標志蛋白表達，見圖4。

圖4 外泌體照片及外泌體免疫印跡檢測結果

2.6 乳腺癌耐藥細胞中circ-RPPH1含量比較

在紫杉醇乳腺癌耐藥細胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX中，RNaseA+Trition X100組的circ-RPPH1含量為(0.36±0.05)、(0.20±0.04)，均低于RNaseA組的circ-RPPH1含量(分別為0.90±0.12、0.95±0.09)，差異有統(tǒng)計學意義(t=10.767、12.865，P<0.001，圖5)。

圖5 對照組、RNaseA組、RNaseA+Trition X100組中circ-RPPH1含量比較

2.7 外泌體負責轉運circ-RPPH1并影響乳腺癌細胞的耐藥能力

外泌體攝取實驗中，乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231攝取乳腺癌耐藥細胞外泌體后circ-RPPH1的表達水平為(2.60±0.25)、(3.90±0.33)，均高于PBS處理組中circ-RPPH1的表達水平(1.00±0.12、1.00±0.15)，差異有統(tǒng)計學意義(t=9.993、13.857，P<0.001，圖6A)。

敲低乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231中circ-RPPH1的表達后，circ-RPPH1的表達量為(1.45±0.15)、(1.75±0.17)，低于si-NC組circ-RPPH1的表達量(2.60±0.25)、(4.00±0.40)，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.832、8.967，P<0.001，圖6B)；乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231對紫杉醇的IC50為(24.30±2.40)nmol/L、(18.30±1.80)nmol/L，低于si-NC組的IC50為(40.00±3.20)nmol/L、(31.00±2.20)nmol/L，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.798、7.739，P<0.001，圖6C)。

6A：共孵化后乳腺癌細胞系攝取circ-RPPH1水平；6B：敲低circ-RPPH1后乳腺癌細胞系中circ-RPPH1表達水平；6C：敲低circ-RPPH1后乳腺癌細胞系對紫杉醇耐藥能力的影響圖6 外泌體負責轉運circ-RPPH1并影響乳腺癌細胞的耐藥能力

2.8 外泌體中circ-RPPH1調控乳腺癌耐藥細胞系對紫杉醇的耐藥能力

乳腺癌耐藥細胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX對PTX耐藥性的IC50為(193.0±10.8)nmol/L、(132.0±12.3)nmol/L，分別高于乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231對PTX的IC50(21.2±1.8)nmol/L、(14.5±1.2)nmol/L，差異有統(tǒng)計學意義(t=27.1178、16.468，P<0.001，圖7)。敲低乳腺癌耐藥細胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX中circ-RPPH1的表達后，circ-RPPH1的表達水平為(0.30±0.04)、(0.36±0.06)，低于si-NC組(1.02±0.15、1.00±0.09)，差異有統(tǒng)計學意義(t=8.033、10.248，P<0.001，圖8A)；乳腺癌耐藥細胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX對紫杉醇的IC50為(89.0±8.0)nmol/L、(72.0±7.0)nmol/L，分別低于si-NC組(182.0±14.0)nmol/L、(131.0±14.0)nmol/L，差異有統(tǒng)計學意義(t=9.990、6.999，P<0.001，圖8B)。

圖7 乳腺癌細胞系及耐藥細胞系對紫杉醇的耐藥性

8A：敲低circ-RPPH1后乳腺癌耐藥細胞系中circ-RPPH1的表達；8B：敲低circ-RPPH1后乳腺癌耐藥細胞系對紫杉醇的耐藥情況圖8 circ-RPPH1調控乳腺癌耐藥細胞系對紫杉醇的耐藥能力

2.9 敲低乳腺癌耐藥細胞系中circ-RPPH1表達后乳腺癌耐藥細胞增殖、遷移及侵襲能力變化

敲低乳腺癌耐藥細胞系中circ-RPPH1的表達后，增殖實驗中乳腺癌耐藥細胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX在490 nm波長處的吸光度值分別為(33.0±3.0)、(42.0±4.0)，低于Si-NC組的吸光度值(95.0±8.0、110.0±12.0)，差異有統(tǒng)計學意義(t=12.569、9.311，P<0.001，圖9)。遷移實驗中乳腺癌耐藥細胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX細胞計數(shù)為(55.0±5.0)個、(63.0±6.0)個，低于Si-NC組細胞計數(shù)(105.0±9.0)個、(159.0±13.0)個，差異有統(tǒng)計學意義(t=8.412、11.613，P<0.001，圖10)。侵襲實驗中乳腺癌耐藥細胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX細胞計數(shù)為(52.0±5.0)個、(68.0±6.0)個，低于Si-NC組細胞計數(shù)(110.0±10.0)個、(147.0±12.0)個，差異有統(tǒng)計學意義(t=8.985、10.199，P<0.001，圖11)。

圖9 敲低circ-RPPH1后乳腺癌耐藥細胞系增殖情況

圖10 敲低circ-RPPH1后乳腺癌耐藥細胞系遷移情況

圖11 敲低circ-RPPH1后乳腺癌耐藥細胞系侵襲情況

2.10 敲低circ-RPPH1后乳腺癌耐藥細胞株細胞周期的變化

敲低circ-RPPH1的表達后，乳腺癌耐藥細胞系細胞DNA合成受阻，細胞阻滯于S期，見圖12、表1。

圖12 敲低circ-RPPH1后乳腺癌耐藥細胞系細胞周期

表1 敲低circ-RPPH1表達后乳腺癌耐藥細胞系細胞周期變化

2.11 circ-RPPH1與miR-146b-3p之間存在靶向調控關系

經circular RNA interactome數(shù)據(jù)庫檢測circ-RPPH1直接關聯(lián)的miRNAs，預測circ-RPPH1與miR-146b-3p之間具有靶向關系，見圖13。雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測，野生型circ-RPPH1與miR-146b-3p結合后熒光數(shù)減少，提示野生型circ-RPPH1與miR-146b-3p結合且結合后下調miR-146b-3p啟動子表達，見表2；RIP法檢測circ-RPPH1與miR-146b-3p關系表明，circ-RPPH1可與miR-146b-3p相結合，見表3。紫杉醇耐藥組患者血清miR-146b-3p表達水平為0.84±0.41，低于敏感組(3.12±0.75)，差異有統(tǒng)計學意義(t=14.109，P<0.001，圖14)；乳腺癌耐藥患者血清中circ-RPPH1與miR-146b-3p表達水平呈負相關(r=-0.754，P<0.001，圖15)。

圖13 circ-RPPH1與miR-146b-3p具有靶向關系

表2 野生型及突變型circ-RPPH1與miR-146b-3p結合后熒光數(shù)

表3 circ-RPPH1與miR-146b-3p結合后IgG、Ago2檢測

圖14 兩組患者血清miR-146b-3p表達水平比較

圖15 circ-RPPH1與miR-146b-3p表達水平呈負相關

2.12 miR-146b-3p與MUC19之間存在靶向關系

用TargetScan對miR-146b-3p的靶基因進行預測，推測miR-146b-3p與MUC19之間存在一定的靶向關系，見圖16。雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測，見野生型MUC19 3′UTR與miR-146b-3p結合后可檢測熒光數(shù)量較前減少，提示miR-146b-3p可與野生型MUC19結合且負向調控，見表4。RIP檢測二者關系結果顯示，miR-146b-3p可與MUC19結合，見表5。紫杉醇耐藥組患者血清MUC19吸光度值高于敏感組(4.73±1.01vs.1.51±0.55)，差異有統(tǒng)計學意義(t=13.961，P<0.001，圖17)；乳腺癌耐藥患者血清MUC19與miR-146b-3p表達水平呈負相關(r=-0.562，P<0.001，圖18)。

圖16 miR-146b-3p與MUC19之間存在靶向關系

表4 miR-146b-3p與野生型及突變型MUC19結合后熒光數(shù)

表5 miR-146b-3p與MUC19結合后IgG、Ago2檢測

圖17 兩組患者血清MUC19吸光度值比較

圖18 MUC19與miR-146b-3p表達水平呈負相關

2.13 敲低circ-RPPH1腫瘤的生長情況

敲低circ-RPPH1后23 d，sh-circ-RPPH1組腫瘤體積較sh-NC組縮小[(410±90)mm3vs.(890±130)mm3]，差異有統(tǒng)計學意義(t=-5.263，P=0.006，圖19、20)；sh-circ-RPPH1組瘤體質量較sh-NC組降低[(400±120)mgvs.(840±160)mg]，差異有統(tǒng)計學意義(t=-3.812，P=0.019，圖21)；sh-circ-RPPH1組腫瘤中circ-RPPH1表達水平較sh-NC組下降(0.39±0.07vs.1.00±0.09)，差異有統(tǒng)計學意義(t=-9.267，P<0.001)。

圖19 裸鼠腫瘤照片

圖20 腫瘤體積變化

圖21 腫瘤質量變化

3 討論

乳腺癌耐藥仍是制約乳腺癌治療的一大瓶頸，其分子作用機制尚不完全明確，探究乳腺癌耐藥的發(fā)生機制，尋找新的標志物來有效逆轉乳腺癌耐藥，對于降低乳腺癌術后復發(fā)、轉移及提高生存率具有重要意義?，F(xiàn)已證實外泌體是細胞通訊中重要的調節(jié)者，其主要參與細胞間的物質交換和信息交流，在多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用[12]。已有多項研究發(fā)現(xiàn)外泌體參與調控乳腺癌耐藥過程，如Tang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，血清外泌體HOTAIR具有作為診斷和預后生物標志物的潛力，HOTAIR高表達與乳腺癌患者生存率和化療敏感性顯著相關。Zheng等[14]研究發(fā)現(xiàn)，外泌體lnc-AGAP2-AS1在曲妥珠單抗乳腺癌耐藥細胞中表達升高，抑制lnc-AGAP2-AS1的表達可以增加化療敏感性，含lnc-AGAP2-AS1的外泌體與敏感細胞共培養(yǎng)可減少曲妥珠單抗誘導的細胞死亡。Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌耐藥細胞中l(wèi)nc-H19的表達增加，抑制H19可有效降低細胞活力、誘導細胞凋亡并顯著降低乳腺癌對阿霉素的耐藥性。此外，細胞外的H19可以通過與外泌體結合轉移到敏感細胞。用耐藥細胞的外泌體處理敏感細胞可增加敏感細胞的耐藥性，而下調敏感細胞中的H19則可增加細胞對阿霉素的敏感性。Dong等[16]發(fā)現(xiàn)外泌體lnc-SNHG14能夠參與調節(jié)曲妥珠單抗的耐藥性，外泌體lnc-SNHG14可能通過靶向Bcl 2/BAX信號通路來影響曲妥珠單抗的化療敏感性。本研究結果顯示，circ-RPPH1在乳腺癌患者血清、乳腺癌細胞系中表達升高，特別在紫杉醇耐藥細胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX中表達明顯增高；circ-RPPH1由外泌體包裹轉運，circ-RPPH1表達量可影響乳腺癌細胞對紫杉醇的耐藥性，提示circRNA與腫瘤耐藥密切相關，有望成為一種新型生物標志物及臨床治療靶點。

目前大量研究發(fā)現(xiàn)circRNA參與調控乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程[17]。Yang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，敲低circ-ABCB10可促進乳腺癌耐藥細胞對紫杉醇的敏感性，抑制紫杉醇耐藥細胞的侵襲和自噬，其作用機制是circ-ABCB10通過海綿化let-7a-5p影響DUSP7的表達，進而調節(jié)紫杉醇耐藥細胞的敏感性、凋亡、侵襲及自噬等過程。Liang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，circ-KDM4C在乳腺癌組織中表達降低，且較低的circ-KDM4C表達與乳腺癌的不良預后和轉移有關，且circ-KDM4C在體內外都能顯著抑制乳腺癌的增殖、轉移及阿霉素耐藥性，其作用機制是circ-KDM4C通過靶向miR-548p/PBLD軸影響乳腺癌細胞的生物學過程。Liang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，circ-BMPR2在乳腺癌轉移組織中表達較低，circ-BMPR2的表達與乳腺癌細胞的活力呈負相關；功能研究發(fā)現(xiàn)敲低circ-BMPR2可有效促進細胞的增殖、遷移和侵襲，下調circ-BMPR2可增加乳腺癌細胞對他莫西芬的耐藥性；機制研究發(fā)現(xiàn)circ-BMPR2可能作為miR-553的海綿發(fā)揮作用，進而減輕對USP4的抑制，從而抑制乳腺癌的進展及其對他莫西芬的耐藥。Sang等[21]建立耐他莫西芬的MCF-7細胞株，并通過RNA測序對其環(huán)狀RNA表達譜進行篩選，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0025202在耐藥細胞株和腫瘤組織中表達較低，功能研究證實hsa_circ_0025202可以抑制細胞增殖、集落形成和遷移，增加細胞凋亡和對他莫西芬的敏感性。機制研究證實hsa_circ_0025202可海綿化miR-182-5p調控FOXO3a的表達從而發(fā)揮抑瘤作用以及增加對他莫西芬的敏感性。上述研究為circRNA在乳腺癌中的研究奠定重要基礎。本研究顯示干擾circ-RPPH1的表達后乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231及乳腺癌耐紫杉醇細胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX的增殖、遷移、侵襲能力下降，細胞合成受阻，提示circ-RPPH1與乳腺癌發(fā)展存在密切關系，本研究也通過體外裸鼠實驗證實了這一點。同時本研究通過使用TargetScan、interactome預測circ-RPPH1/miR-146b-3p/MUC19之間存在一定的靶向關系，并通過實驗證實了該推測。

綜上所述，circ-RPPH1通過外泌體包裹轉運調控circ-RPPH1/miR-146b-3p/MUC19通路軸對乳腺癌耐藥細胞株生物學功能的影響，在調控乳腺癌耐藥細胞耐藥、增殖、克隆、遷移和侵襲能力等方面發(fā)揮重要作用；敲低circ-RPPH1表達可抑制乳腺腫瘤生長。