多花水莧對芐嘧磺隆的抗性水平及靶標抗性機制

楊 倩, 衛(wèi) 甜, 朱錦磊, 劉懷阿, 呂 敏

(江蘇里下河地區(qū)農業(yè)科學研究所，江蘇 揚州 225007)

多花水莧Ammannia multifloraRoxb. 是千屈菜科Lythraceae 水莧菜屬AmmanniaLinn. 雜草，主要分布在我國南部各省份，常生于濕地或水田中[1]。近年來，多花水莧在我國江蘇省和浙江省等地稻田發(fā)生嚴重，已成為區(qū)域性雜草，對水稻產量和品質構成了嚴重威脅[2-3]。芐嘧磺隆屬于乙酰乳酸合成酶 (ALS) 抑制劑中的磺酰脲類除草劑，是我國稻田防除闊葉雜草和莎草的主要藥劑之一，因其具有活性高、選擇性強、對水稻和后茬作物安全以及可與其他作用機制除草劑混用等優(yōu)點，并且兼具土壤封閉和莖葉處理效果，在我國稻田已有近30 年的使用歷史[4-5]。由于芐嘧磺隆的長期使用，已導致該藥劑對稻田多種闊葉雜草防效顯著下降[6-7]。

ALS 抑制劑屬于抗性風險較高的一類除草劑，連續(xù)單一使用容易使雜草對其產生抗藥性[8]。截至2021 年7 月，全球已報道167 種雜草對ALS抑制劑類除草劑產生了抗性，約占到抗藥性雜草總數(shù) (522 例) 的三分之一[9]。我國稻田中主要闊葉雜草如雨久花Monochoria korsakowii、野慈姑Sagittaria trifolia、鱧腸Eclipta prostrata、丁香蓼Ludwigia prostrata、耳葉水莧Ammannia arenaria等均已對其產生不同程度的抗性[6-7,10-12]。雜草對除草劑產生抗性的機制主要有兩種——靶標敏感性下降和代謝解毒能力增強。ALS基因突變導致除草劑與靶標酶結合能力下降，是雜草對ALS 抑制劑類除草劑產生抗性的主要機制[8]。目前，已明確ALS基因上的5 個保守區(qū)域共有8 個氨基酸位點的突變與對除草劑的抗性相關，分別是第122位丙氨酸 (Ala122)、197 位脯氨酸 (Pro197)、205位丙氨酸 (Ala205)、376 位天冬氨酸 (Asp376)、377 位精氨酸 (Arg377)、574 位色氨酸 (Trp574)、653 位絲氨酸 (Ser653) 和654 位甘氨酸 (Gly654)[9]。此8 個氨基酸位點上共報道了29 種突變類型，且在部分雜草中發(fā)現(xiàn)ALS基因上同時存在多個位點的突變，能夠使雜草獲得更高水平的抗性[13-14]。此外，由細胞色素P450、谷胱甘肽-S-轉移酶、ABC轉運蛋白等解毒酶介導的對ALS 抑制劑類除草劑的代謝抗性也已在多種抗藥性雜草中被報道[15-17]。

目前，多花水莧在我國南方稻田為害日益嚴重，且部分地區(qū)芐嘧磺隆對其防治效果明顯下降，推測多花水莧可能已對芐嘧磺隆產生了抗性，但目前尚無相關報道。為了明確江蘇省多花水莧對芐嘧磺隆的抗性水平及抗性機理，本研究采用整株水平測定法，測定了采自江蘇省揚州市水稻田的多花水莧疑似抗性種群 (YZ-R) 和相對敏感種群 (YZ-S) 對芐嘧磺隆的敏感性，分析了YZR 和YZ-S 種群多花水莧ALS 酶對芐嘧磺隆的敏感性差異，并對其靶標基因ALS進行了擴增和序列比對，以期初步探明其產生抗藥性的分子機制，為多花水莧的抗藥性治理提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 雜草 多花水莧Ammannia multifloraRoxb.疑似抗性種群 (YZ-R) 于2018 年10 月采自江蘇省揚州市廣陵區(qū)水稻田 (32.30° N；119.55° E)，已有約20 年的芐嘧磺隆用藥歷史；多花水莧相對敏感種群 (YZ-S) 于同年采自江蘇省揚州市邗江區(qū)田邊水溝 (32.40° N；119.43° E)，很少使用除草劑。所有種群均從至少20 株多花水莧植株上隨機收集種子，在實驗室自然晾曬風干，備用。

1.1.2 除草劑 10% 芐嘧磺隆 (bensulfuronmethyl) 可濕性粉劑 (WP)，江蘇快達農化股份有限公司； 97%芐嘧磺隆原藥，江蘇綠利來股份有限公司。

1.1.3 生物試劑及主要儀器設備 植物Total RNA 提取試劑盒，寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司；2 × Taq PCR MasterMix、普通瓊脂糖DNA 回收試劑盒、Fast Quant RT Kit (with gDNase) 試劑盒，天根生化科技 (北京) 有限公司。GXZ 型智能光照培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；3WPSH-5000 型生測噴霧塔，南京農業(yè)機械化研究所；5427R 型臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf 公司；MK3酶標儀，美國Thermo 公司；Mastercycler Nexus Gradient 梯度PCR 儀，德國Eppendorf 公司；DYY-6C 型電泳儀，北京六一儀器廠；ChampGel 6000 全自動凝膠成像儀，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試材培養(yǎng) 將營養(yǎng)土與蛭石按等體積混合，裝入7 cm × 7 cm × 7 cm 的塑料盆缽中，每盆用小毛筆點播至少32 粒多花水莧種子，上覆約0.1 cm 厚細土層，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng) (光周期L/D：14 h/10 h；溫度：白天35 ℃，夜晚30 ℃)。待幼苗生長至1 對真葉后間苗，每盆保留16 株長勢基本一致的多花水莧植株。

1.2.2 多花水莧對芐嘧磺隆的抗性水平測定 采用整株水平測定法[18]。待多花水莧植株生長至2～3 對真葉期時，采用生測噴霧塔進行莖葉噴霧施藥處理，設定噴液量為450 L/hm2，噴霧壓力0.3 MPa。根據(jù)芐嘧磺隆的田間推薦劑量 (45 g/hm2，按有效成分計，以下同) 和預試驗結果，確定芐嘧磺隆的處理劑量。其中，疑似抗性種群YZ-R 處理劑量分別為：0、2.81、11.25、45、180 和720 g/hm2；相對敏感種群YZ-S 處理劑量分別為：0、0.18、0.70、2.81、11.25、45 和180 g/hm2，以噴清水作為對照。處理后21 d，剪取并稱量多花水莧地上部分鮮重，計算GR50值。每處理設3 個重復，試驗重復2 次。

1.2.3 YZ-R 和YZ-S 種群ALS 酶對芐嘧磺隆的敏感性測定 多花水莧ALS 酶提取和離體活性測定參考Deng 等[14]和Yu 等[19]的方法。將YZ-R 和YZ-S 種群的多花水莧植株培養(yǎng)至3～4 對真葉期，分別剪取3 g 植株葉片，于 -80 ℃冰箱保存，備用。稱取一定質量的芐嘧磺隆原藥，溶于少量丙酮，用去離子水定容并按梯度稀釋成系列濃度。酶活性測定反應體系中，芐嘧磺隆的系列終濃度分別為0、1.45 × 10-5、1.45 × 10-4、1.45 × 10-3、1.45 × 10-2、0.145、1.45、14.5 和145 μmol/L。每處理重復3 次，試驗重復2 次。

1.2.4 YZ-R 和YZ-S 種群ALS基因的克隆和序列比對1.2.4.1 引物設計 根據(jù)NCBI 登記的擬南芥Arabidopsis thaliana(AT3G48560)、播娘蒿Descurainia Sophia(KC417457)、薺菜Capsella bursa-pastoris(HQ880660)、豬殃殃Galium aparine(GU377313) 及牛繁縷Myosoton aquaticum(KF589890) 等雙子葉植物的ALS基因序列，在保守區(qū)域分別設計2 對引物 (表1)，用于擴增ALS基因，該擴增區(qū)域覆蓋了ALS基因上已報道的全部8 個突變位點。引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。

表1 多花水莧ALS 基因擴增引物Table 1 Primers for the amplification of ALS gene in A. multiflora

1.2.4.2 總RNA 提取和cDNA 合成 待多花水莧植株生長至3～4 對葉期，分別單株收集YZ-R 和YZ-S 種群的幼嫩葉片組織，其中YZ-R 種群取10 株，YZ-S 種群取6 株，迅速用液氮處理后于-80 ℃冰箱保存。采用植物Total RNA 提取試劑盒提取總RNA，經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳分析RNA 降解程度，通過Nanodrop 檢測RNA 的純度并精確定量。使用反轉錄試劑盒進行RNA 的反轉錄，合成cDNA 第一條鏈，于 -20 ℃冰箱保存，備用。

1.2.4.3ALS基因序列擴增和測序 PCR 擴增反應體系為50 μL，包括：25 μL 2 × Taq PCR MasterMix，1 μL 正向引物 (10 μmol/L)，1 μL 反向引物 (10 μmol/L)，21 μL ddH2O 和2 μL cDNA模板。PCR 反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，重復35 個循環(huán)；最后于72 ℃ 延伸 5 min；4 ℃保存。得到的PCR 產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并進行PCR 產物回收后送生工生物工程 (上海) 股份有限公司測序。

以模式植物擬南芥的ALS基因氨基酸序列編號為標準，使用DNAMAN 6.0.3 軟件分別對多花水莧YZ-R 種群和YZ-S 種群的ALS基因測序結果進行比對，分析ALS基因序列中8 個抗性相關位點是否發(fā)生了基因突變。

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

采用SPSS 20.0 軟件的單因素方差分析法對整株生物測定和離體酶活性測定的數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。通過SigmaPlot 12.0 軟件的雙邏輯非線性方程 (1) 計算抑制雜草50%生長所需的除草劑劑量 (GR50) 和抑制其ALS 酶50%活性所需的除草劑濃度 (I50)；采用公式 (2) 計算抗性指數(shù)RI(resistance index)。

式中：x，芐嘧磺隆劑量 (g/hm2) 或濃度(μmol/L)；y，芐嘧磺隆不同劑量處理下鮮重與對照鮮重的百分比或不同濃度處理下ALS 酶催化活性與對照的百分比；C，劑量反應下限；D，劑量反應上限；b，在GR50或I50處的斜率。

2 結果與分析

2.1 多花水莧對芐嘧磺隆的抗性水平

由圖1A 可以看出：在芐嘧磺隆1/16 田間推薦劑量 (2.81 g/hm2) 下，多花水莧敏感種群YZ-S植株的生長即受到嚴重抑制，主要表現(xiàn)為葉片黃化、生長停滯；而在芐嘧磺隆田間推薦劑量(45 g/hm2) 下，疑似抗性種群YZ-R 的生長雖受到一定抑制，但仍可繼續(xù)完成其生活史。利用雙邏輯非線性回歸方程進行數(shù)據(jù)擬合，得到兩個種群的劑量反應曲線 (圖1B)。其中，YZ-S 種群的GR50值為1.61 g/hm2，YZ-R 種群的GR50值為65.28 g/hm2，表明多花水莧YZ-R 種群已對芐嘧磺隆產生高水平抗性，其抗性指數(shù)為40.6。

圖1 芐嘧磺隆對多花水莧YZ-S 和YZ-R 種群的抑制作用 (A) 和劑量-反應曲線 (B)Fig. 1 Inhibition of bensulfuron-methyl to A. multiflora YZ-S and YZ-R populations (A) and dose-response curves (B)

2.2 YZ-R 和YZ-S 種群ALS 酶對芐嘧磺隆的敏感性

離體ALS 酶對芐嘧磺隆的敏感性測定結果見表2。未使用除草劑處理時，多花水莧YZ-R 和YZ-S 種群之間ALS 酶總催化活性無顯著性差異；經(jīng)芐嘧磺隆處理后，與YZ-S 種群相比，YZR 種群ALS 酶的敏感性顯著下降，抗性指數(shù)為31.1。

表2 離體條件下多花水莧YZ-S 和YZ-R 種群ALS 酶對芐嘧磺隆的敏感性Table 2 In vitro sensitivity of ALS enzyme in YZ-S and YZ-R A. multiflora to bensulfuron-methyl

2.3 YZ-R 和YZ-S 種群的ALS 基因差異

將多花水莧YZ-R 和YZ-S 種群的ALS基因核苷酸序列與擬南芥的ALS基因核苷酸序列進行比對，結果 (圖2) 表明：與YZ-S 種群相比，YZ-R種群ALS基因的第588 位堿基C 突變?yōu)門，導致其第197 位的脯氨酸 (Pro) 突變?yōu)榻z氨酸 (Ser)；且在YZ-R 種群的10 株植株中都發(fā)生了Pro-197-Ser 突變。

圖2 多花水莧YZ-S 種群 (6 株) 和YZ-R 種群 (10 株) ALS 基因部分核苷酸序列比對Fig. 2 Nucleotide sequence alignments of ALS gene fragment from YZ-S population (6 plants) and YZ-R population (10 plants)

3 結論與討論

芐嘧磺隆于1986 年即開始在我國登記使用，可有效防除水稻田中絕大多數(shù)闊葉雜草和莎草，對水稻和后茬作物都十分安全。近年來，芐嘧磺隆主要與丙草胺 (pretilachlor)、苯噻酰草胺(mefenacet) 及二氯喹啉酸 (quinclorac) 等水稻田除草劑進行復配使用，以擴大殺草譜。由于芐嘧磺隆在水稻田的長期使用，已導致稻田多種雜草均對其產生了不同程度的抗藥性。2009 年，盧宗志等[10]報道吉林省稻田2 個雨久花種群分別對芐嘧磺隆產生了6.0 和13.6 倍的抗性。2013 年，王興國等[6]報道了浙江省不同稻區(qū)耳葉水莧對芐嘧磺隆的抗性，在88 個種群中發(fā)現(xiàn)有99.6%的種群已對芐嘧磺隆產生不同程度的抗性。2015 年，李平生等[20]報道遼寧省4 個野慈姑種群對芐嘧磺隆產生了12.48～76.99 倍的抗性。2021 年，Deng 等[12]報道江蘇省1 個丁香蓼種群對芐嘧磺隆產生了21.18 倍的抗性。2021 年，汪濤等[21]報道遼寧省稻田9 個螢藺Scirpus juncoides種群對芐嘧磺隆的抗性水平已高達48.66～106.83 倍。本研究中，多花水莧YZ-R 種群對芐嘧磺隆也產生了40.6 倍的高水平抗性，與文獻報道中水稻田雜草對芐嘧磺隆的抗性趨勢相符。

本研究對YZ-R 和YZ-S 種群多花水莧ALS基因分別進行測序分析后發(fā)現(xiàn)，YZ-R 種群植株的ALS基因發(fā)生了Pro-197-Ser 的氨基酸突變，并且該種群ALS 酶對芐嘧磺隆的敏感性相比YZ-S 種群亦出現(xiàn)了顯著下降，抗性指數(shù)為31.1，但是YZ-R 和YZ-S 種群之間靶標酶ALS 的總催化活性并沒有顯著差異。這與前人關于播娘蒿[22]及硬直黑麥草Lolium rigidum[17]ALS基因上Pro-197-Ser 突變的研究結果一致，但也有研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生Pro-197-Ser 突變的抗性野蘿卜Raphanus raphanistrum[23]和牛繁縷[24]的ALS 酶總催化活性顯著高于敏感生物型。目前尚無證據(jù)表明，ALS酶總活性與突變類型及雜草種類等有關。本研究表明，抗性多花水莧ALS基因上發(fā)生 Pro-197-Ser 突變，使得ALS 酶的空間結構發(fā)生了變化，除草劑和靶標酶的結合能力隨之減弱，從而導致多花水莧對芐嘧磺隆產生了抗性。

靶標基因突變是雜草對ALS 抑制劑類除草劑產生抗性的最主要機制[8]。ALS基因上發(fā)生Pro-197-Ser 突變導致雜草對ALS 抑制劑的抗性，已在對播娘蒿、豬殃殃、薺菜、鱧腸及瑩藺等多種雜草的研究中得到證實[21,25-28]。目前，在ALS基因上已報道的8 個抗性相關位點中，關于Pro197 和Trp574 位點突變的發(fā)現(xiàn)最多，分別在39 種和40 種雜草中已有相關報道[9]。ALS基因上不同位點的突變與除草劑類型、藥劑選擇壓力和雜草適合度代價等因素有關，例如針對磺酰脲類除草劑容易篩選出Pro197 位點突變的抗性雜草，而針對咪唑啉酮類除草劑則更容易篩選出Trp 574 位點突變的抗性雜草[8]。此外，雜草單株中若同時發(fā)生兩個靶標位點的突變，會導致其對除草劑產生更高水平抗性。張樂樂等[29]研究發(fā)現(xiàn)，薺菜ALS基因上同時發(fā)生Pro-197-Leu 和Trp-574-Leu 突變，導致其對苯磺隆的抗性水平達到了219.6 倍；而Xu 等[30]發(fā)現(xiàn)，播娘蒿ALS基因上Pro-197-Ala 和Asp-376-Glu 突變的同時發(fā)生，甚至使得該種群對苯磺隆產生了高達10 836.3 倍的抗性。

綜上所述，本研究明確了水稻田雜草多花水莧對ALS 抑制劑類除草劑芐嘧磺隆產生高水平抗性的主要原因是其靶標基因ALS上發(fā)生了Pro-197-Ser 突變，該突變導致ALS 酶對芐嘧磺隆的敏感性顯著下降。至于該芐嘧磺隆抗性種群是否對不同類型ALS 抑制劑如五氟磺草胺、雙草醚等以及其他不同作用機理的除草劑存在交互抗性或多抗性，還有待進一步探討。

雜草對除草劑的抗藥性已成為當前農田草害治理的主要難題。抗藥性雜草的出現(xiàn)，迫使農戶不斷提高除草劑用量，從而進一步增強了除草劑的選擇壓力，導致雜草抗藥性水平不斷升高。因此，在實際生產中，應注意將農業(yè)措施 (如水、旱輪作及稻田綜合種養(yǎng)等) 與化學藥劑防治措施相結合，同時科學選擇并輪用或混合使用不同作用機制的除草劑，以有效控制雜草為害，延緩抗藥性的發(fā)展。