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    冷藏蠶豆鮮莢優(yōu)勢腐敗菌的分離與鑒定

    2022-09-01 09:14:52宋居易
    保鮮與加工 2022年8期
    關(guān)鍵詞:鮮莢成團(tuán)蠶豆

    宋居易,張 欣,劉 暢,陳 惠

    (江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,江蘇 南通 226000)

    蠶豆(Vicia fabaL.)系豆科豌豆屬一年生或越年生草本植物,為世界排名第三的食用豆類作物[1]。蠶豆籽粒營養(yǎng)價(jià)值很高[2],江蘇沿江地區(qū)及滬、浙等地是我國鮮食蠶豆的重要產(chǎn)地[3],該地區(qū)有食用鮮蠶豆的消費(fèi)習(xí)俗,且市場需求量較大。然而,蠶豆鮮莢的產(chǎn)業(yè)受許多因素的制約(如上市時(shí)間多集中在5月,氣溫較高,不耐貯藏,貨架期短)而難以進(jìn)一步發(fā)展,故短期內(nèi)極易形成供大于求的局面,從而致使銷售價(jià)格過低[4],農(nóng)民增產(chǎn)不增收。如何延長蠶豆鮮莢貨架期,成為鮮食蠶豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展中需待解決的重要問題。

    優(yōu)勢腐敗菌(Dominant spoilage organism,DSO)是指在果蔬采摘、加工、貯藏過程中使其品質(zhì)劣變起主導(dǎo)作用的微生物[5]。蠶豆鮮莢在收獲后,由于溫度、自身所含酶的作用,以及微生物的快速繁殖、入侵導(dǎo)致腐爛,呼吸和蒸騰作用加劇,并產(chǎn)生纖維化現(xiàn)象,使其食用價(jià)值嚴(yán)重降低。目前,關(guān)于蠶豆鮮莢由于受到貯藏溫度[6-7]和自身所含酶(如多酚氧化酶和過氧化物酶等)[8-11]的作用導(dǎo)致品質(zhì)劣變的研究較多,但是關(guān)于蠶豆鮮莢優(yōu)勢腐敗菌的研究報(bào)道較少。優(yōu)勢腐敗菌與蠶豆鮮莢貨架期有很大相關(guān)性,是其質(zhì)量監(jiān)控的重點(diǎn),因此特定腐敗菌的確定對靶向抑制蠶豆變質(zhì)和延長其貨架期具有較大意義。

    前期試驗(yàn)顯示,10 ℃下對蠶豆鮮莢進(jìn)行貯藏保鮮不僅貯藏品質(zhì)較好,而且成本低。因此,本研究從10 ℃貯藏條件下腐敗的蠶豆鮮莢樣品中分離數(shù)量優(yōu)勢的菌株,通過形態(tài)學(xué)結(jié)合16S rDNA 和內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)測序法進(jìn)行菌種鑒定,并以菌落總數(shù)和蠶豆鮮莢感官評定為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn),研究優(yōu)勢腐敗菌的致腐能力,旨在為蠶豆鮮莢保鮮技術(shù)的開發(fā)利用提供借鑒。

    1 材料與方法

    1.1 材料與設(shè)備

    1.1.1 材料與試劑

    蠶豆鮮莢:由江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。

    牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基,北京索萊寶公司;基因組DNA 提取試劑盒,北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為分析純。

    1.1.2 儀器與設(shè)備

    LS-30 型立式壓力蒸汽滅菌器,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;DNP-9162 型電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司;SCL-1300 型垂直流潔凈工作臺(tái),北京賽伯樂實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;CX41 顯微鏡,日本奧林巴斯公司;GB303 電子天平,梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 蠶豆鮮莢腐敗菌的分離純化

    蠶豆鮮莢經(jīng)低聚乙烯袋包裝后,10 ℃下貯藏直至腐敗,參考潘夢詩等[12]的方法取樣分離菌株,將菌液稀釋到合適的濃度,吸取0.1 mL 涂布于相應(yīng)菌株篩選培養(yǎng)基上,放入恒溫箱中培養(yǎng)。待菌落長成后,挑選多而不同的菌落,劃線獲得純化的單菌落,4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 腐敗菌的鑒定

    采用顯微鏡對篩選的菌株進(jìn)行初步的形態(tài)觀察。采用分子生物學(xué)16S rDNA 和ITS 菌種鑒定的方法,對腐敗菌進(jìn)行鑒定。參照顧春濤等[13]的方法進(jìn)行DNA提取,回收目標(biāo)PCR 產(chǎn)物,測序比對,運(yùn)用Geneious軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    1.2.3 測定項(xiàng)目與方法

    1.2.3.1 腐敗菌致腐能力

    在經(jīng)消毒處理的操作臺(tái)上,將分離純化后的各菌株活化后,分別制成適宜濃度的菌液,把蠶豆鮮莢分別浮于其中接種,初始接種量均為104~105CFU/g,處理后的蠶豆鮮莢于10 ℃條件下保存。以未接種腐敗菌的蠶豆鮮莢為對照,以菌落總數(shù)和蠶豆鮮莢感官評分為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn),研究腐敗菌的致腐能力。

    1.2.3.2 菌落總數(shù)

    參照GB 4789.2—2016[14]中的方法進(jìn)行測定。

    1.2.3.3 感官評定

    由6 名有經(jīng)驗(yàn)的人員組成感官評定小組??偡衷?2 分以下表示蠶豆鮮莢開始腐敗,總分9 分以下表示蠶豆鮮莢不可食用。蠶豆鮮莢感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

    表1 蠶豆鮮莢感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation criteria of fresh pods of broad bean

    1.2.4 數(shù)據(jù)處理

    采用SPSS 24.0 軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,利用Origin 9.1 軟件作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 蠶豆鮮莢貯藏過程中腐敗菌的分離結(jié)果

    由圖1 所示,采用平板劃線法進(jìn)行分離和純化,共分離出5 株細(xì)菌(B1~B5)和2 株真菌(F1~F2)。

    圖1 蠶豆鮮莢10 ℃貯藏條件下的腐敗菌Fig.1 Spoilage microorganism in fresh broad bean pods stored at 10 ℃

    2.2 腐敗菌的鑒定結(jié)果

    腐敗菌的菌落形態(tài)特征如表2 所示。對5 株細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色后,發(fā)現(xiàn)菌株B1、B2、B3、B4為革蘭氏陰性菌,菌株B5為革蘭氏陽性菌(圖2)。

    表2 蠶豆鮮莢腐敗菌的形態(tài)學(xué)特征Table 2 Morphological characteristics of spoilage organism in fresh broad bean pods

    圖2 蠶豆鮮莢5 株細(xì)菌(B1~B5)和2 株真菌(F1~F2)顯微形態(tài)圖Fig.2 Micromorphology diagram of 5 strains(B1~B5)of bacteria and 2 strains(F1~F2)of fungi in fresh broad bean pods

    結(jié)合分子生物學(xué)方法,對目標(biāo)菌進(jìn)行基因組DNA提取、擴(kuò)增,結(jié)果如圖3 所示。5 株細(xì)菌在1500 bp 左右均出現(xiàn)穩(wěn)定、清晰的較強(qiáng)條帶,說明細(xì)菌均被成功擴(kuò)增。真菌F1和F2在250~500 bp 左右出現(xiàn)較強(qiáng)的目標(biāo)條帶,表明其也被成功擴(kuò)增。

    圖3 蠶豆鮮莢腐敗菌的PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoretic diagram of PCR products of spoilage organism in fresh pods of broad bean

    將上述條帶回收后進(jìn)行序列測序,通過GenBank中的BLAST 軟件進(jìn)行比對,獲得與其同源性較高的相似序列,使用Geneious 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。結(jié)果顯示:B1與成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans),B2與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia),B3與韓國假單胞菌(Pseudomonas koreensis),B4與水生拉恩菌(Rahnella aquatilis),B5與高山芽孢桿菌(Bacillus altitudinis),F(xiàn)1與 枝 胞 屬 菌Cladosporium xanthochromaticum,F(xiàn)2與球孢白僵菌(Beauveria bas-siana)的親緣關(guān)系最近,同源性較高。

    圖4 蠶豆鮮莢腐敗菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of spoilage microorganism in fresh broad bean pods

    2.3 優(yōu)勢腐敗菌致腐能力測定結(jié)果

    如圖5A 所示,冷藏蠶豆鮮莢接種優(yōu)勢腐敗菌后,菌落總數(shù)均隨著貯藏時(shí)間的延長呈增加趨勢,對照組增加較為緩慢,貯藏4 d 時(shí),韓國假單胞菌、成團(tuán)泛菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌菌落總數(shù)均已超過蔬菜初期腐敗所規(guī)定的6.0(lg(CFU/g))[15],貯藏至第8 天時(shí),除對照外,其他7 株菌菌落總數(shù)均超過標(biāo)準(zhǔn)[15]。貯藏至第10 天時(shí),菌株B3、B1、B2、B4、B5、F1、F2的菌落總數(shù)分別達(dá)到8.54、8.07、7.74、7.56、7.02、6.88、6.80(lg(CFU/g)),均高于對照組。

    由圖5B 可知,接種7 株菌后的蠶豆鮮莢感官評分均隨貯藏時(shí)間的延長呈下降趨勢,且均低于對照組。貯藏至第6 天時(shí),接種韓國假單胞菌和成團(tuán)泛菌的蠶豆鮮莢感官評分分別為7.27 分和8.91 分,蠶豆鮮莢已不可食用;第8 天時(shí),接種不同菌株的蠶豆鮮莢感官評分分別為:嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌7.01 分,水生拉恩菌7.41 分,高山芽孢桿菌8.71 分,枝孢屬菌8.91分,球孢僵白菌8.99 分,均已不可食用;對照組蠶豆鮮莢貯藏至第10 天時(shí),感官評分為9.87 分,已開始腐敗。結(jié)合圖5A 中的菌落總數(shù)可知,致腐能力較強(qiáng)的腐敗菌為B3、B1、B2和B4,較弱的為B5、F1、F2。

    圖5 不同腐敗菌對蠶豆鮮莢菌落總數(shù)(A)和感官評分(B)的影響Fig.5 Effect of different dominant spoilage organism on total colony count(A)and sensory score(B)of fresh pods of broad bean

    根據(jù)貯藏腐敗時(shí)的菌落數(shù)量優(yōu)勢和致腐能力較強(qiáng)兩方面確定優(yōu)勢腐敗菌的原則[16],最終確定B1菌株(成團(tuán)泛菌)和B3菌株(韓國假單胞菌)為10 ℃貯藏條件下蠶豆鮮莢的優(yōu)勢腐敗菌。

    3 討論與結(jié)論

    本試驗(yàn)分離得到的數(shù)量優(yōu)勢腐敗細(xì)菌主要為Pantoea agglomerans、Pseudomonas koreensis、Stenotrophomonas maltophilia、Rahnella aquatilis和Bacillus altitudinis。腸桿菌科在新鮮農(nóng)產(chǎn)品中含量豐富[17],成團(tuán)泛菌為腸桿科菌中的一員,其為新鮮綠豆芽、菠菜和胡椒微生物群的主要成員[18]。Keshria 等[19]在對綠豆芽腐敗菌的研究中發(fā)現(xiàn),假單胞菌屬、泛菌屬細(xì)菌是其優(yōu)勢腐敗菌。假單胞菌屬是在土壤中發(fā)現(xiàn)的一種高度異質(zhì)性的腐生菌,其包括人類和動(dòng)植物的條件致病菌、有機(jī)物及植被分解者[20-21]。有研究表明[22],假單胞菌屬成員在蘿卜芽、苜蓿、綠豆和西蘭花芽中含量豐富,如熒光假單胞菌和黃綠假單胞菌[23]。嗜麥芽窄食單胞菌、芽孢桿菌屬和拉恩氏菌屬在其他研究中也是優(yōu)勢腐敗菌[24-26]。而在其他一些研究中,腸桿科菌中的歐文氏菌屬是主要的優(yōu)勢腐敗菌[27-29]。本試驗(yàn)分離得到的數(shù)量優(yōu)勢腐敗真菌為Cladosporium xanthochromaticum和Beauveria bassiana。Cladosporium xanthochromaticum在某些食物中也是常見的優(yōu)勢腐敗菌[30]。

    由于在冷藏條件下,細(xì)菌比真菌容易生長,更容易成為優(yōu)勢菌,所以細(xì)菌比真菌更易導(dǎo)致冷藏新鮮蔬菜和瓜果的采后腐敗[30]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,韓國假單胞菌和成團(tuán)泛菌是冷藏蠶豆鮮莢的優(yōu)勢腐敗菌。韓國假單胞菌和成團(tuán)泛菌腐敗能力強(qiáng)可能是因?yàn)橐韵聝蓚€(gè)原因:①它們可以產(chǎn)生過氧化氫酶、氧化酶(大多數(shù))和催化蛋白質(zhì)水解和脂解反應(yīng)的酶,從而導(dǎo)致冷藏新鮮產(chǎn)品的腐敗[31];②它們可以攻破植物防御機(jī)制[32],利用植物營養(yǎng)素,如果膠酶、聚半乳糖醛酸酶(PG)和果膠甲酯酶(PME)等對植物果膠進(jìn)行降解、液化,進(jìn)而導(dǎo)致植物腐爛。植物組織遭到破壞后,導(dǎo)致更多的細(xì)菌和真菌進(jìn)入,從而加快和加重腐敗。

    本研究從在10 ℃條件下放置腐敗的蠶豆鮮莢表面分離得到的數(shù)量優(yōu)勢腐敗菌為Pantoea agglomerans、Stenotrophomonas maltophilia、Pseudomonas koreensis、Rahnella aquatilis、Bacillus altitudinis、Cladosporium xanthochromaticum和Beauveria bassiana。對蠶豆鮮莢的致腐能力大小排序?yàn)镻seudomonas koreensis>Pantoea agglomerans>Stenotrophomonas maltophilia>Rahnella aquatilis>Bacillus altitudinis>Cladosporium xanthochromaticum>Beauveria bassiana。Pseudomonas koreensis和Pantoea agglomerans為10 ℃貯藏條件下蠶豆鮮莢的特定優(yōu)勢腐敗菌。以上結(jié)果可為蠶豆鮮莢生物保鮮技術(shù)的研究提供理論依據(jù)。

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