卡瑞利珠單抗聯(lián)合化療方案對中晚期食管癌患者血清miR-21、可溶性E-鈣黏蛋白表達(dá)的影響

胡加海，薛松，陳荃

食管癌早期發(fā)病隱匿，無典型癥狀［1-2］。當(dāng)患者因不適就醫(yī)時，多已處于中晚期，失去了手術(shù)治療的最佳時機(jī)［3-4］。針對中晚期食管癌，臨床治療多采用化療方案，但單純化療不良反應(yīng)較多，治療效果及患者預(yù)后較差［5-6］。免疫治療是臨床惡性腫瘤治療的主要有效手段之一。研究顯示，免疫治療與化療聯(lián)合治療方案有助于延長患者生存期［7］。卡瑞利珠單抗是一種人源化抗程序性死亡受體1（PD-1）抗體，其通過與PD-1 的靶向結(jié)合，解除機(jī)體免疫抑制作用，從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)［8-9］。目前，從分子水平研究抗腫瘤藥物的機(jī)制已成為熱點。miR-21 可通過PTEN/PI3K/AKT信號通路參與腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移過程［10］?？扇苄訣-鈣黏蛋白（sE-Cad）是調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長的重要蛋白［11］。目前已有利用卡瑞利珠單抗聯(lián)合化療方案治療食管癌的報道［12］，但從分子水平研究聯(lián)合治療方案對中晚期食管癌治療效果的研究較少。本研究主要分析卡瑞利珠單抗聯(lián)合化療方案對中晚期食管癌患者血清miR-21、sE-Cad表達(dá)的影響，旨在明確免疫治療聯(lián)合化療對中晚期食管癌的近期療效及安全性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 回顧性選取2019 年6 月—2021 年6 月于安徽醫(yī)科大學(xué)附屬滁州醫(yī)院（滁州市第一人民醫(yī)院）就診且均經(jīng)病理檢查確診為鱗癌的中晚期食管癌患者110例。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18歲；首次接受治療，體能狀態(tài)（performance status，PS）評分0～1 分，預(yù)計生存時間≥6 個月；無化療禁忌證；可測量病灶數(shù)量≥1個。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、感染性疾病及血液系統(tǒng)疾?。挥芯耦惣膊?；存在重要臟器功能障礙。依據(jù)治療方案的不同分為聯(lián)合組（紫杉醇+順鉑化療方案聯(lián)合卡瑞利珠單抗治療，57例）和化療組（紫杉醇+順鉑化療方案治療，53 例），2 組患者的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、基礎(chǔ)疾病、吸煙史（患者自本次入院治療前10年內(nèi)有規(guī)律吸煙，且吸煙數(shù)量累計≥100支）、食管癌家族史構(gòu)成差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），有可比性，見表1。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 治療方案 化療組患者接受紫杉醇+順鉑化療方案治療。具體用法：第1天靜脈滴注白蛋白結(jié)合型紫杉醇（國藥準(zhǔn)字：H20183378，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；260 mg/m2，滴注時間為30 min）+順鉑（諾欣，國藥準(zhǔn)字：H20040813，江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司；30 mg/m2，滴注時間為60 min以上并適當(dāng)水化利尿），第2、3天靜脈滴注順鉑（30 mg/m2，滴注時間為60 min以上并適當(dāng)水化利尿），21 d為1個周期，連續(xù)治療4～6個周期。聯(lián)合組患者在化療的基礎(chǔ)上，同時給予卡瑞利珠單抗（艾瑞卡，國藥準(zhǔn)字：S20190027，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）靜脈滴注治療（200 mg/次，1 次/2 周），連續(xù)治療4～6 個周期。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 總體療效 參考《實體腫瘤的療效評價標(biāo)準(zhǔn)（RECIST）1.1版》［13］對患者的總體療效進(jìn)行評估，分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、疾病穩(wěn)定（SD）、疾病進(jìn)展（PD），計算客觀有效率（ORR）和疾病控制率（DCR），ORR=（CR+PR）/總例數(shù)×100%，DCR=（CR+PR+SD）/總例數(shù)×100%。

1.3.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測血清腫瘤標(biāo)志物、sE-Cad水平 分別于治療前后取患者空腹靜脈血5 mL，3 000 r/min 離心10 min 分離上清液，-80 ℃保存待測。參照ELISA 檢測試劑盒說明書，檢測糖類抗原125（CA125）、癌胚抗原（CEA）、鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)性抗原（SCC）和血清sE-Cad的表達(dá)水平。相關(guān)試劑盒均購自奧地利GMBII公司。

1.3.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）法檢測血清miR-21 水平 取患者血清樣本，應(yīng)用miRNeasy Mini Kit 試劑盒（德國QIAGEN公司）提取血清總RNA，采用紫外分光光度計（DU800型，美國貝克曼庫爾特有限公司）測定RNA濃度及純度，以稀釋RNA 的無酶水為空白對照?？俁NA 經(jīng)凝膠電泳分離、純化，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（德國QIAGEN 公司）將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，獲得cDNA 后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ詂DNA 為模板采用miRcute miRNA 熒光定量檢測試劑盒（天根生化科技有限公司）進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增，總反應(yīng)體系20 μL：2×miRcute miRNA Premix 10 μL、10 μmol/L 的上下游引物各0.4 μL、2 μL miRNA 第1 鏈cDNA、1.6 μL ROX 參比染料（×50）、5.6 μL ddH2O。miR-21引物序列：上 游5′-CCTTCACTTTCAGGGTCGAG-3′，下 游 3′-CAGTTTGGGACCCCTTTACA-5′；內(nèi)參選用β-actin 基因，引物上游5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下 游 3′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-5′。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃15 s，60 ℃1 min，45 個循環(huán)。miR-21 相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計算，每個樣本檢測3次，取平均值為最終結(jié)果。

1.3.4 不良反應(yīng) 記錄2 組患者治療期間的不良反應(yīng)發(fā)生情況，參考《美國國立癌癥研究所通用毒性標(biāo)準(zhǔn)（NCI-CTC）5.0》［14］對不良反應(yīng)進(jìn)行分級。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，2 組間比較行獨立樣本t檢驗，同組治療前后比較行配對t檢驗。計數(shù)資料以例或例（%）表示，組間比較用χ2檢驗；等級資料行秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

Tab.1 Comparison of baseline data between the 2 groups表1 2組患者基線資料比較

2 結(jié)果

2.1 2 組患者一般資料比較 2 組腫瘤TNM 分期、病變部位和腫瘤體積比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

2.2 2 組患者總體療效比較 聯(lián)合組患者的ORR、DCR均高于化療組（P＜0.05），見表3。

2.3 2 組患者治療前后血清腫瘤標(biāo)志物水平比較 治療前，2組血清CA125、CEA、SCC水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；治療后，2 組血清CA125、CEA 和SCC 水平較治療前均下降，且聯(lián)合組的血清CA125、CEA 和SCC 水平低于化療組（P＜0.01），見表4。

2.4 2組患者治療前后血清miR-21、sE-Cad水平比較 治療前，2 組患者血清miR-21、sE-Cad 水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；治療后，2 組血清miR-21、sE-Cad 水平較治療前均下降，且聯(lián)合組的血清miR-21、sE-Cad水平低于化療組（P＜0.05），見表5。2.5 2組患者治療期間不良反應(yīng)發(fā)生情況比較 治療期間2 組患者均出現(xiàn)白細(xì)胞減少、中性粒細(xì)胞減少、血小板減少、肝功能受損、疲勞、胃腸道反應(yīng)和肌肉關(guān)節(jié)痛等不良反應(yīng)，聯(lián)合組的反應(yīng)性毛細(xì)血管增生癥發(fā)生率高于化療組（P＜0.01），但主要為Ⅰ～Ⅱ級，所有不良反應(yīng)經(jīng)減少藥物劑量、對癥支持治療后均得到控制，見表6。

3 討論

食管癌一直是威脅我國居民健康的主要惡性腫瘤之一，患者5年生存率不到10%，中位生存期僅為7～12個月［15］。對于早期食管癌，臨床可通過手術(shù)切除、內(nèi)鏡治療等方式取得良好療效，但中晚期食管癌患者多已失去最佳手術(shù)時機(jī)，且單純化療的總體獲益率及生存率較低，臨床更推薦聯(lián)合化療方案?？ㄈ鹄閱慰故且环N人源化免疫球蛋白G4 型單克隆抗體，其作為新興的免疫治療方案，可阻斷PD-1 信號通路，改善腫瘤免疫微環(huán)境，通過增強(qiáng)內(nèi)源性抗腫瘤免疫效應(yīng)而發(fā)揮作用。已有研究表明，食管動脈化療栓塞聯(lián)合卡瑞利珠單抗治療中晚期食管癌短期療效明確［16］，但對于無法接受食管動脈化療栓塞或不能耐受放化療的患者，卡瑞利珠單抗聯(lián)合化療方案是否能使患者進(jìn)一步獲益尚無定論。

Tab.2 Comparison of general data between the 2 groups表2 2組患者一般資料比較 ［例（%）］

Tab.3 Comparison of overall curative effect between the 2 groups表3 2組患者總體療效比較 ［例（%）］

Tab.4 Comparison of serum tumor marker levels before and after treatment between the 2 groups表4 2組患者治療前后血清腫瘤標(biāo)志物水平比較 （±s）

Tab.4 Comparison of serum tumor marker levels before and after treatment between the 2 groups表4 2組患者治療前后血清腫瘤標(biāo)志物水平比較 （±s）

＊＊P＜0.01。

Tab.5 Comparison of serum miR-21 and sE-Cad levels before and after treatment between the 2 groups表5 2組患者治療前后血清miR-21、sE-Cad水平比較 （±s）

Tab.5 Comparison of serum miR-21 and sE-Cad levels before and after treatment between the 2 groups表5 2組患者治療前后血清miR-21、sE-Cad水平比較 （±s）

＊＊P＜0.01。

Tab.6 Comparison of adverse reactions during treatment between the 2 groups表6 2組患者治療期間不良反應(yīng)發(fā)生情況比較 ［例（%）］

既往研究顯示，卡瑞利珠單抗可靶向結(jié)合B 淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等細(xì)胞表面表達(dá)的PD-1，阻斷其與惡性腫瘤細(xì)胞、腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞等表面表達(dá)的PD-L1 之間的相互作用，在解除T細(xì)胞免疫抑制作用的同時，進(jìn)一步誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞活化，增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)的抗腫瘤能力［17］。此外，應(yīng)用免疫檢查點抑制劑后，腫瘤細(xì)胞受到T細(xì)胞攻擊，對化療藥物的敏感性增強(qiáng)，可與化療發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用，且更加持久有效［18］。藥物動力學(xué)研究還發(fā)現(xiàn)，卡瑞利珠單抗能夠發(fā)揮持久的抗腫瘤效果，在第1 個周期注射給藥后其PD-1 受體平均占有率為81%～88%［19］。盡管免疫治療延長了患者的生存期，但其相關(guān)不良反應(yīng)也會降低患者的生活質(zhì)量。本研究顯示，聯(lián)合組晚期食管癌的ORR、DCR 均高于單純化療組，且治療后聯(lián)合組的血清腫瘤標(biāo)志物水平低于化療組；2組患者均出現(xiàn)一定不良反應(yīng)，聯(lián)合組與卡瑞利珠單抗相關(guān)的毒性反應(yīng)為反應(yīng)性毛細(xì)血管增生癥，發(fā)生率偏高，但主要為Ⅰ～Ⅱ級；2組其他不良反應(yīng)發(fā)生率無明顯差異，提示卡瑞利珠單抗聯(lián)合化療患者總體療效和耐受性良好，不良反應(yīng)可控。一項有關(guān)卡瑞利珠單抗聯(lián)合白蛋白紫杉醇/洛鉑新輔助治療局部晚期食管癌的Ⅱ期臨床觀察研究亦證實，卡瑞利珠單抗聯(lián)合化療方案作為術(shù)前新輔助治療模式可提高患者ORR，緩解主要病理反應(yīng)，且不良反應(yīng)輕微，安全可控［20］。

腫瘤分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，PTEN/PI3K/AKT 信號通路與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，而miR-21 能對該信號通路起重要調(diào)節(jié)作用，影響惡性腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，并參與腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移過程［10］。姚麗華等［21］研究認(rèn)為，miR-21在食管癌患者血清中高表達(dá)，對食管癌的診斷具有一定價值。sECad 是一種細(xì)胞黏附糖蛋白，是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)及調(diào)控組織生長發(fā)育的重要蛋白，其血清水平變化可反映腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力，被認(rèn)為是評估腫瘤患者預(yù)后結(jié)局的重要血清標(biāo)志物［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，治療后聯(lián)合組的血清miR-21、sE-Cad 水平低于化療組，提示卡瑞利珠單抗聯(lián)合化療方案治療可下調(diào)miR-21、sE-Cad在中晚期食管癌患者血清中的表達(dá)。miR-21 可通過激活PTEN/PI3K/AKT 信號通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，并抑制細(xì)胞凋亡，當(dāng)miR-21 在食管癌組織中被上調(diào)時，血清miR-21 水平升高；而腫瘤細(xì)胞間黏附結(jié)構(gòu)的破壞會導(dǎo)致sECad 釋放水平顯著增加，使食管癌患者的血清sECad 水平顯著高于正常人群［22］。另有研究結(jié)果表明，化療藥物的應(yīng)用能抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，使患者血清miR-21、sE-Cad 水平下降，而卡瑞利珠單抗的聯(lián)合應(yīng)用能進(jìn)一步增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的抑制，使miR-21、sE-Cad 表達(dá)下調(diào)［23］。因此，筆者推測下調(diào)miR-21、sE-Cad 表達(dá)可能是卡瑞利珠單抗提高化療臨床療效的重要機(jī)制。

綜上所述，卡瑞利珠單抗聯(lián)合化療方案治療中晚期食管癌近期療效良好，可有效降低腫瘤標(biāo)志物水平，下調(diào)miR-21、sE-Cad在血清中的表達(dá)，且總體耐受性良好，不良反應(yīng)可控。