酸制劑及其衍生物對(duì)育肥豬腸道微生物多樣性的影響研究

李 寧，于海霞，劉仲昊，鄭 梓，閆 峻，王鴻英

（1.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300380；2.天津市農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，天津 300061）

酸制劑已經(jīng)從簡(jiǎn)單的防腐劑逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)轱暳系拇偕L(zhǎng)添加劑和重要的抗生素替代產(chǎn)品。在替代抗生素的大背景下，各種酸在飼料中的應(yīng)用更加凸顯。自2006年歐盟禁止抗生素添加劑以來(lái)，酸制劑便成為豬飼料中常見(jiàn)的抗生素替代物之一，主要應(yīng)用于斷奶仔豬、妊娠和哺乳期母豬，用來(lái)改善生長(zhǎng)性能和飼料報(bào)酬。酸制劑的主要作用方式是通過(guò)調(diào)節(jié)胃腸道微生物，維護(hù)腸道黏膜形態(tài)，提高酶活性和增強(qiáng)動(dòng)物能量代謝來(lái)實(shí)現(xiàn)的。進(jìn)入胃腸道后，酸制劑解離提供質(zhì)子，能夠穩(wěn)定斷奶仔豬胃中的pH值，阻礙胃腸道中病原微生物的定殖生長(zhǎng)，激活胃蛋白酶原，提高仔豬的消化能力；未解離的酸穿過(guò)病原微生物的細(xì)胞膜并作用于膜上的酶和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)功能分子，起到抑菌殺菌的作用；部分酸制劑還能夠作為上皮黏膜細(xì)胞的能量底物參與三羧酸循環(huán)。現(xiàn)有酸制劑主要包括有機(jī)酸、無(wú)機(jī)酸、脂肪酸、酸鹽和復(fù)合酸。常見(jiàn)的酸制劑有甲酸、乳酸、富馬酸、蘋(píng)果酸、α-酮戊二酸、檸檬酸、綠原酸、酒石酸、苯甲酸等。前人研究中多使用單一酸制劑的方式開(kāi)展相關(guān)研究，且在生豬生產(chǎn)應(yīng)用中主要集中在仔豬階段，本研究以多種酸制劑組合的方式，探究不同酸制劑組合對(duì)育肥豬腸道微生物結(jié)構(gòu)的影響，以期為解決育肥豬出欄前減少抗生素使用的同時(shí)保證豬群健康的飼養(yǎng)管理瓶頸問(wèn)題提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 選擇日齡相近、健康狀況良好、體重相近（93.00±2.00 kg）的杜×長(zhǎng)×大三元雜交閹公豬48頭。

1.1.2 酸制劑及其衍生物 短鏈與中鏈復(fù)合酸制劑（甲酸≥23.9%，乳酸≥14.5，檸檬酸≥4.0，月桂酸≥8.6）；酸制劑衍生物（單月桂酸甘油酯≥80%）；短鏈復(fù)合酸制劑（檸檬酸≥10%，富馬酸≥30%，蘋(píng)果酸≥10%）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將48頭育肥豬隨機(jī)分為4組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4頭豬。A組飼喂基礎(chǔ)飼糧（玉米—豆粕型飼糧），B組在A組飼糧中添加1 kg·t短鏈與中鏈復(fù)合酸制劑，C組在A組飼糧中添加1 kg·t酸制劑衍生物，D組在A組飼糧中添加1 kg·t短鏈復(fù)合酸制劑。

基礎(chǔ)飼糧按照NRC（2012）豬營(yíng)養(yǎng)需要中75～100 kg階段豬的營(yíng)養(yǎng)需要配制顆粒飼料，飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)地點(diǎn)為天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院示范創(chuàng)新基地，基地采取嚴(yán)格的生物安全防護(hù)措施，試驗(yàn)豬自由采食、飲水。預(yù)飼期5 d，試驗(yàn)期45 d。

1.4 腸道微生物的測(cè)定及采樣方法

試驗(yàn)第40天，采集育肥豬新鮮糞便，裝入無(wú)菌凍存管，立即投入液氮中，每組采集4個(gè)樣品，樣品采集完畢后送北京百邁客生物科技有限公司使用illumina novaseq 6000進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)整理及分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行ANOVA分析，用Duncan法進(jìn)行多重比較，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 育肥豬糞便微生物測(cè)序有效性結(jié)果分析

稀釋性曲線被用來(lái)判斷樣品測(cè)序量是否足夠反應(yīng)該樣中物種的情況，當(dāng)其在一定范圍內(nèi)曲線趨于平緩，表示樣本測(cè)序量充足，能夠有效反映該樣本的微生物含量，反之則不能。由圖1可知，A、B、C和D組曲線均趨于水平，表明各組的測(cè)序量已經(jīng)充足，能夠代表該樣本進(jìn)行物種豐度多樣性分析。

圖1 稀釋性曲線

2.2 育肥豬糞便微生物分類(lèi)操作單元（OTU）分析

分類(lèi)操作單元（OTU）是將相似度在97.0%以上的序列進(jìn)行聚類(lèi)得到的單元。由圖2可知，與A組相比，B組有1個(gè)特有OTU，C組有1個(gè)特有OTU，D組有1個(gè)特有OTU，4組共有的OTUs為696個(gè)。

圖2 育肥豬糞便微生物OTUs Venn圖

2.3 育肥豬糞便微生物分類(lèi)學(xué)分析

在門(mén)水平上，各組物種所占相對(duì)豐度比例前15如圖3所示，占比超過(guò)20%的物種有擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes），厚壁菌門(mén)（Firmicutes），螺旋體門(mén)（Spirochaetes）；占比超過(guò)0.5%的物種有變形菌門(mén)（Proteobacteria），A、B組的纖維桿菌門(mén)（Fibrobaeteres），Kiritimatiellaeota，A、D組的Tenerieutes；占比超過(guò)0.1%的物種有放線桿菌門(mén)（Actinobactena），Uncultured_bacterium_k_Bacteria，A、B、D組的藍(lán)藻（Cyanobacteria）和B組的髕骨細(xì)菌門(mén)（Patescibacteria），ε-桿菌菌門(mén)（Epsilonbacteraeota）；前15種菌種的其余物種協(xié)生菌門(mén)（Synergistetes），疣狀菌門(mén)（Verrucomicrobia），豆?fàn)钛堪↙entisphaerae）所占相對(duì)比例均小于0.1%。以上15種物種占樣品糞便微生物總數(shù)95%以上。

圖3 育肥豬糞便微生物門(mén)水平種類(lèi)分析

由表2可知，B組的Bacteroidetes顯著高于其他組（P<0.05），D組的Firmicutes顯著高于對(duì)照組，Kiritimatiellaeota顯著低于對(duì)照組，Verrucomicrobia顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。

表2 育肥豬糞便微生物門(mén)水平種類(lèi)分析 %

在屬水平上，各組物種所占相對(duì)豐度比例前15如圖4所示，相對(duì)占比超過(guò)10%的為T(mén)reponema_2；占比超過(guò)5%的為Rikenellaceae_RC9_gut_group、A、B組的uncultured_bacterium_f_Prevotellaceae、B組的uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae；其余Prevote llaceae_NK3B31_group、Ruminococcaceae_UCG-005、uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae、Prevotellac eae_UCG-001、uncultured_bacterium_f_p_2534_18B5_gut_group、Ruminococcaceae_UCG-002、Streptococcus、uncultured_bacterium_f_F-082、Prevot-ellaceae_UCG-003、Lactobacillus、dgA_11_gut_group占比均超過(guò)1%。

圖4 育肥豬糞便微生物屬水平種類(lèi)分析

由表3可知，B組的Treponema_2顯著低于A和C組（P<0.05），B組的uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae、dgA_11_gut_group顯著高于其他組（P<0.05），D組的Ruminococcaceae_UCG-005、Streptococcu顯著高于A、B組（P<0.05），C組的Prevotellaceae_UCG-001顯著高于其他組（P<0.05），C組的uncultured_bacterium_f_p_2534_18B5_gut_group顯著低于其他組（P<0.05），A組 的Lactobacillus顯著低于其他組（P<0.05）。

表3 育肥豬糞便微生物屬水平種類(lèi)分析 %

2.4 育肥豬糞便微生物α多樣性分析

微生物豐度及多樣性常用Alpha多樣性來(lái)表示，Ace、Chao1、Simpson、Shannon是用來(lái)展示多樣性和豐度常用的指標(biāo)。Chao1和Ace指數(shù)能夠反映物種數(shù)量的多少，Simpson和Shannon指數(shù)用于反映物種種類(lèi)的多少。如表4所示，A、B組的Ace、Chao1和Shannon指數(shù)均顯著高于C組和D組（P＜0.05），A組和B組之間、C組和D組之間差異不顯著；B組和D組的Simpson指數(shù)高于A組和C組，但差異不顯著（P＞0.05）。

表4 育肥豬糞便微生物α多樣性分析

2.5 育肥豬糞便微生物β多樣性分析

非加權(quán)組平均法（UPGMA）的結(jié)果樣品聚類(lèi)樹(shù)中各組樣品靠近程度與樣品微生物組成相似度成正比。如圖5所示，在屬水平上，A、B和D組均能夠較好的單獨(dú)聚類(lèi)，表明不同酸制劑及其衍生物影響育肥豬直腸糞便中微生物的組成。

圖5 UPGMA聚類(lèi)分析

非度量多維標(biāo)定法（NMDS）中相同顏色的點(diǎn)代表來(lái)自同組，當(dāng)2個(gè)相同顏色的點(diǎn)距離越近，表明這2個(gè)樣本微生物種類(lèi)越相似。如圖6所示，各試驗(yàn)組腸道微生物群落聚類(lèi)良好，且無(wú)較大交叉，表明A、B、C、D組微生物群落差異較大，表明不同酸制劑對(duì)育肥豬糞便微生物群落結(jié)構(gòu)有一定的影響。

圖6 育肥豬糞便微生物NMDS分析

2.6 育肥豬糞便微生物L(fēng)EfSe分析

LEfSe用來(lái)判定不同組之間差異性顯著的菌群。進(jìn)化分支圖相同顏色表示組間物種無(wú)顯著性差異，不同顏色表示2組之間該點(diǎn)的物種有顯著性差異，原點(diǎn)的大小表示物種豐度。由圖7可知，B組和D組之間部分物種有顯著性差異，B組為:s_uncultured_bacterium_g_dgA_11_gut_group、g_dgA_11_gut_group、f_Rikenellaceae、o_Bacteroidales、s_uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae和g_uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae；D組分別為s_uncultured_bacterium_g_Lactobacillus、g_Lactobacillus、f_Lactobacillaceae、s_uncultured_bacterium_g_Streptococcus、g_Streptococcus、f_Streptococcaceae、o_Lactobacillales。

圖7 LEfSe分析進(jìn)化分支圖

2.7 育肥豬糞便微生物PICRUSt2功能預(yù)測(cè)

如圖8所示，KEGG功能預(yù)測(cè)分析顯示，與A組相比，B組微生物的氟苯甲酸降解（Fluorobenzoae degradation）、硫 酸 代 謝（sulur metabolism）、類(lèi)胡蘿卜素生物合成（carotenoid biosynthesis）、甲苯降解（toluene degradation）、腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma）、光合生物中的碳固定（carbon fixation in photosynthetic organisms）、檸檬烯和蒎烯降解（limonene and pinene degradation）能力顯著升高；C組的金黃色葡萄球菌感染（staphylococcus aureus infection）顯著增加；C組、D組的類(lèi)固醇降解（steroid degradation）、二苯乙烯類(lèi)二芳基庚烷和姜辣素生物合成（stilbenoid diarylheptanoid and gingerol biosynthesis）、初級(jí)膽汁酸生物合成（primary bile acid biosynthesis）能力均顯著下降。

圖8 KEGG組間代謝途徑差異分析

3 結(jié)論與討論

長(zhǎng)期以來(lái)，抗生素被視為致病菌的克星，在養(yǎng)殖行業(yè)被大規(guī)模應(yīng)用。部分抗生素主要是通過(guò)破壞致病菌細(xì)胞完整性，阻斷致病菌繁殖而實(shí)現(xiàn)抗菌的目的。動(dòng)物攝入抗生素后通過(guò)抑制體內(nèi)致病微生物繁殖，調(diào)節(jié)機(jī)體健康，提高生長(zhǎng)性能。

短鏈脂肪酸不能由動(dòng)物自身合成，主要由動(dòng)物攝入的飼料和腸道內(nèi)微生物代謝產(chǎn)生，如腸道中的乙酸，主要是寄生在動(dòng)物腸道中的雙歧桿菌、乳桿菌、普雷沃斯菌的代謝產(chǎn)物，丙酸由擬桿菌屬和厚壁菌屬產(chǎn)生，丁酸由厚壁菌門(mén)產(chǎn)生。有研究表明,丁酸鹽在腸道中能夠?yàn)榧?xì)胞供能，降低壞死性腸炎對(duì)腸道的破壞，保護(hù)腸道結(jié)構(gòu)的完整程度，次功能是丁酸通過(guò)上調(diào)Claudin-3的RNA和蛋白表達(dá)水平維持緊密連接蛋白的濃度，還能夠降低IL-6和NF-κB的表達(dá)，增加緊密連接蛋白Claudin-7的表達(dá)。Xiang等研究發(fā)現(xiàn)，由甲酸（31%）、甲酸銨（23%）、乙酸（8.3%）組成的復(fù)合酸制劑1以及甲酸（13%）、甲酸銨（19%）、乙酸（10%）、丙酸（13%）、山梨酸（0.5%）、乳酸（1%）和檸檬酸（0.5%）復(fù)合酸制劑2均能夠影響仔豬盲腸細(xì)菌Blautia、Bulleidia、Coprococcus、Dorea、Eubacterium、Subdoligranulum和YRC2的豐度。

有機(jī)酸是動(dòng)植物組織的組成成分，飼用有機(jī)酸常見(jiàn)的有富馬酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸等，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，有機(jī)酸發(fā)揮功能主要是通過(guò)增加腸道中H濃度，影響了如大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等有害菌群的寄生環(huán)境，同時(shí)為乳酸桿菌、雙歧桿菌等有益菌群的生存提供有利條件，保證腸道內(nèi)微生物菌群的穩(wěn)態(tài)，防止和降低微生物性腸炎的發(fā)生。Muniyappan等在評(píng)估微囊化有機(jī)酸混合物對(duì)育肥豬糞便微生物的影響中表示，基礎(chǔ)飼糧中添加0.05%和0.1%的有機(jī)酸能夠顯著降低豬糞便中大腸桿菌的數(shù)量。有研究表明，飼糧中添加0.1%，0.2%，0.5%檸檬酸，能夠抑制肉雞十二指腸、盲腸中的大腸桿菌生長(zhǎng),促進(jìn)乳酸桿菌增殖。有研究顯示，斷奶仔豬飼料中單獨(dú)添加1.5%的檸檬酸后，對(duì)仔豬胃、空腸、盲腸以及結(jié)腸末端的厭氧菌、乳酸桿菌、梭狀芽孢桿菌和大腸桿菌的豐度無(wú)顯著影響。Ma等在研究復(fù)合酸制劑（甲酸11%、甲酸銨13%、丙酸10%、乙酸5.1%和檸檬酸3.7%）對(duì)斷奶仔豬腸道健康的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加5 g·kg復(fù)合酸制劑后，仔豬盲腸中乳酸桿菌含量顯著增加，志賀菌的豐度有下降趨勢(shì)。同樣，Wei等在探究苯甲酸中添加酸制劑衍生物（乙酸酯）的研究中發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.5%苯甲酸和0.105%乙酸酯試驗(yàn)豬腸道中的微生物種類(lèi)多樣性高于對(duì)照組，但是多樣性會(huì)在第21天時(shí)消失；在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，飼糧中添加0.5%苯甲酸和0.035%乙酸酯試驗(yàn)豬腸道的微生物多樣性顯著高于其他組。本研究結(jié)果顯示，飼糧中添加1 kg·t短鏈與中鏈復(fù)合脂肪酸后，豬腸道擬桿菌門(mén)顯著高于其他組。添加1 kg·t短鏈復(fù)合酸制劑的豬腸道中厚壁菌門(mén)顯著高于對(duì)照組、疣菌門(mén)顯著低于對(duì)照組。飼糧中添加1 kg·t的短鏈與中鏈復(fù)合脂肪酸能夠提高腸道微生物種類(lèi)和種群數(shù)量，腸道微生物多樣性增加。以上結(jié)果均與本研究中酸制劑能夠改善仔豬腸道微生物豐度和多樣性的結(jié)果相近。

中鏈脂肪酸是一種有效的微生物抑制劑，它能夠較強(qiáng)的抑制多種病原微生物，如革蘭氏菌、包膜病毒、藻類(lèi)、真菌、原生動(dòng)物等。其抗微生物的作用機(jī)制已經(jīng)在多方試驗(yàn)進(jìn)行過(guò)研究，明確其主要機(jī)制是由于中鏈脂肪酸具有兩親性，能夠?qū)е录?xì)胞膜失去穩(wěn)態(tài)，影響包膜孔隙形成的一系列生化反應(yīng)。中鏈脂肪酸通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)電子載體或者破壞膜完整性，破壞了電子傳遞的過(guò)程，并能夠使膜電位失衡進(jìn)而干擾氧化磷酸化。此外，有研究稱，脂肪酸還能夠抑制葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，該酶是膜攝取養(yǎng)分的關(guān)鍵活性酶。有調(diào)查研究表明，癸酸（C10）和月桂酸（C12）是脂肪酸中表現(xiàn)效果最好的脂肪酸，而其單甘油酯通常能夠增加脂肪酸的活性，它們能夠在膠束狀態(tài)下破壞細(xì)胞膜的磷脂層。但是，不同的中鏈脂肪酸往往對(duì)不同的微生物起到抑制作用，如單月桂酸甘油酯、月桂酸（C12）以及辛酸（C8）和癸酸（C10）的混合物能夠?qū)χT如大腸桿菌、豬鏈球菌、浦那沙門(mén)氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌等致病微生物表現(xiàn)出強(qiáng)大的抑制效果。同樣，有研究顯示，月桂酸單甘油酯對(duì)炭疽芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌具有殺滅效果，還能夠抑制污染豬場(chǎng)飼料源頭的重要致病菌（李斯特菌）的增殖。有研究表明，飼料中添加脂肪酸后，脂肪酸通過(guò)影響腸道微生物的α多樣性和β多樣性，從而維持腸道穩(wěn)態(tài)或提高腸道健康狀況。Devkota等[研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加飽和脂肪酸（如辛酸、癸酸和月桂酸等），可影響亞硫酸鹽還原性致病菌（沃氏嗜膽菌）的繁殖。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加短鏈與中鏈復(fù)合酸制劑后，Treponema_2顯著降低，uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae、dgA_11_gut_group顯著增加，結(jié)果與前人研究相近。

育肥豬飼糧中添加酸制劑后，改善了育肥豬微生物群落結(jié)構(gòu)，腸道中有益菌的相對(duì)豐度提高，有害菌的相對(duì)豐度降低，同時(shí)促進(jìn)了腸道微生物的代謝功能。