超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法快速測定3 種含生物堿類中藥材中193 種農(nóng)藥殘留

曹依敏, 周 恒, 蘭 嵐, 苗 水, 胡 青,毛秀紅, 張紅梅, 季 申*,

(1. 上海中醫(yī)藥大學 中藥學院，上海 201203；2. 上海市食品藥品檢驗研究院，上海 201203)

生物堿 (alkaloid) 是指主要來源于植物界的一類含氮有機化合物，多呈堿性，具有顯著的抗腫瘤、抗菌消炎等生物活性，是中藥材中重要的有效成分之一[1]。延胡索 Rhizoma Corydalis，又稱元胡，是罌粟科植物延胡索Corydalis yanhusuoW.T. Wang 的干燥塊莖[2]。黃連 Rhizoma Coptidis，是毛茛科植物黃連Coptis chinensisFranch.、三角葉黃連Coptis deltoideaC. Y. Cheng et Hsiao 或云連Coptis teetaWall. 的干燥根莖[2]。黃柏Cortex Phellodendri，是蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinenseSchneid.的干燥樹皮[2]。這3 種中藥材作為典型含生物堿類中藥材在臨床廣泛使用，近幾年對其需求量迅速增長，規(guī)?；斯しN植已成為其主要獲取方式。在種植過程中發(fā)生病蟲害，需要使用農(nóng)藥進行防治，但超劑量、超范圍使用農(nóng)藥的現(xiàn)象較為普遍，給中藥材農(nóng)藥殘留安全防控帶來嚴峻挑戰(zhàn)[3-4]。因此，有必要建立適用于含生物堿類中藥材的農(nóng)藥多殘留快速篩查方法，以保證其用藥安全。

目前中藥材中農(nóng)藥殘留檢測方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[5-8]，其中串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)由于靈敏度高、選擇性好，在中藥材農(nóng)藥殘留檢測中應用范圍較為廣泛[9-11]。三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜一般采用多反應監(jiān)測掃描模式，但受限于分辨率和掃描速率，在復雜中藥樣本分析中仍可能受到基質(zhì)干擾成分影響，出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果。近幾年，高分辨質(zhì)譜 (HRMS) 技術(shù)快速發(fā)展，已廣泛應用于蔬菜水果[12-14]、豆類雜糧[15]、辣椒粉[16]、茶葉[17]以及葡萄酒[18]等食品基質(zhì)的農(nóng)藥殘留風險監(jiān)測，而將HRMS 應用于中藥材中農(nóng)藥多殘留檢測分析的報道相對較少[19-22]。靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜具有高分辨率和高質(zhì)量精度等特點，采用全掃描/數(shù)據(jù)依賴型二級掃描模式 (Full MS/ddMS2)，可同時獲得目標物母離子和碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)等質(zhì)譜信息，具有更強的抗基質(zhì)干擾能力，并能實現(xiàn)非目標物的回溯分析，對復雜基質(zhì)的農(nóng)藥殘留高通量快速篩查具有更廣闊的應用前景。

本研究針對含生物堿類中藥材的基質(zhì)特點，通過改良QuEChERS 前處理方法，首次引入陽離子交換型吸附劑作為分散固相萃取凈化填料，以去除生物堿類等干擾物質(zhì)，結(jié)合超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜 (UPLC-Q-Orbitrap HRMS) 建立了3 種含生物堿類中藥材中193 種農(nóng)藥殘留的定性定量檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、藥劑與試劑

超高效液相色譜-四極桿/靜電軌道阱高分辨質(zhì)譜儀：Acquity 超高效液相色譜儀 (美國Waters 公司) + Q-Exactive 高分辨質(zhì)譜儀 (美國Thermo 公司)；Agilent 1260 型高效液相色譜儀 (美國Agilent公司)；KS 260 control 振蕩器 (德國IKA 公司)；MINI VORTEXER 渦旋儀 (美國Fisher Scientific 公司)； MULTIVAP 113 型氮氣吹干儀 (美國OI-SYS公司)； SQP/CP224S/CP225D型電子天平 (德國Sartorius 公司)。

193 種農(nóng)藥標準品 (德國Dr. Ehrensterfer GmbH 公司或德國Sigma-aldrich 公司)；QExactive 高分辨質(zhì)譜儀正離子模式校正液 (美國Thermo 公司)；甲醇 (質(zhì)譜級，德國Merck 公司)；甲酸 (質(zhì)譜級，美國Fisher Scientific 公司)；甲酸銨 (質(zhì)譜級，美國Sigma 公司)；乙腈、甲醇、丙酮 (色譜級，美國Fisher Scientific 公司)；冰醋酸和無水硫酸鎂 (分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；提取管：6 g 無水硫酸鎂與1.5 g 無水醋酸鈉的混合粉末 (北京迪馬科技有限公司)；凈化填料：十八烷基硅烷鍵合硅膠 (C18) (40～60 μm)、N-丙基乙二胺 (PSA) (40～60 μm)、硅膠 (40～60 μm)(天津博納艾杰爾科技有限公司)，Oasis MCX 混合型強陽離子交換反相吸附劑 (美國Waters 公司)；去離子水 (經(jīng)Milli-Q Advantage A10 過濾，美國Millipore 公司)。

1.2 儀器分析條件

色譜條件：Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱 (3.0 mm × 150 mm，2.7 μm)；洗脫程序：流動相A 為含0.1%甲酸和5 mmol/L 甲酸銨水溶液，流動相B 為含0.1%甲酸和5 mmol/L 甲酸銨的甲醇溶液。梯度洗脫程序：0～1 min，95% A；＞1～4 min，95%～40% A；＞4～8 min，40%～36% A；＞8～8.5 min，36%～32% A；＞8.5～9 min，32%～25% A；＞9～16 min，25%～5% A；＞16～20 min，5% A。流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進樣體積5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子掃描模式(ESI+)；監(jiān)測方式為 Full MS / ddMS2模式；電噴霧電壓3.5 kV；毛細管溫度325 ℃；S-lens RF level：55.0；鞘氣48；輔助氣11；吹掃氣2；輔助氣溫度325 ℃。一級質(zhì)譜參數(shù)：分辨率為70 000 FWHM，自動增益控制為3 e6，最大注入時間為200 ms，掃描范圍m/z70～1 050。二級質(zhì)譜參數(shù)：分辨率為17 500 FWHM，自動增益控制為1 e5，最大注入時間為60 ms，loop count 為4，隔離窗口為3.0m/z，歸一化碰撞能量為20、40、60，母離子強度關(guān)聯(lián)觸發(fā)閾值為8.3 e4，apex trigger 時間窗為2～6 s，動態(tài)排除時間為5.0 s。

1.3 樣品制備

取3 g (精確至0.01 g) 粉碎 (過三號篩) 的樣品至50 mL 離心管中，加入1%的冰醋酸溶液(1%為體積分數(shù)，下同) 15 mL，渦旋、浸泡30 min。準確加入乙腈15 mL，置于振蕩器上劇烈振蕩10 min。加入6 g 無水硫酸鎂與1.5 g 無水醋酸鈉的混合粉末，立即搖散，再置于振蕩器上劇烈振蕩5 min。于冰浴中冷卻10 min，離心 (3 900 r/min)5 min。取9 mL 上清液，置于預先裝有凈化填料的固相萃取凈化管 (無水硫酸鎂900 mg，PSA 300 mg，C18300 mg，硅膠 600 mg，MCX 150 mg)中，渦旋使充分混勻，再置于振蕩器上劇烈振蕩10 min，離心 (3 900 r/min) 5 min。取5 mL 上清液，在氮氣吹干儀上于40 ℃水浴濃縮至約0.5 mL，用50%甲醇定容至2 mL，渦旋使混勻，高速離心(10 000 r/min) 10 min。取上清液，即為空白基質(zhì)溶液，待測。

1.4 農(nóng)藥標準溶液的制備及標準曲線繪制

1.4.1 標準儲備溶液 稱取適量農(nóng)藥標準品，根據(jù)農(nóng)藥標準品的不同性質(zhì)分別用乙腈、甲醇或丙酮配制成1 000 mg/L 的單一標準儲備溶液，于-20 ℃保存。

1.4.2 混合標準溶液 分別吸取一定體積的各單一標準儲備溶液于100 mL 容量瓶中，用乙腈定容，得到1 000 μg/L 的混合標準溶液，于4 ℃保存。

1.4.3 標準工作溶液 分別量取5、10、50、100 及200 μL 的1 000 μg/L 混合標準溶液，先分別用乙腈補足體積至500 μL 后，再用50%甲醇定容至2 mL，配制成質(zhì)量濃度分別為2.5、5、25、50 及100 μg/L 的標準工作溶液。按1.2 節(jié)的條件測定，以各化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標 (x)，峰面積為縱坐標 (y)，權(quán)重為1/x，繪制溶劑標準曲線。

1.4.4 基質(zhì)匹配混合標準工作溶液 按1.3 節(jié)的方法制備空白基質(zhì)溶液，氮吹至0.3 mL 以下，分別加入5、10、50、100 及200 μL 的混合標準溶液，先用乙腈補足體積至500 μL 后，再用50%甲醇定容至2 mL，于10 000 r/min 下離心10 min，取上清液，即得質(zhì)量濃度分別為2.5、5、25、50 及100 μg/L的基質(zhì)匹配混合標準工作溶液。按1.2 節(jié)的條件測定，以各化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標 (x)，峰面積為縱坐標 (y)，權(quán)重為1/x，繪制基質(zhì)匹配標準曲線。

1.5 添加回收試驗

向延胡索、黃連和黃柏空白基質(zhì)溶液中分別添加193 種農(nóng)藥混合標準溶液，添加水平分別為10、50 和100 μg/kg，每個水平6 次重復，按1.2 節(jié)的條件測定，計算平均回收率及相對標準偏差 (RSD)。參考歐盟農(nóng)藥殘留指導原則SANTE/12682/2019 進行評價，將實際最低添加水平作為定量限 (LOQ)[23]。

1.6 基質(zhì)效應

基質(zhì)效應 (Me) 作為質(zhì)譜定量分析中影響方法正確度、精密度和靈敏度的主要問題之一[24]，本研究通過比較各農(nóng)藥化合物基質(zhì)匹配標準曲線與溶劑標準曲線的斜率比評價Me，計算公式為：Me/%=[(基質(zhì)匹配標準曲線的斜率/溶劑標準曲線的斜率)-1] × 100，Me＞20% 為基質(zhì)增強效應，－20%≤Me≤20% 為基質(zhì)效應不明顯，Me＜－20%為基質(zhì)抑制效應[25]。

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用TraceFinder 4.1 數(shù)據(jù)處理軟件 (美國Thermo 公司) 對原始采集數(shù)據(jù)進行處理，并配合Excel 2019 進行數(shù)據(jù)匯總和分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

本研究采用Full MS/ddMS2掃描模式，一級質(zhì)譜全掃描，同時設定目標物列表，采用自動觸發(fā)二級質(zhì)譜模式，獲得各農(nóng)藥化合物的母離子及碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)和保留時間等質(zhì)譜信息。農(nóng)藥標準品溶液按1.2 節(jié)的條件測定，建立了193 種農(nóng)藥的標準數(shù)據(jù)庫 (表1)。為了保證母離子及碎片離子的準確度，母離子選擇各農(nóng)藥化合物響應強度最高的母離子加合形式，一般為[M + H]+或[M + NH4]+，而對于乙酰甲胺磷等容易發(fā)生源內(nèi)裂解的農(nóng)藥化合物，選擇響應強度高的源內(nèi)裂解離子作為母離子。碎片離子優(yōu)先選擇響應強度高、質(zhì)量數(shù)大于90 的離子，同時采用Mass Frontier 4.1 軟件或人工推導得到碎片離子的理論精確質(zhì)量數(shù)，以避免實測值帶來的二次質(zhì)量偏差。

表1 193 種農(nóng)藥高分辨質(zhì)譜標準數(shù)據(jù)庫及定量限Table 1 The In-House compound database and LOQs of 193 pesticides

為提高篩查效率，降低假陽性率，保證篩查結(jié)果的準確性，農(nóng)藥殘留的確證參數(shù)參考歐盟農(nóng)藥殘留指導原則SANTE/12682/2019，陽性結(jié)果必須滿足以下條件：與標準數(shù)據(jù)庫中目標化合物的母離子及碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)偏差 ≤5 ppm (若m/z＜ 200，則精確質(zhì)量數(shù)偏差 ＜1 mDa)，至少檢出1 個碎片離子，保留時間窗口為 ± 0.15 min[23]。

續(xù)表1Table 1 (Continued)

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2.2 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 分散固相萃取 (d-SPE) 凈化填料的優(yōu)化 生物堿類中藥材中含有大量生物堿、甾體類、有機酸以及糖類等干擾成分。本研究考察了MCX、C18、PSA 和硅膠4 種凈化填料對延胡索、黃連和黃柏的凈化程度。結(jié)果 (圖1) 表明：MCX 作為混合型強陽離子交換、水可浸潤聚合物吸附劑，具有離子交換和反相保留雙重保留模式，對堿性化合物具有較高的選擇性和靈敏度，凈化3 種基質(zhì)中生物堿類干擾成分明顯，凈化效果最顯著；硅膠可以去除極性較大的含氮化合物以及糖類等干擾物，凈化效果次之；PSA 和C18對基質(zhì)凈化影響較小，但為了減少對儀器的污染，依然選擇使用PSA 和C18以去除有機酸及部分弱極性干擾物。最終選擇MCX、硅膠、PSA 和 C18作為凈化填料。

圖1 不同凈化填料的凈化效果 (延胡索)Fig. 1 Purification effect of different adsorbents(Rhizoma Corydalis)

固定無水硫酸鎂 900 mg、PSA 300 mg 和C18300 mg，比較了硅膠用量 (300、600 和900 mg) 對凈化效果的影響。結(jié)果表明：與用量300 mg 相比較，600 mg 與900 mg 的用量使得大部分農(nóng)藥響應明顯上升，用量600 mg 與900 mg 效果相近，最終選擇硅膠用量為600 mg。固定上述4 種凈化填料，比較了MCX 用量 (0、90、150 和250 mg)對凈化效果的影響。結(jié)果表明：MCX 加入量過多，農(nóng)藥會被吸附，導致回收率下降，計算所有農(nóng)藥的回收率 (圖2)，當MCX 為150 mg 時，延胡索、黃連和黃柏中分別有98.5%、94.9% 和96.4%的農(nóng)藥回收率為70%～120%，符合農(nóng)藥殘留方法學驗證規(guī)定[23]。因此d-SPE 的最終配比為：無水硫酸鎂900 mg，PSA 300 mg，C18300 mg，硅膠 600 mg，MCX 150 mg。

圖2 不同MCX 用量下回收率在70%～120%之間的農(nóng)藥數(shù)量占比Fig. 2 Proportion of pesticides with recovery rate of 70%-120% under different MCX content

2.2.2 定容溶劑的優(yōu)化 高通量農(nóng)藥殘留篩查，液相色譜流動相條件初始比例一般溶劑強度較小，定容溶劑的溶劑強度如果太大，會造成峰形改變等強溶劑效應，為改善保留時間前端農(nóng)藥化合物的峰形，對定容溶劑進行了優(yōu)化，分別比較了乙腈、V(乙腈) :V(水) =1 : 1 及V(乙腈) :V(甲醇) :V(水) =2 : 3 : 3。結(jié)果 (圖3) 表明：V(乙腈) :V(甲醇) :V(水) =2 : 3 : 3 效果最佳，在該條件下3 種基質(zhì)中193 種農(nóng)藥的提取離子流圖見圖4。

圖3 不同定容溶劑下乙酰甲胺磷提取離子流圖Fig. 3 Extracted ion chromatograms of acephate using different injection solvents

圖4 3 種基質(zhì)中193 種農(nóng)藥母離子提取離子流圖Fig. 4 Extracted ion chromatogramsion of precursor ions of 193 pesticides

2.3 方法評價

2.3.1 基質(zhì)效應 結(jié)果表明：193 種農(nóng)藥化合物中，延胡索、黃連和黃柏中分別有27.5%、99.0%和95.5%的農(nóng)藥顯示基質(zhì)抑制效應，因此采用基質(zhì)匹配標準曲線進行定量分析。

2.3.2 線性關(guān)系 結(jié)果表明：除吡蟲啉可能與黃連中某些堿性物質(zhì)發(fā)生反應導致無響應外，其余農(nóng)藥化合物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù) (r) 均大于0.99。

2.3.3 添加回收率及定量限 (LOQ) 結(jié)果表明：在10、50、100 μg/kg 3 個添加水平下，193 種農(nóng)藥 (包括4 組同分異構(gòu)體)，在延胡索中的平均回收率為58%～120%，RSD 為0.4%～16.6%，其中190 種 (98.4%) 農(nóng)藥LOQ 為10 μg/kg，3 種 (1.6%)農(nóng)藥LOQ 為50 μg/kg；在黃連中的平均回收率為68%～124%，RSD 為0.5%～19.6%，除吡蟲啉外，其中165 種 (85.5%) 農(nóng)藥LOQ 為10 μg/kg，22 種(11.4%) 農(nóng)藥LOQ 為50 μg/kg，5 種 (2.6%) 農(nóng)藥LOQ 為100 μg/kg；在黃柏中的平均回收率為73%～122%，RSD 為0.7%～18.9%，其中168 種(87.0%) 農(nóng)藥LOQ 為10 μg/kg，23 種 (11.9%) 農(nóng)藥LOQ 為50 μg/kg，2 種 (1.0%) 農(nóng)藥LOQ 為100 μg/kg。其中氯磺隆添加回收率偏低，可能是由于其水溶性較大，且在酸性條件下不穩(wěn)定所致；MCX 吸附作用較強也可能導致某些農(nóng)藥添加回收率降低，如抗蚜威和去乙基另丁津等農(nóng)藥僅在基質(zhì)成分相對簡單的延胡索中回收率較低 (分別為58%和69%)，而在另外2 種基質(zhì)中回收率在102%～108%之間。定量限詳見表1。

參考《中國藥典》2020 年版四部[26]中33 種禁限用農(nóng)藥的限量標準規(guī)定范圍 (0.01～0.2 mg/kg)以及GB 2763—2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[27]中對藥用植物的最大殘留限量規(guī)定范圍 (0.01～20 mg/kg)，本方法建立的LOQ 值可滿足3 種含生物堿類中藥材中農(nóng)藥殘留限量標準的要求。

2.4 實際樣品測定

采用本方法對藥材種植基地收集及藥店購買的33 批延胡索、7 批黃連以及5 批黃柏樣品進行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：農(nóng)藥總檢出率為64.4%，共檢出29 種農(nóng)藥，檢出率較高的農(nóng)藥為多效唑、吡蟲啉、敵敵畏、啶酰菌胺和苯醚甲環(huán)唑等。40.0%的樣品同時檢出2～8 種農(nóng)藥，其中1 批延胡索檢出11 種農(nóng)藥，提示3 種含生物堿類中藥材中存在多農(nóng)藥殘留污染的風險。多效唑在11 批延胡索樣品中被檢出，檢出量最高達0.11 mg/kg，參照 GB 2763—2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[27]大豆中多效唑的限量要求 (0.05 mg/kg) 進行評判，1 批樣品超過限量規(guī)定，提示延胡索存在使用植物生長延緩劑的安全風險；4 批延胡索樣品檢出吡蟲啉，參照GB 2763—2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[27]貝母 (干) 的限量要求 (0.2 mg/kg)，1 批樣品超過限量規(guī)定；1 批黃柏和2 批黃連中檢出敵敵畏，參照GB 2763—2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[27]調(diào)味料的限量要求 (0.1 mg/kg)，1 批黃連超過限量規(guī)定；在部分樣品中檢出克百威、毒死蜱等高毒禁限用農(nóng)藥，提示亟需進一步加強中藥材種植中農(nóng)藥的使用管理規(guī)范。表2 僅列出樣品檢出超過0.05 mg/kg 的測定結(jié)果。

表2 實際樣品測定結(jié)果Table 2 Determination results of pesticides in real samples

3 結(jié)論

本研究建立了一種基于UPLC-Q-Orbitrap HRMS 技術(shù)對3 種含生物堿類中藥材中193 種農(nóng)藥殘留的快速篩查方法。該方法前處理簡便快速、凈化效果好、可操作性強，并可在較短時間內(nèi)完成高通量的數(shù)據(jù)采集，檢測目標農(nóng)藥化合物靈敏且準確度高。該方法可實現(xiàn)含生物堿類中藥材中多農(nóng)藥殘留的日常風險監(jiān)測，也可為其他復雜中藥材基質(zhì)中農(nóng)藥殘留的定性定量分析提供研究思路。