哈爾濱圈養(yǎng)東北虎FHV-1的巢式PCR檢測(cè)及gD基因序列分析

石龍艷 黃舒萍 郭 琳 李 祥 王 賢 陸雨欣 蘇雨晴 徐海濤 周曉禹* 李大鵬 宮 明 王亞君*

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040；2.黑龍江東北虎林園，哈爾濱，150028)

貓皰疹病毒Ⅰ型(Feline herpesvirus type 1，F(xiàn)HV-1)是皰疹病毒科(Herpesviridae)、α皰疹病毒亞科(Alphaherpesvirinae)、水痘病毒屬(Varicellovirus)的成員，是導(dǎo)致貓傳染性鼻氣管炎的病原體[1-2]。FHV-1在世界范圍內(nèi)廣泛流行，自然情況可感染獅、虎和豹等多種貓科(Felidae)動(dòng)物[3-5]。在家貓中發(fā)病率可達(dá)100%，幼貓病死率可達(dá)50%，患病后可能會(huì)終生攜帶并排毒，常發(fā)生反復(fù)感染，既可通過直接或間接接觸水平傳播，又可通過胎盤垂直傳播[2，6]?；疾』⒌呐R床癥狀主要包括結(jié)膜炎、眼鼻出現(xiàn)漿液性分泌物和打噴嚏等一系列上呼吸道癥狀，如未及時(shí)采取正確的治療措施可導(dǎo)致死亡[7-9]。臨床上，貓科動(dòng)物傳染性鼻氣管炎與貓泛白細(xì)胞減少癥、貓支原體和貓杯狀病毒感染等傳染性疾病癥狀有相同之處，較難區(qū)分，需要通過分子生物學(xué)手段獲得確切的診斷。由于免疫后出現(xiàn)再感染現(xiàn)象，臨床上用檢測(cè)病毒抗體作為診斷依據(jù)比較困難，核酸檢測(cè)是最準(zhǔn)確、靈敏、快速和高效的方法。目前，關(guān)于虎傳染性鼻氣管炎PCR檢測(cè)已有報(bào)道[7-8，10]。本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)，利用巢式PCR對(duì)黑龍江東北虎林園圈養(yǎng)東北虎(Pantheratigrisaltaica)進(jìn)行FHV-1檢測(cè)，研究結(jié)果便于進(jìn)一步了解圈養(yǎng)東北虎中FHV-1的感染情況，提高圈養(yǎng)貓科動(dòng)物的管理水平。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

50份(只)東北虎全血樣本均來自黑龍江東北虎林園，2019年1月—2021年3月由專業(yè)獸醫(yī)采集。所有東北虎在采血前都禁食1 d，用含有10 mg/kg氯胺酮飛鏢麻醉(中國江蘇中牧倍康制藥)，每只虎前肢靜脈采集2 mL血液置于含有適量抗凝劑的采集管內(nèi)，所有樣品儲(chǔ)存于-80 ℃。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取

按照Baypure通用型磁珠法病毒DNA/RNA快速提取試劑盒的說明書從全血中提取病毒核酸，并置于-80 ℃儲(chǔ)存。

1.2.2 樣本檢測(cè)

首先使用以FHV-1的部分糖蛋白D基因(glycoprotein D，gD)為目標(biāo)片段(283 bp)的巢式PCR方法[10]對(duì)50份樣本進(jìn)行逐一篩查，從陽性樣本中隨機(jī)選取2株進(jìn)行普通PCR，以擴(kuò)增完整的gD基因片段(1 125 bp)[11]。電泳鑒定后，將普通PCR樣本送至吉林庫美生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。引物序列及反應(yīng)條件見表1。PCR擴(kuò)增總體系25.0 μL，其中PCR Mix 12.5 μL、上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL、模板1.0 μL、ddH2O 9.5 μL。

表1 引物序列信息

1.2.3 序列比對(duì)和數(shù)據(jù)分析

將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫收錄的參考毒株進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，然后運(yùn)用MegAlign進(jìn)行核苷酸同源性比對(duì)。采用R 4.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR鑒定結(jié)果

電泳結(jié)果顯示，50份樣本中有10份樣本擴(kuò)增到約283 bp的陽性目的條帶，陽性率為20%(表2)。部分PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

表2 圈養(yǎng)東北虎樣本信息及FHV-1陽性率

圖1 圈養(yǎng)東北虎FHV-1巢式PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 同源性比較與系統(tǒng)進(jìn)化分析

由于gD基因高度保守，巢式PCR所獲得的10份陽性樣本的283 bp片段同源性為98.9%～100.0%(圖2)。隨機(jī)選取其中2株陽性樣本(H-16-1811、H-07-779)進(jìn)行g(shù)D基因全序列擴(kuò)增，對(duì)獲取的1 125 bp序列進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果表明，2株陽性樣本(GenBank登錄號(hào)為ON211933和ON211934)的毒株序列與貓皰疹病毒Ⅰ型核苷酸同源性為99.2%～99.6%，與海豹鼻氣管炎病毒(Phocid alphaherpesvirus)毒株核苷酸同源性僅為64.7%(圖3)。從BLAST顯示結(jié)果中選取3株FHV-1參考株(MH070348.1/Cat、OL410290.1/Cheetah和KJ466150.1/Tiger)進(jìn)行核苷酸位點(diǎn)突變分析(表3)，發(fā)現(xiàn)獲取的毒株序列與來自貓和獵豹(Acinonyxjubatus)的FHV-1參考株相比，有5個(gè)堿基位點(diǎn)發(fā)生了變異，與來自虎的參考株相比有6個(gè)堿基位點(diǎn)不同。

圖2 10株圈養(yǎng)東北虎FHV-1 gD基因片段核苷酸同源性

圖3 2株FHV-1 gD基因全序列核苷酸同源性差異

表3 陽性樣本與參考株gD基因核苷酸差異

3 討論

近年來，我國對(duì)東北虎的生存和保護(hù)措施逐步完善，然而引發(fā)圈養(yǎng)東北虎發(fā)病甚至死亡的病毒性傳染病越來越多[12]。本研究應(yīng)用巢式PCR對(duì)50份東北虎血樣進(jìn)行FHV-1檢測(cè)，結(jié)果10份樣本呈FHV-1陽性，陽性率為20%。此結(jié)果略高于之前的研究(17%)[13]，但低于尼泊爾自由放養(yǎng)孟加拉虎群(Pantheratigristigris)的血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果(35%)[4]。東北虎的FHV-1陽性率在年齡和性別之間無顯著差異(P>0.05)，這與華南虎(P.t.amoyensis)的研究結(jié)果[9]相同，但FHV-1在貓中主要侵害仔貓[2，6]。gD蛋白是FHV-1已得到鑒定的8種囊膜糖蛋白之一，感染動(dòng)物后，在宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜上復(fù)制，是刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的重要結(jié)構(gòu)蛋白之一，因此也被認(rèn)為是亞單位疫苗的候選蛋白之一[14]。

同源性比對(duì)分析顯示，本研究PCR擴(kuò)增獲得的gD基因1 125 bp與其他家貓和獵豹FHV-1參考株有著很高的同源性(99.2%～99.6%)，與來自虎的FHV-1參考株也有99.47%的高同源性。我國流浪貓數(shù)量龐大，在全國各地的動(dòng)物園中居多。散養(yǎng)的東北虎雖然被鐵絲網(wǎng)圍住，但是由于網(wǎng)眼較大，流浪貓可以自由進(jìn)出?；@工作人員曾在園區(qū)看到過流浪貓，推測(cè)流浪貓與東北虎之間有密切接觸的機(jī)會(huì)。FHV-1主要通過與受感染動(dòng)物的體液(如鼻、眼和口腔分泌物)密切接觸水平傳播[15]，這就不排除FHV-1在流浪貓和東北虎之間存在交互傳染的可能性。

近年研究表明，皰疹病毒的進(jìn)化驅(qū)動(dòng)來自于跨種傳播及隨后與宿主的共同進(jìn)化，F(xiàn)HV-1毒株間也可發(fā)生重組[1，16]。FHV-1gD基因高度保守[11，17]，BLAST結(jié)果顯示，在家貓和獵豹中100%同源，因此，本研究獲取的gD基因序列與其他家貓和獵豹FHV-1參考株有著很高的同源性，但相比FHV-1參考株有5個(gè)堿基發(fā)生了突變，NCBI數(shù)據(jù)庫中來自虎FHV-1的相應(yīng)序列對(duì)比FHV-1參考株有1個(gè)堿基發(fā)生了突變，這表明東北虎群長期的FHV-1感染，在各種因素下可能導(dǎo)致FHV-1發(fā)生了突變，由于缺乏虎源傳染性鼻氣管炎毒株序列信息，目前無法進(jìn)行系統(tǒng)的病毒溯源和遺傳演化分析。

鑒于本研究及以往對(duì)東北虎感染FHV-1的報(bào)道[7，13]，表明圈養(yǎng)東北虎暴露于FHV-1易感環(huán)境中，甚至可能造成病毒的垂直傳播，這對(duì)東北虎的繁育以及保護(hù)帶來了極大威脅。FHV-1在貓中具有較高的流行率[11]，動(dòng)物園是流浪貓的常見地，具備形成FHV-1傳播途徑的條件，圈養(yǎng)東北虎也暴露于傳播鏈的風(fēng)險(xiǎn)之下。筆者認(rèn)為首先要控制園內(nèi)流浪貓的數(shù)量，對(duì)流浪貓定期捕捉、免疫和收容，其次優(yōu)化園內(nèi)的布局，減少流浪貓與圈養(yǎng)東北虎接觸的機(jī)會(huì)。目前沒有針對(duì)該病的有效療法，主要以注射疫苗預(yù)防為主，還沒有專門為東北虎設(shè)計(jì)的傳染性鼻氣管炎疫苗，多為東北虎接種家貓的商品化疫苗。對(duì)貓進(jìn)行的FHV疫苗研究表明，在大多數(shù)情況下，用滅活或改良疫苗獲得的抗體效價(jià)是短暫的[18]，多數(shù)出現(xiàn)免疫后再感染現(xiàn)象，這些疫苗對(duì)東北虎的免疫保護(hù)效果不明顯[19-20]，貓科動(dòng)物傳染性鼻氣管炎的防控仍然是一個(gè)棘手問題。同時(shí)，該病毒感染貓科動(dòng)物后的臨床癥狀與杯狀病毒、細(xì)小病毒和衣原體感染后的癥狀相似，僅憑虎患病后的臨床表現(xiàn)難以做出確切診斷，不乏有虎感染FHV-1后診斷錯(cuò)誤，采取了不當(dāng)?shù)闹委煼绞蕉鴮?dǎo)致死亡的案例[7-8]，故而，研制出適合東北虎傳染性鼻氣管炎快速診斷的試劑盒迫在眉睫。