TNF-α/hs-CRP雙標記時間分辨熒光免疫法用于膿毒癥早期篩查診斷的研究

李云鵬，郝培遠，曹雪明，閆兆月，王恩鋒，黃書滿，代榮欽△

膿毒癥是一種由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，如不及時治療，可致器官衰竭和休克，也是重癥監(jiān)護病房患者（包括嬰幼兒、兒童等）死亡的主要原因之一。膿毒癥早期癥狀不明顯，病情進展較快，病死率可達30%～70%［1］。因此，膿毒癥早期診斷對最佳治療時機的選擇十分重要。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表達與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，是重要的促炎介質(zhì)之一，可誘發(fā)白細胞介素（interleukin，IL）-6等次級炎性因子水平升高和白細胞數(shù)量的增多，導(dǎo)致過度炎癥反應(yīng)。研究認為，TNF-α介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致膿毒癥損傷的重要機制之一［2］。超敏C-反應(yīng)蛋白（hypersensitive Creactive protein，hs-CRP）屬于炎癥類物質(zhì)，機體發(fā)生細菌感染時hs-CRP水平會迅速升高，可以作為膿毒癥早期診斷的標志物［3］。研究發(fā)現(xiàn)，炎性因子的檢測可用來預(yù)測膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展以及治療效果評估，多指標同時檢測可提高檢測的準確性［4-5］。然而，可同時進行檢測的技術(shù)較少，能滿足同時檢測多指標的試劑更少。雙標記時間分辨熒光免疫法（time-resolved fluorescence immunoassay，TRFIA）采用鑭系元素銪（Eu3+）和釤（Sm3+）作為標志物，是一種可實現(xiàn)雙指標同時檢測的超微量免疫分析技術(shù)，具有靈敏度、特異度高，線性范圍寬等特點［6］，可滿足膿毒癥多炎性因子的同時檢測。本研究擬建立一種雙標記TRFIA 法用于檢測血清TNF-α和hs-CRP 水平，以期為膿毒癥的早期篩查、療效評價和預(yù)后評估等提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料和儀器 收集2020年5月—2021年10月收治的70 例膿毒癥陽性患者的血清樣本，其中46 例來自河南省人民醫(yī)院，余24例來自華中阜外醫(yī)院；男45例，女25例，年齡12～55 歲，平均（28.3±14.9）歲。陽性：體溫＞38.3 ℃或者體溫＜36 ℃；心率升高、血壓降低、血糖升高、精神狀態(tài)不佳，白細胞計數(shù)（WBC）＞12×109/L，血漿C-反應(yīng)蛋白升高，血漿降鈣素原升高、高乳酸血癥等。同期健康體檢陰性血清樣本者100例，男52例，女48例，年齡15～45歲，平均（29.4±12.8）歲，均來自河南省人民醫(yī)院。陰性：沒有臨床膿毒癥的癥狀，血常規(guī)、尿常規(guī)、血壓血糖等正常。2 組性別（χ2=2.537）、年齡（t=0.515）差異無統(tǒng)計學(xué)意義?？筎NF-α 包被抗體（編號3E2）、檢測抗體（編號5B3），抗hs-CRP 包被抗體（編號4E2）和檢測抗體（編號10D3）以及TNF-α 和hs-CRP 標準抗原購自廣州優(yōu)迪生物科技股份有限公司；Eu3+和Sm3+標記試劑盒、Sephades-G50 填料和時間分辨熒光免疫檢測儀（型號Victor 1420）均購自PerkinElmer 公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購自Fitzgerald 公司；96 孔反應(yīng)板購自Costar公司。

1.2 反應(yīng)板包被 以50 mmol/L、pH=9.6 的碳酸鹽緩沖液將抗TNF-α包被抗體和抗hs-CRP包被抗體分別稀釋到2 mg/L，加入96 孔反應(yīng)板中，每孔100 μL，4 ℃包被過夜；拍干包被液，5% BSA 封閉，每孔250 μL，37 ℃孵育2 h；拍干封閉液，0.5%吐溫-20（Tween-20）的PBS 洗滌3 次，拍干后真空冷凍干燥，4 ℃冰箱保存。

1.3 Eu3+和Sm3+抗體偶聯(lián)物制備 參考試劑盒說明書和參考文獻［7］行Eu3+、Sm3+抗體偶聯(lián)。

1.4 試劑盒組裝 將TNF-α標準品母液分別稀釋成0、0.1、1、10、50 及100 ng/L，將hs-CRP 標準品母液分別稀釋成0、0.1、1、10、50 及100 mg/L；均1 mL/瓶分裝后凍干。Eu3+和Sm3+抗體偶聯(lián)物分別分裝，10 mL/瓶。分析緩沖液20 mL/瓶、洗滌液50 mL/瓶、增強液20 mL/瓶。將上述成分和反應(yīng)板放置于紙質(zhì)試劑盒中，組裝成TRFIA法檢測試劑盒。

1.5 TRFIA 試劑盒檢測血清TNF-α 和hs-CRP 水平 向包被反應(yīng)板中依次加入25 μL的血清樣品或標準品、100 μL分析緩沖液、100 μL Eu3+和Sm3+抗體偶聯(lián)物，室溫振動孵育1 h。洗滌液洗滌6 次，最后每孔加入200 μL 增強液，振搖5 min后，在Victor 1420全自動時間分辨熒光免疫分析檢測儀檢測熒光值。

1.6 TRFIA試劑盒性能評估

1.6.1 標準曲線的繪制 使用1.4中制備的TRFIA試劑盒測定TNF-α/hs-CRP標準品，每個標準品濃度設(shè)置重復(fù)3次，平行測定3次，計算各標準品熒光值的平均值，進行線性擬合，得到標準曲線及其相關(guān)系數(shù)。試劑盒靈敏度參照文獻［8］方法確定。

1.6.2 準確度和精密度試驗 將TNF-α和hs-CRP標準品母液分別用陰性血清稀釋為低（TNF-α：1 ng/L；hs-CRP：2 mg/L）、中（TNF-α：10 ng/L；hs-CRP：50 mg/L）和高（TNF-α：50 ng/L；hs-CRP：100 mg/L）3個質(zhì)量濃度，每個質(zhì)量濃度進行10次平行檢測，計算檢測平均值、標準差（standard deviation，s）、變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）以及加標回收率（測定濃度/加標濃度×100%）。

1.6.3 特異性試驗 用TRFIA 試劑盒檢測血清中常見的干擾物質(zhì)：降鈣素原（procalcitonin，PCT）標準品（100 μg/L）、人血清白蛋白標準品（100 μg/L）、纖維蛋白原標準品（100 μg/L）和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9標準品（100 μg/L），每個樣本設(shè)置重復(fù)3 次，計算交叉反應(yīng)率（檢測值/理論值×100%），結(jié)合試劑盒對TNF-α和hs-CRP檢測閾值，評估檢測特異性。

1.6.4 穩(wěn)定性試驗 TRFIA試劑盒分別存儲于4 ℃6個月和37 ℃7 d，對試劑盒的外包裝進行評估，并測定各標準品的熒光值，計算熒光值變化率=|穩(wěn)定性試驗前熒光值-37 ℃7 d或4 ℃6個月熒光值|/穩(wěn)定性試驗前熒光值×100%，確定試劑盒的穩(wěn)定性。

1.6.5 檢測閾值的確定 采用本試劑盒分別測定100例健康志愿者血清中TNF-α 和hs-CRP 的水平，分析正態(tài)性并確定95%CI，計算TNF-α 和hs-CRP 的參考值的上限，即檢測閾值。

1.7 臨床樣本對比檢測 70 例膿毒癥陽性血清樣本，15 份健康志愿者陰性血清樣本，采用TRFIA 試劑盒進行檢測，對比檢測結(jié)果與臨床結(jié)果，以確定本試劑盒篩查膿毒癥的準確性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料用±s表示，采用Excel 軟件，以TNF-α和hs-CRP 標準品濃度為橫坐標，其對應(yīng)的熒光值的對數(shù)值為縱坐標繪制標準曲線。

2 結(jié)果

2.1 標準曲線 TNF-α標準曲線方程：Y=0.037 1X+0.913 2，R2=0.992 7，線性范圍0～100 ng/L；hs-CRP標準曲線方程：Y=0.037 4X+1.028 4，R2=0.990 6，線性范圍0～100 mg/L。見圖1。平行測定10 次濃度為0的參考標準品的熒光值，得到本TRFIA 試劑盒對TNF-α的檢測靈敏度為0.05 ng/L，對hs-CRP的檢測靈敏度為0.02 mg/L。

Fig.1 Standard curves of TRFIA kit for detecting TNF-α and hs-CRP levels圖1 TRFIA試劑盒檢測TNF-α和hs-CRP水平的標準曲線

2.2 準確度和精密度試驗結(jié)果 TNF-α高、中、低3個質(zhì)量濃度的加標回收率為92.00%～107.00%，hs-CRP 的高、中、低3 個質(zhì)量濃度的加標回收率為95.00%～106.82%。TNF-α批內(nèi)CV為4.57%～9.24%，批間CV為5.13%～9.27%；hs-CRP 批內(nèi)CV為3.57%～7.69%，批間CV為6.07%～10.00%，批內(nèi)和批間的CV均≤10.00%，見表1。

2.3 特異性試驗結(jié)果 血清中常見的干擾物質(zhì)的檢測值均較小，得到的交叉反應(yīng)率均小于2%；且檢測值均小于TNF-α 和hs-CRP 的檢測閾值，結(jié)果判定為陰性，即高濃度的干擾物質(zhì)不影響檢測結(jié)果判定，見表2。

Tab.2 The specific test results of TRFIA kit表2 TRFIA試劑盒特異性試驗結(jié)果

2.4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果 37 ℃7 d熱破壞性試驗示試劑盒外包裝無明顯變化，各標準品熒光值未隨著時間的改變而發(fā)生明顯改變，熒光值變化率均小于1.5%；4 ℃冰箱中儲存6 個月，試劑盒外包裝無明顯變化，各標準品熒光值亦未隨時間的改變而發(fā)生明顯改變，熒光值變化率均小于2.5%，見表3。

2.5 檢測閾值確定結(jié)果 血清中TNF-α 檢測閾值為0.44 ng/L；hs-CRP檢測閾值為1.41 mg/L。

2.6 臨床樣本對比檢測 70 例臨床陽性樣本，TRFIA 試劑盒檢測結(jié)果均為陽性；15 份臨床陰性樣本，TRFIA 試劑盒檢測結(jié)果均為陰性。本TRFIA 試劑盒檢測結(jié)果與臨床情況相一致，符合率100%。

Tab.3 The stability results of TRFIA kit表3 TRFIA試劑盒穩(wěn)定性實驗結(jié)果

3 討論

膿毒癥是機體應(yīng)對感染時過度激活免疫系統(tǒng)，引起全身炎性因子的瀑布式釋放，從而導(dǎo)致器官及組織衰竭的一種綜合征，致死率高，全球范圍內(nèi)每年膿毒癥發(fā)病人數(shù)多達1 800萬，因膿毒癥導(dǎo)致的死亡人數(shù)每天將近1 400 例［9-10］。嬰幼兒和兒童因其身體器官發(fā)育尚不成熟，抵抗力較差，更容易受到膿毒癥的損害［11］。因此，準確、高效地檢測膿毒癥特異性標志物的變化，預(yù)測膿毒癥的發(fā)生與發(fā)展，對膿毒癥患者的醫(yī)治具有重要指導(dǎo)意義。臨床上對膿毒癥感染檢測指標選擇較多，有白細胞、中性粒細胞等，但其用于診斷感染的準確率較低［12］。膿毒癥作為一種炎性疾病，炎性因子（TNF-α、IL-6等）在其疾病發(fā)展初期已開始被分泌并釋放到血液中，多種炎性因子的檢測可用來預(yù)測膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展以及治療效果等［13］。對于炎性因子的檢測，臨床上有多種方法，如酶聯(lián)免疫吸附測定法、放射免疫法、化學(xué)發(fā)光法和TRFIA等，檢測性能各有優(yōu)劣，TRFIA因其可進行雙指標同時檢測而備受關(guān)注。

雙標記TRFIA方法作為一種新興的免疫檢測方法，已廣泛用于臨床樣本檢測、食品檢測以及獸醫(yī)學(xué)檢測等多個領(lǐng)域［13-14］。其具有高靈敏度、高特異性，適合臨床樣本分析的優(yōu)勢，是單標記診斷方法的良好替代［14］。本研究結(jié)果顯示，TNF-α在0～100 ng/L范圍內(nèi)檢測線性較好，hs-CRP 在0～100 mg/L 范圍內(nèi)檢測線性較好，檢測靈敏度分別為0.05 ng/L 和0.02 mg/L，可滿足臨床檢測的需要；TNF-α 和hs-CRP 的加標回收率90%～110%，批內(nèi)與批間CV均小于10%，表明本TRFIA 法檢測TNF-α 和hs-CRP的準確度和精密度較高，達到了臨床樣本檢測要求；穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示，該TRFIA試劑盒穩(wěn)定性較好；比對試驗表明，該TRFIA 試劑盒能夠準確地篩查膿毒癥臨床樣本。計算得到的參考閾值說明當(dāng)血清TNF-α≥0.44 ng/L、hs-CRP≥1.41 mg/L 時，患者有發(fā)生膿毒癥的危險。歐賽英等［15］建立的吖啶脂化學(xué)發(fā)光法最低TNF-α 檢測限為0.245～0.519 ng/L，線性范圍5～1 000 ng/L，回收率為92.6%～104.9%，總CV＜10%。本檢測方法的靈敏度高于上述檢測方法，線性范圍小于上述方法，準確性和精密度等同。雙標記TRFIA 檢測hs-CRP 和脂蛋白（a）的研究顯示，對hs-CRP 檢測靈敏度為0.052 mg/L，批內(nèi)批間CV均小于10%［16］。本研究TRFIA法檢測hs-CRP的分析性能與上述TRFIA等同。因此，筆者認為，與其他檢測方法相比，TRFIA是一種應(yīng)用前景廣、可實現(xiàn)多指標同時檢測的新型技術(shù)。

綜上所述，本研究建立的TNF-α/hs-CRP 雙標記時間分辨免疫熒光試劑盒具有高靈敏度和高特異性的優(yōu)點，能夠?qū)崿F(xiàn)對TNF-α/hs-CRP 的快速檢測，可作為輔助膿毒癥早期篩查的技術(shù)手段在臨床推廣應(yīng)用。