鈣磷蛋白表達在預(yù)測乳腺癌預(yù)后中的價值

陳秀， 李蕾， 張鶴達， 張建

乳腺癌是女性健康的首位殺手，每年發(fā)病率和死亡率遙遙領(lǐng)先[1]。目前乳腺癌的治療方法主要為手術(shù)治療、化學(xué)治療、靶向治療、免疫治療等綜合治療，隨著新技術(shù)、新藥物的研發(fā)，乳腺癌患者的生存率有所提高，但仍有20%～30%的患者會出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)性死亡[2]。乳腺癌發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜機制和腫瘤特異性或分期特異性標志物的缺失進一步加大了治療的難度。

骨轉(zhuǎn)移是乳腺癌最常見的遠處轉(zhuǎn)移，已知乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的主要病理生理基礎(chǔ)是腫瘤細胞促進骨組織中鈣離子的釋放，破壞了成骨細胞和破骨細胞之間的生理平衡[3]。鈣磷蛋白(calcyphosine，CAPS)是一種鈣結(jié)合蛋白家族成員，參與了鈣離子的轉(zhuǎn)運過程，在腫瘤骨轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮重要的作用。近來大量研究發(fā)現(xiàn)骨微環(huán)境中的免疫細胞和免疫相關(guān)因子主要與成骨細胞相互作用維持“骨平衡”，當(dāng)各種因素導(dǎo)致骨微環(huán)境中免疫細胞功能缺陷時，會促使腫瘤骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生[4]。同時有學(xué)者證實了腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的高密度浸潤對乳腺癌患者的骨轉(zhuǎn)移及預(yù)后具有明確的相關(guān)性[5]，由此探究腫瘤微環(huán)境相關(guān)免疫細胞與骨微環(huán)境之間的聯(lián)系為乳腺癌的治療開辟了新方向。然而，CAPS與乳腺癌微環(huán)境相關(guān)免疫細胞之間是否具有關(guān)聯(lián)尚無研究。

本研究通過分析CAPS在乳腺癌患者中的表達情況及與腫瘤相關(guān)免疫細胞的關(guān)系，探討CAPS在乳腺癌預(yù)后評估中的臨床價值及作為治療靶標的可能性。

1 資料與方法

1.1 UALCAN數(shù)據(jù)庫分析 UALCAN數(shù)據(jù)庫(http：//ualcan. path. uab. edu)中涵蓋了TCGA數(shù)據(jù)庫中31種惡性腫瘤的RNA-seq結(jié)果和臨床資料[6]，我們通過該數(shù)據(jù)庫分析乳腺癌組織和癌旁組織中基因的表達水平，以及在不同腫瘤分級、分期等臨床病理特征條件下基因的表達情況。

1.2 LinkedOmics LinkedOmics(http：//www.linkedomics.org/login.php)是分析TCGA數(shù)據(jù)庫中32個腫瘤相關(guān)多維數(shù)據(jù)集的一個平臺[7]。使用Pearson相關(guān)分析統(tǒng)計出CAPS的相關(guān)基因，并以火山圖、熱圖或散點圖展示。LinkedOmics平臺使用基因富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)計算出基因生理過程(GO_BP)、KEGG信號通路、激酶-靶點、miRNA-靶點、轉(zhuǎn)錄因子-靶點富集分析，F(xiàn)DR<0.05的相關(guān)基因會展示在圖表中。

1.3 Kaplan-Meier Plotter生存分析 Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站羅列了18 674個惡性腫瘤樣本(7 830例乳腺癌)患者，我們通過該網(wǎng)站分析CAPS與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系。CAPS檢測探針I(yè)D為226424_at。樣本根據(jù)CAPS的表達量分為低表達組和高表達組，通過K-M生存曲線和Log-rank方法分析基因和總生存期(overall survival，OS)、無復(fù)發(fā)生存期(relapse free survival，RFS)、無遠處轉(zhuǎn)移生存期(distant metastasis free survival，DMFS)的關(guān)系，并計算對應(yīng)的風(fēng)險病例數(shù)、風(fēng)險比(hazard ratios，HRs)、95%可信區(qū)間(confident intervals，CIs)、P值。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 TIMER2.0 TIMER(https：//cistrome. shinyapps. io/timer/)能夠?qū)CGA數(shù)據(jù)庫中不同惡性腫瘤的免疫微環(huán)境進行系統(tǒng)性分析，其囊括了32種惡性腫瘤的10 897樣本[8-9]。TIMER應(yīng)用反卷積法[10]反映腫瘤相關(guān)浸潤免疫細胞的數(shù)量(tumor-infiltrating immune cells，TIICs)。我們分析了乳腺癌患者CAPS和B細胞、CD4+ T淋巴細胞、CD8+ T淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、樹突細胞等免疫細胞及與腫瘤純度的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織與癌旁組織中CAPS的表達量比較TCGA數(shù)據(jù)庫中統(tǒng)計了1 076個乳腺癌組織樣本和114個癌旁組織樣本中標準化后CAPS基因的表達量，發(fā)現(xiàn)CAPS基因在乳腺癌組織的中位表達量為4.865/107，較癌旁組織中位表達量的3.146/107，呈現(xiàn)出明顯的高表達(圖1A)。CPTAC數(shù)據(jù)庫中統(tǒng)計了125個癌組織樣本CAPS蛋白表達量比18個癌旁組織樣本表達量高(圖1B)。因此，CPAS基因和蛋白均可以作為乳腺癌的潛在診斷因子。

*：P<0.05圖1 CAPS在乳腺癌組織與正常組織中的表達水平

2.2 不同亞組乳腺癌中CAPS的表達量比較 基于臨床病理學(xué)特征的多樣性，我們使用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析了TCGA-BRCA和CPTAC-BRCA中不同亞組患者體內(nèi)CAPS的基因和蛋白水平表達量，發(fā)現(xiàn)腫瘤分級、人種、性別、年齡、月經(jīng)狀態(tài)、分子分型、病理類型等亞組中，CAPS的表達量與對照組存在顯著性差異(圖2～3)。因此CAPS有希望作為判斷乳腺癌患者亞組甚至預(yù)后的潛在預(yù)測因子。

*：P<0.05圖2 不同亞組中CAPS基因的表達水平

*：P<0.05圖3 不同亞組中CAPS蛋白的表達水平

2.3 生存分析 使用Kaplan-Meier生存曲線分析TCGA數(shù)據(jù)庫中乳腺癌患者預(yù)后情況和CAPS的關(guān)系，根據(jù)CAPS的中位數(shù)將患者分為高表達組和低表達組，分析發(fā)現(xiàn)CAPS高表達組乳腺癌患者的OS、RFS、DMFS均較短(圖4，log-rank testP<0.05)。通過GO、KEGG分析發(fā)現(xiàn)CAPS可能參與人體的免疫調(diào)節(jié)。

注：OS為完全生存期；RFS為無復(fù)發(fā)生存期；DMFS為無遠處轉(zhuǎn)移生存期；HR為風(fēng)險比圖4 CAPS與乳腺癌OS、RFS、DMFS的生存曲線

2.4 免疫相關(guān)性 我們使用TIMER數(shù)據(jù)庫分析了CAPS與乳腺癌免疫微環(huán)境的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CAPS不僅與乳腺癌腫瘤純度相關(guān)(r=0.086，P<0.05)，而且與腫瘤微環(huán)境中的主要免疫細胞相關(guān)(圖5)。

圖5 CAPS與乳腺癌浸潤相關(guān)免疫細胞的關(guān)系

3 討論

乳腺癌骨轉(zhuǎn)移是乳腺癌診療過程中我們面臨的巨大挑戰(zhàn)，而骨轉(zhuǎn)移的病理生理機制主要是腫瘤細胞及腫瘤微環(huán)境阻礙了骨的生成和骨的破壞之間的動態(tài)平衡，在這個過程當(dāng)中鈣的代謝發(fā)揮著舉足輕重的作用。鈣結(jié)合蛋白是細胞第二信使系統(tǒng)的重要組成部分，密切參與了鈣離子的轉(zhuǎn)運過程，而CAPS作為鈣結(jié)合蛋白家族的成員，參與了鈣離子代謝的調(diào)節(jié)作用，從而進一步加速骨轉(zhuǎn)移的過程。

有研究收集了36例結(jié)直腸癌患者的癌組織和癌旁組織，發(fā)現(xiàn)癌組織中CAPS的含量顯著高于癌旁正常組織，然后結(jié)合臨床病理學(xué)特征分析發(fā)現(xiàn)CAPS的表達水平與結(jié)直腸癌患者的組織分級、侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移息息相關(guān)，因此推斷CAPS高表達可能預(yù)測結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后[11]。同時，CAPS的表達與非小細胞肺癌患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，高水平的CAPS可能促進非小細胞肺癌的轉(zhuǎn)移能力[12]。然而在肺腺癌中，研究發(fā)現(xiàn)CAPS的表達量明顯低于正常肺組織，并且在發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的肺腺癌患者中，CAPS低水平者的生存期更長[13]。由此我們推斷CAPS在不同實體腫瘤中可能發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)作用，本研究旨在探索CAPS是否參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程。

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中CAPS的基因和蛋白表達量遠高于癌旁正常組織，且高表達CAPS的乳腺癌患者生存期較短，我們推斷CAPS參與了乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。而不同腫瘤分期患者之間CAPS的基因和蛋白表達水平差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，分析其中原因可能是由于各個腫瘤分期的患者人數(shù)較少且不均質(zhì)，缺乏可比性，因此CAPS是否具有預(yù)測不良腫瘤分期的作用還需要更多的大樣本臨床研究來佐證。在不同人種之間CAPS的比較可以得出結(jié)論：黑人乳腺癌患者的CAPS基因表達水平高于白種人和黃種人患者。這與黑人乳腺癌患者的預(yù)后相對較差相一致[14]，側(cè)面證實了CAPS有評估乳腺癌患者預(yù)后的功能。在不同年齡段患者之間的比較發(fā)現(xiàn)：41～60歲患者中CAPS的基因表達明顯高于21～40歲患者，而與>60歲患者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，并且不同年齡段之間CAPS基因的表達未發(fā)現(xiàn)顯著差異性，由此我們推測在不同年齡段患者中CAPS蛋白的診斷價值可能高于預(yù)后評估價值。同時我們發(fā)現(xiàn)圍絕經(jīng)期患者的CAPS基因表達低于絕經(jīng)前和絕經(jīng)后患者，可能與納入研究的圍絕經(jīng)期患者數(shù)量較少有關(guān)，而不同月經(jīng)狀態(tài)下的CAPS蛋白水平的研究數(shù)據(jù)尚欠缺，同時考慮到基因只有在轉(zhuǎn)錄翻譯成蛋白分子后才發(fā)揮生理作用，因此該結(jié)論有待進一步研究證實。不同分子分型亞組分析中，luminal型患者CAPS基因表達較三陰型患者低，尤其低于BL1型和M型三陰型乳腺癌患者。考慮到納入蛋白層面研究的病例數(shù)較少，不同分子類型間CAPS蛋白水平的差異性無統(tǒng)計學(xué)意義。病理類型亞組分析中，由于組間數(shù)量的偏差性導(dǎo)致結(jié)論的可靠性有所欠缺，但CAPS蛋白在正常組織和IDC之間的差異性仍具有極高的可信度。

目前腫瘤微環(huán)境的調(diào)控已成為打破乳腺癌治療瓶頸的關(guān)鍵，腫瘤相關(guān)免疫細胞的功能與乳腺癌患者的預(yù)后息息相關(guān)[15]，這與本研究中高水平CD4+ T細胞乳腺癌患者生存期較長的結(jié)果相一致。針對接受內(nèi)分泌治療的激素受體陽性乳腺癌患者，約三分之一會因為耐藥性而使療效大打折扣[16]。有研究者將內(nèi)分泌治療耐藥患者和內(nèi)分泌治療敏感患者的乳腺癌組織中蛋白分子表達進行了比較，發(fā)現(xiàn)CAPS高表達的乳腺癌患者更容易發(fā)生內(nèi)分泌治療的耐藥性，具有一定程度的預(yù)測功能[17]。結(jié)合本研究中，在激素受體陽性患者中CAPS與免疫細胞的關(guān)系，尤其是與T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞的負相關(guān)關(guān)系，由此推斷CAPS可能通過抑制Luminal型乳腺癌患者體內(nèi)的免疫細胞功能從而誘導(dǎo)內(nèi)分泌藥物耐藥性的產(chǎn)生，最終影響患者的預(yù)后。

綜上，我們認為CAPS可以作為乳腺癌診斷的潛在分子標志物，并且CAPS可能通過調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)免疫細胞的功能導(dǎo)致乳腺癌的不良預(yù)后，尤其與激素受體陽性乳腺癌患者的預(yù)后緊密相關(guān)。