抑制蠶豆鮮莢腐敗菌的生物保鮮技術(shù)

宋居易，陳 惠，張 欣，劉 暢

(江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇南通 226012)

蠶豆是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)植物，主要以鮮莢形式進(jìn)入市場(chǎng)。蠶豆鮮莢在采摘后，由于受到溫度、自身酶的作用導(dǎo)致品質(zhì)變差的報(bào)道較多，而受到微生物影響的報(bào)道較少。實(shí)際上，蠶豆鮮莢在采摘、加工、貯藏過(guò)程中會(huì)受到多種微生物的侵染，導(dǎo)致褐變、腐爛和變軟等，從而影響其風(fēng)味、色澤、營(yíng)養(yǎng)成分及貨架期。因此，如何高質(zhì)量地延長(zhǎng)其貨架期，對(duì)穩(wěn)定市場(chǎng)、提高行業(yè)從業(yè)者經(jīng)濟(jì)收益進(jìn)而激發(fā)行業(yè)活力具有相當(dāng)大的意義。

蠶豆鮮莢作為一種農(nóng)產(chǎn)品，與人們的生活健康息息相關(guān)。因此，在蠶豆鮮莢生產(chǎn)中，研發(fā)和利用有效的、安全無(wú)毒的、純天然的、對(duì)環(huán)境友好的生物抑菌劑是研究熱點(diǎn)之一。-葡聚糖是一種純天然的抑菌物質(zhì)，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，-葡聚糖涂膜劑可以延長(zhǎng)芒果、番茄等果蔬的貨架期。植物精油是目前較熱點(diǎn)的植物源抑菌劑，相關(guān)研究結(jié)果表明，多種植物精油復(fù)合使用對(duì)黃豆芽中微生物、牛肉腐敗菌等有抑制作用。另外，溶菌酶、茶多酚是已被證明有良好效果的生物抑菌劑。

優(yōu)勢(shì)腐敗菌(specific spoilage organism，SSO)是指在果蔬采摘、加工、貯藏過(guò)程中導(dǎo)致其品質(zhì)變劣、占主導(dǎo)地位的部分微生物品種。通過(guò)抑制腐敗菌來(lái)選擇生物抑菌成分并進(jìn)行復(fù)合保鮮的研究未見(jiàn)報(bào)道。筆者所在課題組已經(jīng)從蠶豆鮮莢中分離出腐敗菌并進(jìn)行了回染試驗(yàn)，得到5種細(xì)菌(編號(hào)為B～B)和2種真菌(F、F)等7種優(yōu)勢(shì)腐敗菌。本研究選擇元麥-葡聚糖與植物精油、溶菌酶、茶多酚等生物抑菌物質(zhì)進(jìn)行處理，通過(guò)研究對(duì)蠶豆鮮莢優(yōu)勢(shì)腐敗菌抑制的效果，確定有效生物抑菌成分，并與植酸、甘油進(jìn)行復(fù)配，最后用響應(yīng)面法優(yōu)化得出高效、低成本、安全的復(fù)合保鮮劑配方，以期為其在蠶豆鮮莢的貯藏保鮮方面的應(yīng)用提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)時(shí)間為2021年4—6月。蠶豆鮮莢取自江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所(地理位置：120°69′E，32°14′N(xiāo))及附近農(nóng)田。元麥-葡聚糖由筆者所在實(shí)驗(yàn)室自制。食品級(jí)大蒜精油、花椒精油、丁香精油、八角精油和生姜精油，均購(gòu)自鄭州雪麥龍食品香料有限公司。食品級(jí)茶多酚，購(gòu)自索來(lái)寶生物科技有限公司。食品級(jí)溶菌酶和植酸，均購(gòu)自浙江一諾生物科技有限公司。甘油，購(gòu)自西隴化工股份有限公司。平板計(jì)數(shù)瓊脂、PDA和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基等生化試劑，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-100CA型低溫生化培養(yǎng)箱，購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C pH計(jì)，購(gòu)自上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SCL-1300型垂直流潔凈工作臺(tái)，購(gòu)自北京賽伯樂(lè)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；LS-30 型立式壓力蒸汽滅菌器，購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 生物抑菌成分的抑菌性檢驗(yàn) 植物精油(大蒜精油、花椒精油、丁香精油、八角精油和生姜精油)用20%乙醇制成5%的母液，用元麥-葡聚糖、溶菌酶和茶多酚制成3%的母液，稀釋成不同濃度后使用。

將蠶豆鮮莢貯藏于點(diǎn)菜柜期間(溫度變化范圍為10～12 ℃)分離得到的7種優(yōu)勢(shì)腐敗菌分別接種于細(xì)菌、真菌分離培養(yǎng)基上，按照Wang等的方法進(jìn)行操作。

1.3.2 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 采用Liu等的方法進(jìn)行操作，測(cè)定不同生物抑菌成分對(duì)蠶豆鮮莢優(yōu)勢(shì)腐敗菌的MIC。

1.3.3 保鮮劑成分用量的篩選 分別設(shè)置丁香精油含量為0.3%、0.5%和0.7%，元麥-葡聚糖的含量為0.5%、1.0%和1.5%，植酸的含量為0.05%、0.10%和0.15%，甘油的含量為1.0%、1.5%和2.0%，以無(wú)菌蒸餾水處理作為對(duì)照組。

1.3.4 復(fù)合保鮮劑濃度的響應(yīng)面優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，按表1進(jìn)行設(shè)計(jì)，以感官評(píng)定作為響應(yīng)值篩選并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平編碼

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)合保鮮劑驗(yàn)證試驗(yàn) 將蠶豆鮮莢分為2組進(jìn)行裝袋：試驗(yàn)組用經(jīng)過(guò)優(yōu)化的生物保鮮劑處理，對(duì)照組不加保鮮劑處理。分別于10 ℃貯藏20 d后，驗(yàn)證生物保鮮劑的保鮮效果。

1.3.6 保鮮指標(biāo)的測(cè)定

1.3.6.1 菌落總數(shù) 測(cè)定方法具體參照GB 4789.2—2016《食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》。

1.3.6.2 感官評(píng)價(jià) 感官評(píng)定團(tuán)由6名有感官評(píng)定經(jīng)驗(yàn)的人員組成，總分在9分以下表示蠶豆鮮莢已不可食用。蠶豆鮮莢感官評(píng)分的具體指標(biāo)見(jiàn)表2。

表2 蠶豆鮮莢的感官評(píng)定的具體指標(biāo)

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 24.0對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，用Origin 9.1作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物抑菌成分的抑菌效果

由表3可以看出，丁香精油對(duì)除B外的6種腐敗菌均有抑制作用，且抑菌效果均較好，覆蓋范圍最廣；元麥-葡聚糖、茶多酚均對(duì)B、B和B這3種腐敗菌有較好的抑制作用，但元麥-葡聚糖的抑菌效果明顯優(yōu)于茶多酚，且元麥-葡聚糖也可以作為涂膜劑使用。基于抑菌廣譜性、抑菌效果及涂膜功能，本研究選擇丁香精油、元麥-葡聚糖作為生物抑菌成分進(jìn)行下一步研究。

表3 8種生物抑菌劑對(duì)冷藏蠶豆鮮莢腐敗菌的抑菌圈直徑

2.2 生物抑菌成分對(duì)蠶豆鮮莢腐敗菌最小抑菌濃度的影響

各試驗(yàn)組主要通過(guò)牛津杯法研究丁香精油、元麥-葡聚糖對(duì)7種腐敗菌的抑菌作用，得出相對(duì)應(yīng)的MIC(表4)，從而確定單因素試驗(yàn)中各因素的取值范圍。

表4 不同生物抑菌成分下的蠶豆鮮莢腐敗菌MIC

2.3 保鮮劑成分的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 丁香精油用量的篩選 由圖1可知，0.3%丁香精油處理的抑菌能力、感官評(píng)分明顯比0.5%、0.7%丁香精油處理的低，可能是由其濃度低造成的，而0.5%丁香精油處理的感官評(píng)分在貯藏20 d內(nèi)均最高，因此選擇0.4%～0.6%作為丁香精油適宜的保鮮含量范圍。

2.3.2 元麥-葡聚糖用量的篩選 如圖2所示，隨著元麥-葡聚糖濃度的增加，抑菌效果越好，1.5%元麥-葡聚糖處理的感官評(píng)分低于1.0%元麥-葡聚糖處理，這可能是由于高濃度的元麥-葡聚糖較黏稠，不易形成干燥的薄膜，因此選擇0.8%～1.2%作為元麥-葡聚糖的適宜用量范圍。

2.3.3 植酸用量的篩選 如圖3所示，0.05%植酸處理組比其他2個(gè)處理組的感官分值低，其他2組的差異不明顯，而且0.10%植酸處理組的感官分值更高一些。因此選擇0.08%～0.12%作為植酸適宜保鮮用量范圍。

2.3.4 甘油用量的篩選 由圖4可知，對(duì)照組的感觀(guān)評(píng)分值持續(xù)下降，貯藏10 d內(nèi)添加甘油處理后，樣品的感官評(píng)分下降趨勢(shì)較緩慢。但是貯藏20 d后，樣品品質(zhì)都下降，都超過(guò)規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，基本失去食用價(jià)值。在這個(gè)過(guò)程中，1.5%甘油處理組的感官分值更高一些，可能因?yàn)?.0%甘油形成的膜比較薄，抑制呼吸作用、水分損失的能力略差，而2.0%甘油形成的膜略厚，透氣性不好，因此選擇1.2%～1.8%作為甘油的適宜用量范圍。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果 用Design-Expert 10.0對(duì)表5中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到感官評(píng)價(jià)分值對(duì)丁香精油、元麥-葡聚糖、植酸和甘油用量這4個(gè)因素的二元回歸方程模型為=2489+108+072+040+030+049+003-014+009-008+017-132-194-142-120。式中：為感官評(píng)價(jià)分值；為丁香精油用量；為元麥-葡聚糖用量；為植酸用量；為甘油用量。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

如表6所示，該模型達(dá)到極顯著水平(<0.000 1)，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明方程擬合程度較好；方差分析結(jié)果還說(shuō)明，一次項(xiàng)都有顯著或極顯著影響，說(shuō)明丁香精油、元麥-葡聚糖、植酸和甘油用量4個(gè)因素對(duì)蠶豆鮮莢感官評(píng)價(jià)分值有很強(qiáng)的影響，影響感官評(píng)分的各因素排序?yàn)槎∠憔陀昧?元麥-葡聚糖用量>植酸用量>甘油用量；交互項(xiàng)中AB達(dá)到顯著水平(<0.05)。

表6 回歸模型的方差分析結(jié)果

如圖5所示，丁香精油、元麥-葡聚糖的響應(yīng)面圖形的曲線(xiàn)較陡，其等高線(xiàn)為橢圓形，說(shuō)明兩者的交互作用顯著，即同時(shí)使用可以產(chǎn)生協(xié)同作用，從而起到更好的效果。

2.4.2 最優(yōu)條件優(yōu)化 根據(jù)Design-Expert 10.0分析和數(shù)據(jù)優(yōu)化，得到最優(yōu)工藝條件，以質(zhì)量體積比計(jì)：丁香精油用量為0.48%，元麥-葡聚糖用量為0.80%，植酸用量為0.12%，甘油用量為1.20%。通過(guò)3次驗(yàn)證試驗(yàn)，保鮮處理20 d后的感官評(píng)分值達(dá)到23.18分，菌落總數(shù)為4.09 lg CFU/g，接近預(yù)測(cè)值，說(shuō)明利用響應(yīng)面法優(yōu)化配方是可行的。按照最優(yōu)工藝條件進(jìn)行處理的蠶豆鮮莢明顯優(yōu)于同等貯藏條件下未經(jīng)過(guò)保鮮劑處理的，其感官評(píng)分為3.27分，菌落總數(shù)為8.23 lg CFU/g。劉小芳等研究發(fā)現(xiàn)，新鮮凈菜活菌數(shù)應(yīng)低于5 lg CFU/g。由此可見(jiàn)，復(fù)合保鮮劑處理的樣品符合規(guī)定。

3 討論與結(jié)論

筆者在對(duì)元麥-葡聚糖進(jìn)行研究的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，它對(duì)一些致病菌和腐敗菌有一定的抑制作用，經(jīng)初步試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其在蠶豆鮮莢保鮮上也有較好的抑菌效果。元麥-葡聚糖的抑菌譜雖然沒(méi)有丁香精油廣，但是它們可以在抑菌種類(lèi)在上形成互補(bǔ)；其次，它可以在蠶豆鮮莢上形成涂膜，減弱其呼吸作用，延緩后熟，這與閆子?jì)傻鹊难芯拷Y(jié)果相類(lèi)似。加入甘油作為增塑劑，會(huì)與多糖共同作用，提高成膜品質(zhì)，抑制果蔬呼吸和蒸騰作用，從而維持果實(shí)的品質(zhì)。褐變是蠶豆鮮莢在采摘后極易發(fā)生的一種現(xiàn)象，酶促褐變是引發(fā)的主要原因之一。植酸是一種天然物質(zhì)，具有抗氧化性和護(hù)色作用，從而達(dá)到保鮮的目的。

采用響應(yīng)面法建立丁香精油、元麥-葡聚糖、植酸、甘油用量與感官評(píng)分之間的二次多項(xiàng)回歸模型，得到優(yōu)化的蠶豆鮮莢的保鮮劑配方，以質(zhì)量體積比計(jì)：丁香精油用量為0.48%、元麥-葡聚糖用量為0.80%、植酸為0.12%和甘油為1.20%；在此配方下蠶豆鮮莢保鮮20 d后感官評(píng)價(jià)分值為23.18分，表明響應(yīng)面法用于配方優(yōu)化是可靠的。在此條件下，蠶豆鮮莢冷藏20 d期間，最佳配方試驗(yàn)組在菌落總數(shù)、感官評(píng)分上均優(yōu)于對(duì)照，表明丁香精油、元麥-葡聚糖、植酸和甘油保鮮組合可延長(zhǎng)蠶豆鮮莢的貨架期至20 d以上，同時(shí)為蠶豆鮮莢新型生物保鮮劑的研制提供依據(jù)。