昆明滇池紅嘴鷗源沙門氏菌的分離鑒定、耐藥性及致病性分析

鄔佳莉 楊 勇 相德才 張文梅 代飛燕 段博芳 段 綱*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，昆明，650201；2.云南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，昆明，650201；3.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，昆明，650224；4.云南省金平縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，紅河，661599)

沙門氏菌(Salmonellaspp.)為腸桿菌科(Enterobacteriaceae)革蘭氏陰性短桿菌，無芽孢莢膜，需氧及兼性厭氧菌，血清型眾多。它是常見的人獸共患病原菌之一，可引起人和動(dòng)物多種疾病，全球每年大約有9 380萬例的沙門氏菌感染事件，并導(dǎo)致約15萬的感染者死亡[1]，是引起細(xì)菌性食物中毒主要的病原菌之一。

紅嘴鷗(Larusridibundus)是鸻形目(Charadriiformes)鷗科(Laridae)鷗屬的一種呈世界性分布的鳥類；主要繁殖于亞歐大陸，越冬于北非、西歐海岸、印度、菲律賓和日本等地；在國內(nèi)廣泛分布，主要以魚、蝦、水生昆蟲和甲殼類等為食[2]。昆明市因其得天獨(dú)厚的自然環(huán)境與氣候條件成為紅嘴鷗的越冬地，1985年紅嘴鷗首次進(jìn)入昆明城區(qū)，政府部門倡導(dǎo)及社會(huì)各界積極行動(dòng)和廣泛參與，為紅嘴鷗保護(hù)工作做出了許多努力[3]，1985—2018年昆明越冬紅嘴鷗的種群數(shù)量呈跳躍性增加趨勢[4]，紅嘴鷗成為昆明一張靚麗的名片。

有流行病學(xué)和細(xì)菌學(xué)證據(jù)表明，帶菌野鳥不僅會(huì)對水資源環(huán)境造成影響，還有可能將細(xì)菌傳播給人類或家畜[5-7]。野生禽類可通過糞—口途徑、污染的水在野生禽類之間或野生禽類與人及畜禽之間傳播。人們在觀鷗、賞鷗和喂鷗過程中會(huì)與大量紅嘴鷗接觸，紅嘴鷗穿梭于人群間，與人存在相互傳播疾病的潛在危險(xiǎn)[8]。本研究對紅嘴鷗分離得到的1株沙門氏菌的血清型、耐藥性、毒力特征及致病性進(jìn)行分析，以期為野生鳥類沙門氏菌流行病學(xué)及防控措施提供數(shù)據(jù)支持，具有重要的公共衛(wèi)生意義。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2019年11月，昆明市林業(yè)和草原局組織昆明鳥類協(xié)會(huì)和云南農(nóng)業(yè)大學(xué)等單位對100只紅嘴鷗進(jìn)行環(huán)志并體檢[9]，從昆明滇池隨機(jī)采集越冬紅嘴鷗泄殖腔棉拭子，存于含培養(yǎng)基的滅菌離心管內(nèi)，無污染保存送至實(shí)驗(yàn)室。

1.2 細(xì)菌分離鑒定

1.2.1 純化及形態(tài)學(xué)鑒定

將采集的泄殖腔棉拭子經(jīng)SC增菌培養(yǎng)后接種于SS瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取可疑菌落純化，37 ℃震蕩培養(yǎng)過夜，革蘭氏染色鏡檢。

1.2.2 生化及血清型鑒定

將純化培養(yǎng)的細(xì)菌菌液稀釋后取5 μL接種于葡萄糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、棉子糖和賴氨酸脫羧酶生化反應(yīng)管中，37 ℃培養(yǎng)，同時(shí)進(jìn)行MR試驗(yàn)、靛基質(zhì)試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)和硫化氫(H2S)試驗(yàn)，24 h后觀察結(jié)果。

按照說明書采用玻片凝集法確定沙門氏菌的抗原式和血清型。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定

參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細(xì)菌總DNA，并以此為模板，使用細(xì)菌16S rRNA通用引物(F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴(kuò)增16S rRNA基因片段；PCR反應(yīng)體系25.0 μL，其中Taq酶12.5 μL，模板1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；4 ℃保存。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)膠回收試劑盒說明書回收目的條帶，產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序結(jié)果經(jīng)Lasergene SeqMan拼接整理，在NCBI通過BLAST比對分析，運(yùn)用Mega X構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.4 多位點(diǎn)序列分型(MLST)

參考MLST分型網(wǎng)站(http：//enterobase.warwick. ac.uk)管家基因序列合成引物，擴(kuò)增分離菌株的aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA和thrA7個(gè)管家基因，經(jīng)電泳檢測后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序結(jié)果用Lasergen MegAlign軟件編輯整理，使其符合MLST分型網(wǎng)站上傳要求，查詢管家基因的等位基因譜號(hào)及ST型。

1.3 細(xì)菌耐藥性分析

1.3.1 藥敏試驗(yàn)

依據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標(biāo)準(zhǔn)，采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法(K-B法)，以大腸桿菌ATCC25922為質(zhì)控菌株，對分離菌株進(jìn)行β-內(nèi)酰胺類(阿莫西林、氨芐西林、頭孢噻肟)、氨基糖苷類(阿米卡星、慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素)、磺胺類(復(fù)方新諾明、磺胺異惡唑)、氟喹諾酮類(環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星)和四環(huán)素類(四環(huán)素、多西環(huán)素)5大類14種抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)。

1.3.2 耐藥基因檢測

以細(xì)菌總DNA為模板，參考文獻(xiàn)[10-13]合成引物，根據(jù)藥敏結(jié)果擴(kuò)增β-內(nèi)酰胺類(blaTEM、blaPSEI、blaSHV)、氨基糖苷類(aadA2、aadB)、四環(huán)素類(tetA、tetB)、磺胺類(sul2、sul3、dfrA1)和喹諾酮類(gyrA、gyrB、parC、psrE)的耐藥基因(表1)。PCR反應(yīng)體系25.0 μL，其中Taq酶12.5 μL，ddH2O 10.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板1.0 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，退火溫度45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min；4 ℃保存。

表1 沙門菌耐藥基因引物序列

1.4 毒力基因PCR檢測

參考相關(guān)文獻(xiàn)[14]及根據(jù)GenBank收錄的毒力基因序列設(shè)計(jì)合成13對毒力基因引物(表2)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系25.0 μL：Taq酶12.5 μL，ddH2O 10.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板1.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火溫度30 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸1 min；4 ℃保存。

表2 沙門菌毒力基因引物序列

1.5 生長曲線測定及小鼠致病性試驗(yàn)

參考謝小偉等[15]的方法測定細(xì)菌生長曲線。將小鼠隨機(jī)分為5個(gè)劑量組(5×104、5×105、5×106、5×107、5×108cfu/mL)和1個(gè)對照組，每組5只，采用腹腔注射接種小鼠，對照組注射等量培養(yǎng)基。攻毒后記錄小鼠的外觀、精神變化和死亡情況，及時(shí)剖檢死亡小鼠，觀察內(nèi)部病變，取病變組織進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，制作病理切片。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離鑒定

2.1.1 純化形態(tài)學(xué)鑒定

在SS瓊脂培養(yǎng)基上有呈圓形、微凸、邊緣整齊、菌落中心為黑色的小菌落(圖1A)。分離后革蘭氏染色，均為陰性、短小的桿菌(圖1B)。

圖1 分離菌的菌落形態(tài)和革蘭氏染色結(jié)果

2.1.2 細(xì)菌生化和血清型鑒定

分離菌株對葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇、MR試驗(yàn)、H2S、棉子糖和賴氨酸脫羧酶均為陽性，其他均為陰性(表3)。

表3 分離菌株生化鑒定

血清型鑒定結(jié)果顯示，分離菌株屬于B群的鼠傷寒沙門氏菌(SalmonellaTyphimurium)，其抗原式為：O抗原1，4，[5]，12；H抗原i，1，2。

2.1.3 細(xì)菌分子生物學(xué)鑒定

16S rRNA測序目的基因片段大小與理論值一致，將獲得的16S rRNA基因序列與GenBank中登錄細(xì)菌的16S rRNA進(jìn)行比對，表明該分離菌的16S rRNA基因序列與已發(fā)表的沙門氏菌的16S rRNA基因同源性較高，構(gòu)建的進(jìn)化樹(圖2)顯示分離菌株與鼠傷寒沙門氏菌在同一分支，且與鏡檢、生化和血清型試驗(yàn)鑒定結(jié)果相符，證明該菌為鼠傷寒沙門氏菌，并將該分離菌株命名為KMWBSS-01。

圖2 分離菌株16S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.1.4 細(xì)菌MLST分型

沙門氏菌的7個(gè)管家基因都能擴(kuò)增到相應(yīng)的目的片段。測序結(jié)果經(jīng)編輯整理上傳網(wǎng)站后得到aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA和thrA等位基因譜號(hào)分別為10、7、12、9、5、9和2，表明該紅嘴鷗源沙門氏菌分離菌株為ST19型。

2.2 細(xì)菌耐藥性

2.2.1 藥敏試驗(yàn)

采用15種臨床常用的抗生素檢測分離菌株的藥物敏感性，并檢測了14種耐藥基因，藥敏試驗(yàn)結(jié)果(表4)表明，該菌株主要對阿莫西林、環(huán)丙沙星、四環(huán)素和多西環(huán)素耐藥，對氨芐西林、頭孢噻肟、阿米卡星、慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、復(fù)方新諾明和磺胺異惡唑敏感。

表4 紅嘴鷗源沙門氏菌分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 耐藥基因

由圖3可見，從紅嘴鷗源沙門氏菌分離菌株中檢出2類藥5種耐藥基因，分別是四環(huán)素類耐藥基因tetB和喹諾酮類耐藥基因gyrA、gyrB、parC、psrE。

圖3 紅嘴鷗源沙門氏菌分離菌株耐藥基因的PCR結(jié)果

2.3 細(xì)菌毒力特征及致病性

2.3.1 細(xì)菌毒力基因PCR檢測結(jié)果

細(xì)菌毒力基因檢測結(jié)果表明13種細(xì)菌毒力基因均被檢測到，條帶大小均符合理論值(圖4)。

圖4 紅嘴鷗源沙門氏菌分離菌株毒力基因的PCR結(jié)果

2.3.2 細(xì)菌生長曲線

在不同培養(yǎng)時(shí)間分別測定分離株混懸液OD600，根據(jù)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)所測得的菌液OD600制作出分離株的生長曲線(圖5)。生長曲線結(jié)果顯示，分離株接種后3～8 h進(jìn)入對數(shù)增長期，10 h后進(jìn)入生長平緩期。

圖5 紅嘴鷗源沙門氏菌分離菌株生長曲線

2.3.3 小鼠的致病性試驗(yàn)及病理切片觀察

接種后各濃度攻毒小鼠出現(xiàn)不同程度的被毛凌亂、精神萎靡、扎堆抱團(tuán)和身體震顫情況，注射不同濃度菌液的小鼠死亡情況見表5。及時(shí)解剖死亡小鼠，見肝臟腫大、肺部局部充血、腸壁變薄。取發(fā)病小鼠肺臟及肝臟進(jìn)行病理切片，觀察發(fā)現(xiàn)，多處肺泡腔中度出血(圖6A)；肺泡壁輕微增厚，伴較多的炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁毛細(xì)血管和血管充血(圖6B)；肝臟匯管區(qū)周圍可見較多肝細(xì)胞脂肪變性(圖6C)，胞質(zhì)中含有微小的脂肪空泡；局部膽管增生，伴炎性細(xì)胞灶性浸潤(圖6C)；肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死(圖6D)，胞核固縮、碎裂、消失，局部大的匯管區(qū)周圍可見較多的炎性細(xì)胞浸潤(圖6D)。

表5 不同濃度分離菌株對小鼠的致死情況

圖6 小鼠感染分離菌株后組織器官病理變化(20×)

3 討論

近年來，來昆明越冬的紅嘴鷗數(shù)量急劇攀升，人與紅嘴鷗的接觸也更頻繁，不得不思考其可能存在的問題。有研究表明，已經(jīng)從活的或死亡的野生鳥類中分離出沙門氏菌[5]，人或家畜禽通過與鳥糞接觸而直接感染沙門氏菌，通過食用被污染的食物和動(dòng)物制品而間接感染沙門氏菌[16-17]。一旦人們接觸到帶菌的紅嘴鷗，病原菌將在人際間傳播，對人或畜禽的健康及公共衛(wèi)生安全都會(huì)產(chǎn)生威脅。目前已有許多研究加強(qiáng)了對野生鳥類攜帶病原菌的深入了解，對人類健康、公共衛(wèi)生安全及動(dòng)物疫病防控和保護(hù)有重要的意義。

本研究共檢測出5種耐藥基因，其中四環(huán)素類耐藥基因1種(tetB)，喹諾酮類耐藥基因4種(gyrA、gyrB、parC、psrE)。細(xì)菌的耐藥性大多由于獲得耐藥基因，攜帶耐藥基因的質(zhì)粒通過結(jié)合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式傳播[25]。四環(huán)素類耐藥基因tetB主要參與形成Tet蛋白，使四環(huán)素類藥物和Mg2+形成復(fù)合物使其泵出細(xì)胞外致使藥物失去作用；而喹諾酮類藥物的耐藥性機(jī)制與其藥物的主動(dòng)外排、產(chǎn)生抗生素水解酶、生物被膜形成、gyrA和parC基因變異及外膜孔蛋白缺失等多種機(jī)制有關(guān)[26-27]。本研究檢測到相關(guān)耐藥基因，并在紅嘴鷗源沙門氏菌耐藥分子水平上進(jìn)行探討，表明其存在一定耐藥基因轉(zhuǎn)移傳播的風(fēng)險(xiǎn)。

沙門氏菌的致病性是由所攜帶的大量毒力因子相互作用所致，與其毒力相關(guān)的基因在沙門氏菌中普遍存在。本研究對13個(gè)與沙門氏菌致病性相關(guān)的基因進(jìn)行檢測，并在此分離株中均檢測到。SPI是位于染色體上負(fù)責(zé)編碼毒力基因簇的染色體片段[28]；mogA位于SPI-1中參與入侵宿主細(xì)胞、誘導(dǎo)吞噬細(xì)胞凋亡和引起宿主反應(yīng)等[29]；sseL為SPI-2操縱子之一，與沙門氏菌在宿主吞噬細(xì)胞內(nèi)的生存和擴(kuò)散相關(guān)，并使沙門氏菌逃避巨噬細(xì)胞的殺傷；mgtC為SPI-3操縱子，參與介導(dǎo)沙門氏菌在巨噬細(xì)胞及低Mg2+環(huán)境中存活[30]；bcfA在SPI-4中編碼和介導(dǎo)毒性分泌的Ⅰ型分泌系統(tǒng)，參與沙門氏菌對巨噬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的適應(yīng)[31-32]；araB與sopB位于SPI-5，編碼與炎癥反應(yīng)和腸黏膜分泌液體的有關(guān)蛋白[33]；沙門氏菌毒力質(zhì)粒spv與細(xì)菌毒力相關(guān)表型密切相關(guān)，它與菌體定居腸道、侵入上皮組織及刺激腸液外滲等過程相關(guān)，在沙門氏菌全身性感染宿主階段發(fā)揮重要作用[34]；stn腸毒素基因參與菌體在腸腔的黏附、侵入和腸毒素的產(chǎn)生[35]；fimA編碼的蛋白質(zhì)是構(gòu)成菌毛的主體部分[36]；orgA在宿主識(shí)別和入侵中發(fā)揮作用[33]；spaN和sipB具有殺死巨噬細(xì)胞的作用[37]。且其中有某些基因還有水平轉(zhuǎn)移的可能性，使其致病性增強(qiáng)。沙門氏菌血清型不同，毒力情況也相差甚大，試驗(yàn)通過人工腹腔注射感染小鼠，表明該菌具有一定的毒力和致病力，可引起實(shí)驗(yàn)鼠致病乃至死亡。

沙門氏菌是重要的人畜共患病病原菌，流行病學(xué)特征非常復(fù)雜，血清型、耐藥性和毒力特征及地域和宿主均存在差異性。紅嘴鷗在遷徙過程中停留休整，一旦攜帶此種病原菌，將會(huì)在其經(jīng)過的地方造成廣泛性傳播。本研究通過細(xì)菌分離鑒定、耐藥性分析等，對紅嘴鷗源沙門氏菌的耐藥、毒力特征及致病性進(jìn)行研究分析，有助于在分子水平探索其特點(diǎn)，為野生動(dòng)物疫病監(jiān)測防控提供理論依據(jù)，為昆明地區(qū)沙門氏菌的預(yù)警提供一定的數(shù)據(jù)支持。