延胡索酸對(duì)循環(huán)熱應(yīng)激肉雞生長(zhǎng)性能、抗氧化功能和免疫功能的影響

孫詩(shī)昂 李 冰 鄧亞飛 李 靜 熊永潔 賀紹君

(安徽科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，滁州 233100)

隨著全球氣候變暖，我國(guó)夏季溫度普遍超過32 ℃。肉雞飼養(yǎng)方式大多呈籠養(yǎng)或舍養(yǎng)，飼養(yǎng)密度較大，通風(fēng)不良；而肉雞體表幾乎沒有汗腺、體內(nèi)代謝快，這導(dǎo)致肉雞在飼養(yǎng)過程中會(huì)頻繁出現(xiàn)熱應(yīng)激[1-2]。熱應(yīng)激影響全球范圍內(nèi)家禽生產(chǎn)，并會(huì)對(duì)動(dòng)物福利和生產(chǎn)性能產(chǎn)生重大影響[3]。當(dāng)肉雞出現(xiàn)熱應(yīng)激時(shí)，其免疫功能降低，飼料轉(zhuǎn)化率降低，存活率急劇下降，生產(chǎn)效益降低[4]。在畜牧業(yè)生產(chǎn)過程中，采用營(yíng)養(yǎng)調(diào)控的方法，使畜禽養(yǎng)殖朝著綠色、高效、健康和可持續(xù)的方向發(fā)展是提升我國(guó)養(yǎng)殖生產(chǎn)水平的首要任務(wù)。將營(yíng)養(yǎng)調(diào)控技術(shù)在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用，在提高畜禽生長(zhǎng)速率同時(shí)也能極大降低畜牧生產(chǎn)中受到熱應(yīng)激帶來的損失[5]。

有機(jī)酸作為食品添加劑由來已久，常被用做調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)的酸堿平衡，控制體內(nèi)細(xì)菌數(shù)量，維持動(dòng)物體正常的生長(zhǎng)水平[6]。Mustafa等[7]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加有機(jī)酸可提升肉雞生長(zhǎng)性能和免疫能力。延胡索酸作為最常見的有機(jī)酸化劑，具有輔助改善動(dòng)物消化系統(tǒng)功能、減少因各種應(yīng)激反應(yīng)而造成動(dòng)物損傷等功效。延胡索酸在發(fā)生應(yīng)激時(shí)可迅速為機(jī)體供能，故其在家禽生產(chǎn)中可作為應(yīng)激保護(hù)劑使用[8]。除緊急供能外，延胡索酸還可作用于神經(jīng)系統(tǒng)，抑制神經(jīng)中樞以達(dá)到良好的鎮(zhèn)靜效果[9]，因此在飼糧中添加少量延胡索酸，可避免肉雞因興奮過高而產(chǎn)生熱喘息。He等[10]研究表明，延胡索酸對(duì)熱應(yīng)激肉雞肉品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)成分和生長(zhǎng)性能有顯著影響，但關(guān)于延胡索酸是否能緩解肉雞熱應(yīng)激狀態(tài)下的抗氧化和免疫功能，目前尚不清楚。因此，本試驗(yàn)旨在研究飼糧中添加延胡索酸對(duì)熱應(yīng)激肉雞生長(zhǎng)性能、抗氧化功能及免疫功能的影響，并分析其變化意義，為客觀評(píng)價(jià)延胡索酸對(duì)熱應(yīng)激的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

延胡索酸購(gòu)于河南某實(shí)業(yè)有限公司，純度>99%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選用240只1日齡愛拔益加(AA)肉仔雞(平均體重為45 g)，隨機(jī)分為5個(gè)組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12只雞(公母各占1/2)，飼喂于同一個(gè)籠子(90 cm×90 cm×38 cm)中。1～27日齡，所有試驗(yàn)肉雞飼喂相同的基礎(chǔ)飼糧，飼養(yǎng)環(huán)境和飼養(yǎng)管理等均保持一致。28日齡開始，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，環(huán)境溫度控制在(22±1) ℃，相對(duì)濕度控制在(60±5)%；試驗(yàn)組飼喂在基礎(chǔ)飼糧中分別添加0(熱應(yīng)激組)、0.5%、1.0%和2.0%延胡索酸的飼糧，并采用循環(huán)溫度控制，每天08:00開始升溫，09:00穩(wěn)定溫度在(33±1) ℃，每天22:00開始降溫，23:00穩(wěn)定溫度在(22±1) ℃，相對(duì)濕度與對(duì)照組一樣。試驗(yàn)期間，每天24 h光照，肉雞自由采食和飲水。肉雞飼養(yǎng)分為2個(gè)階段，分別為起始期(1～21日齡)和生長(zhǎng)期(22～42日齡)，共42 d，2個(gè)階段基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 樣品制備

分別于肉雞35和42日齡時(shí)，每重復(fù)隨機(jī)挑選2只肉雞(公母各1只)，靜脈采血5 mL離心，收集血清待用，并在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)肉雞稱重。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 生長(zhǎng)性能

分別于35和42日齡晨飼前對(duì)肉雞進(jìn)行空腹稱重并記錄，同時(shí)記錄每個(gè)重復(fù)肉雞采食量，并計(jì)算料重比。

1.4.2 血清抗氧化指標(biāo)

血清總抗氧化能力(T-AOC)和總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性以及總谷胱甘肽(T-GSH)、丙二醛(MDA)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、總羰基、過氧化氫、羥基自由基和8-羥基喹啉含量采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.3 血清免疫指標(biāo)

采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法測(cè)定血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)和新城疫(ND)抗體含量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 18.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差(one-way ANOVA)，并采用LSD法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 延胡索酸對(duì)循環(huán)熱應(yīng)激肉雞生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，與對(duì)照組相比，熱應(yīng)激組肉雞終末體重、體增重和平均日采食量顯著降低(P<0.05)，料重比顯著提高(P<0.05)；與熱應(yīng)激組相比，0.5%延胡索酸組肉雞終末體重和體增重顯著提高(P<0.05)，料重比顯著降低(P<0.05)。

表2 延胡索酸對(duì)循環(huán)熱應(yīng)激肉雞生長(zhǎng)性能的影響

2.2 延胡索酸對(duì)循環(huán)熱應(yīng)激肉雞血清抗氧化指標(biāo)的影響

2.2.1 延胡索酸對(duì)循環(huán)熱應(yīng)激肉雞血清T-AOC和T-SOD、GSH-Px活性以及MDA含量的影響

由表3可知，35日齡時(shí)，與對(duì)照組和熱應(yīng)激組相比，0.5%、1.0%和2.0%延胡索酸組肉雞血清T-AOC和GSH-Px顯著或極顯著提高(P<0.05或P<0.01)；熱應(yīng)激組血清T-SOD活性與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)，1.0%延胡索酸組血清T-SOD活性與熱應(yīng)激組相比顯著提高(P<0.05)；2.0%延胡索酸組血清GSH-Px活性極顯著高于0.5%和1.0%延胡索酸組(P<0.01)，分別提高了43.67%和31.61%；2.0%延胡索酸組血清MDA含量與熱應(yīng)激組相比顯著降低(P<0.05)。

42日齡時(shí)，與熱應(yīng)激組相比，1.0%延胡索酸組肉雞血清GSH-Px活性極顯著降低(P<0.01)，下降了23.75%；熱應(yīng)激組血清MDA含量與對(duì)照組相比顯著提高(P<0.05)，提高了138.10%；0.5%和1.0%延胡索酸組血清MDA含量與熱應(yīng)激組相比顯著降低(P<0.05)。

2.2.2 延胡索酸對(duì)循環(huán)熱應(yīng)激肉雞血清T-GSH、GSSG、過氧化氫、羥基自由基、總羰基和8-羥基喹啉含量的影響

由表4可知，35日齡時(shí)，與對(duì)照組相比，熱應(yīng)激組肉雞血清T-GSH和羥自由基含量顯著顯著(P<0.05)，分別降低了30.66%和3.50%；1.0%和2.0%延胡索酸組血清T-GSH含量顯著高于熱應(yīng)激組(P<0.05)；熱應(yīng)激組血清過氧化氫含量顯著高于對(duì)照組及1.0%和2.0%延胡索酸組(P<0.05)，1.0%和2.0%延胡索酸組血清過氧化氫含量與0.5%延胡索酸組相比分別降低了50.22%和68.16%，差異顯著(P<0.05)；熱應(yīng)激組血清8-羥基喹啉含量與對(duì)照組相比提高了28.81%，差異顯著(P<0.05)；2.0%延胡索酸組血清8-羥基喹啉含量與0.5%和1.0%延胡索酸組相比分別降低了14.83%和10.69%，差異顯著(P<0.05)。

42日齡時(shí)，熱應(yīng)激組肉雞血清T-GSH含量與對(duì)照組及1.0%和2.0%延胡索酸組相比均顯著降低(P<0.05)；0.5%延胡索酸組血清過氧化氫含量顯著低于熱應(yīng)激組及1.0%和2.0%延胡索酸組(P<0.05)。

表3 延胡索酸對(duì)循環(huán)熱應(yīng)激肉雞血清T-AOC和T-SOD、GSH-Px活性以及MDA含量的影響

表4 延胡索酸對(duì)循環(huán)熱應(yīng)激肉雞血清T-GSH、GSSG、過氧化氫、羥基自由基、總羰基和8-羥基喹啉含量的影響

續(xù)表4項(xiàng)目 Items對(duì)照組 Control group熱應(yīng)激組 Heat stress group0.5%延胡索酸組0.5% fumaric acid group1.0%延胡索酸組1.0% fumaric acid group2.0%延胡索酸組2.0% fumaric acid group42日齡 42 days of age總谷胱甘肽 T-GSH/(μmol/L)24.11±6.62a15.73±2.86b16.70±5.86ab17.88±1.95a18.98±1.96a氧化型谷胱甘肽 GSSG/(μmol/L)1.85±0.372.50±1.031.44±0.621.94±0.282.22±1.14過氧化氫 H2O2/(mmol/L)64.36±3.81a66.14±12.14a42.53±12.54b50.27±19.90a64.36±3.81a羥基自由基 ·OH/(U/mL)100.37±1.33100.57±0.30100.54±1.06100.67±0.77101.01±0.26總羰基 Total carbonyl/(mg/mL)0.515±0.0780.690±0.1460.594±0.1260.577±0.0430.565±0.1118-羥基喹啉 8-hydroxyquinoline/(ng/L)9.72±1.26b11.87±1.66a10.94±1.86ab9.64±0.98b9.72±0.86b

2.3 延胡索酸對(duì)循環(huán)熱應(yīng)激肉雞血清免疫指標(biāo)的影響

由表5可知，35日齡時(shí)，與對(duì)照組相比，熱應(yīng)激組肉雞血清ND抗體、IgA、IgG和IgM含量顯著降低(P<0.05)；與熱應(yīng)激組相比，0.5%、1.0%和2.0%延胡索酸組血清ND抗體和IgA含量顯著提高(P<0.05)，1.0%和2.0%延胡索酸組血清IgG含量顯著提高(P<0.05)，2.0%延胡索酸組血清IgM含量顯著提高(P<0.05)。

42日齡時(shí)，與對(duì)照組相比，熱應(yīng)激組肉雞血清ND抗體、IgA、IgG和IgM含量顯著降低(P<0.05)；與熱應(yīng)激組相比，1.0%和2.0%延胡索酸組血清ND抗體和IgG含量顯著提高(P<0.05)，2.0%延胡索酸組血清IgA和IgM含量顯著提高(P<0.05)。

表5 延胡索酸對(duì)循環(huán)熱應(yīng)激肉雞血清免疫指標(biāo)的影響

3 討 論

3.1 延胡索酸對(duì)循環(huán)熱應(yīng)激肉雞生長(zhǎng)性能的影響

熱應(yīng)激導(dǎo)致家禽在高溫環(huán)境中生理機(jī)能發(fā)生紊亂。肉雞料重比是評(píng)價(jià)肉雞飼養(yǎng)利潤(rùn)的一個(gè)重要指標(biāo)，料重比越低，飼養(yǎng)利潤(rùn)越大。鐘光等[11]研究表明，肉雞在熱應(yīng)激時(shí)料重比增高。此外，家禽由于全身覆蓋羽毛且缺乏汗腺導(dǎo)致散熱困難，當(dāng)環(huán)境溫度超出最適溫度后，能量物質(zhì)為了維持體溫消耗，會(huì)使得轉(zhuǎn)化成肌肉和脂肪的原料減少，導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降[12]，這與本試驗(yàn)結(jié)果相吻合。本試驗(yàn)中，在飼喂添加延胡索酸飼糧的組別中，肉雞的體增重明顯高于熱應(yīng)激組，且料重比降低，說明延胡索酸對(duì)肉雞熱應(yīng)激有一定緩解作用，從而可維持其生長(zhǎng)性能，因此養(yǎng)殖戶在夏季高溫時(shí)可以選擇帶有延胡索酸添加劑的飼糧以提升飼養(yǎng)效益。

3.2 延胡索酸對(duì)循環(huán)熱應(yīng)激肉雞抗氧化功能的影響

T-AOC可反映機(jī)體內(nèi)總體的氧化應(yīng)激水平[13]。Hu等[14]研究表明，高溫環(huán)境中肉雞空腸T-AOC會(huì)顯著降低。本試驗(yàn)中，肉雞在持續(xù)循環(huán)高溫環(huán)境下血清T-AOC無顯著變化，可能是熱應(yīng)激溫度較低，持續(xù)時(shí)間略短，機(jī)體內(nèi)自由基數(shù)量雖增加但仍在機(jī)體清除能力范圍之內(nèi)。同時(shí)，飼糧中添加一定劑量的延胡索酸，可增強(qiáng)肉雞在持續(xù)循環(huán)高溫環(huán)境下血清T-AOC，表明延胡索酸在一定劑量?jī)?nèi)可以加強(qiáng)機(jī)體的抗氧化功能，降低高溫環(huán)境對(duì)肉雞的危害，其中延胡索酸的添加量在1.0%～2.0%較為適宜。

T-SOD和GSH-Px是機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)的重要成員[15]。T-SOD可使體內(nèi)產(chǎn)生的有害自由基歧化，避免積蓄過多對(duì)機(jī)體造成危害。Rimoldi等[16]研究表明，高溫不會(huì)影響肉雞肝臟超氧化物歧化酶(SOD)表達(dá)。本試驗(yàn)中，肉雞在持續(xù)循環(huán)高溫環(huán)境下血清T-SOD活性顯著降低，與上述研究不一樣，可能是肉雞在受到熱應(yīng)激時(shí)，機(jī)體內(nèi)自由基的動(dòng)態(tài)平衡失衡，有害自由基大量增加，超出T-SOD的清除能力，T-SOD被大量消耗，活性下降；但飼糧添加適量延胡索酸可以顯著提高肉雞血清T-SOD活性。GSH-Px主要存在于生物體的線粒體和細(xì)胞液里，可以反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化狀態(tài)[17]。廖一驍?shù)萚18]研究表明，GSH-Px可減少機(jī)體內(nèi)蛋氨酸轉(zhuǎn)化半胱氨酸的量，對(duì)刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體有著較為重要的作用。Wen等[19]研究表明，熱應(yīng)激狀態(tài)下肉雞肝臟GSH-Px活性下降，加入甜菜堿之后其活性回升。本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，熱應(yīng)激組肉雞血清GSH-Px活性下降明顯，與上述結(jié)果一致。這說明持續(xù)循環(huán)熱應(yīng)激會(huì)降低血清內(nèi)抗氧化酶的活性，降低機(jī)體抗氧化能力。此外，本試驗(yàn)中，35日齡時(shí)，隨著飼糧中延胡索酸添加劑量的提高，肉雞血清GSH-Px活性極顯著提高；42日齡時(shí)，隨著飼糧中延胡索酸添加劑量的提高，肉雞血清GSH-Px活性先升后降，然后再升高。這可能是長(zhǎng)時(shí)間的熱應(yīng)激使機(jī)體對(duì)某一劑量延胡索酸不敏感。

血清中的氧化還原物質(zhì)主要有T-GSH、GSSG、羥基自由基和過氧化氫等，GSH-Px通過利用2個(gè)T-GSH分子中的2個(gè)氫來清除過氧化氫，從而將T-GSH氧化為GSSG，T-GSH具有極其明顯的抗氧化作用，過氧化氫和GSSG含量可反映機(jī)體過氧化程度。李葉涵等[20]研究表明，肉雞在熱應(yīng)激條件下過氧化氫和MDA含量均明顯上升，本試驗(yàn)結(jié)果也是如此；在飼糧中添加延胡索酸可使肉雞血清過氧化氫含量降低，T-GSH含量提高，這可能是由于延胡索酸可以提高血清GSH-Px活性，使體內(nèi)過氧化氫含量減少，且劑量越高效果越明顯。羥基自由基對(duì)機(jī)體危害較大，本試驗(yàn)中，延胡索酸對(duì)降低機(jī)體內(nèi)的羥基自由基含量并無顯著影響，具體緣由還需進(jìn)一步進(jìn)行深入的研究。

MDA可體現(xiàn)機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度[21]。Chen等[22]研究表明，高溫環(huán)境會(huì)使機(jī)體MDA含量上升，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。氧化應(yīng)激與體內(nèi)自由基增加有關(guān)，產(chǎn)生和清除自由基之間的凈結(jié)果決定了血清中MDA的含量。本試驗(yàn)中，飼糧添加延胡索酸改善了肉雞血清氧化狀態(tài)，但其在不同劑量下對(duì)血清抗氧化能力的作用并不呈正相關(guān)，表明延胡索酸對(duì)肉雞抗氧化狀態(tài)的有益作用在一定范圍內(nèi)。

羰基含量主要反映蛋白質(zhì)功能是否正常。鐘光等[11]研究表明，循環(huán)熱應(yīng)激可讓肉雞機(jī)體內(nèi)羰基含量顯著升高，進(jìn)而減弱肉雞體內(nèi)抗氧化酶的活性。本試驗(yàn)中，肉雞在持續(xù)循環(huán)高溫環(huán)境影響下，體內(nèi)總羰基含量增加，表明機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)功能下降明顯。而延胡索酸對(duì)此并無明顯作用，可能是延胡索酸并沒有參與到蛋白質(zhì)作用機(jī)理中。8-羥基喹啉是核酸被氧化產(chǎn)生損傷的標(biāo)志性物質(zhì)。本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，肉雞在持續(xù)循環(huán)的高溫環(huán)境下血清8-羥基喹啉含量會(huì)出現(xiàn)提高，從而對(duì)機(jī)體造成不可恢復(fù)的影響；而飼糧加入適量延胡索酸后，血清8-羥基喹啉含量顯著下降，且延胡索酸添加量在1.0%較為適宜。

3.3 延胡索酸對(duì)循環(huán)熱應(yīng)激肉雞免疫功能的影響

血清中ND抗體含量是反映ND疫苗免疫后雞特異性免疫反應(yīng)功能的指標(biāo)。Gouda等[23]研究表明，熱應(yīng)激會(huì)顯著降低肉雞血清中ND抗體含量，在飼糧中增加膳食補(bǔ)充劑抗壞血酸和葉酸后，血清ND抗體含量升高，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致，1.0%和2.0%延胡索酸組肉雞血清ND含量較熱應(yīng)激組顯著提高，表明飼糧中添加延胡索酸可提高熱應(yīng)激下肉雞對(duì)ND病毒的免疫能力，且隨著添加劑量的不斷提升而逐漸減小了與對(duì)照組的差異，即1.0%和2.0%延胡索酸添加水平下效果較好。肉雞在7日齡時(shí)接種ND疫苗，機(jī)體產(chǎn)生抗原免疫產(chǎn)生ND抗體，隨著時(shí)間推移，體內(nèi)抗體水平下降，延胡索酸的添加可能激活了肉雞體內(nèi)的免疫系統(tǒng)，促進(jìn)體內(nèi)抗體的分泌，提高了ND抗體水平，從而提高其機(jī)體的免疫功能。

IgA、IgG和IgM是機(jī)體內(nèi)免疫系統(tǒng)的3種免疫球蛋白，試驗(yàn)中常將免疫球蛋白含量作為判斷動(dòng)物體免疫功能的重要指標(biāo)之一。Roushdy等[24]研究表明，熱應(yīng)激會(huì)降低肉雞血清免疫球蛋白含量，這與本試驗(yàn)熱應(yīng)激組結(jié)果一致，可能是熱應(yīng)激降低了采食量，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足，從而使機(jī)體免疫球蛋白含量降低。不過，有研究指出，飼糧添加延胡索酸只提高夏季幼兔抗氧化能力[25]，對(duì)免疫功能提升不明顯，這與本試驗(yàn)結(jié)果不一致，可能是幼兔的試驗(yàn)環(huán)境為非熱應(yīng)激或是幼兔和肉雞生理機(jī)能存在差異，對(duì)延胡索酸的利用率差異較大。張秀文等[26]研究表明，在飼糧中添加1%延胡索酸能有效提升仔豬的免疫水平。本試驗(yàn)中，35日齡時(shí)，延胡索酸組肉雞血清免疫球蛋白含量顯著高于熱應(yīng)激組，且42日齡時(shí)雖然差異不顯著但仍高于熱應(yīng)激組，可能是延胡索酸使機(jī)體避免或減輕了熱應(yīng)激對(duì)免疫器官造成的損傷，提升了免疫器官合成免疫球蛋白的速率，導(dǎo)致機(jī)體免疫力提高。此外，在飼糧中添加不同劑量的延胡索酸對(duì)肉雞免疫功能的提升效果不同，提升效果為1.0%延胡索酸組>2.0%延胡索酸組>0.5%延胡索酸組，可能是飼糧添加1.0%延胡索酸對(duì)機(jī)體免疫功能的提升已經(jīng)達(dá)到了閾值。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)條件下，熱應(yīng)激導(dǎo)致肉雞生長(zhǎng)性能降低，抗氧化功能和免疫功能減弱；飼糧添加延胡索酸可以提高熱應(yīng)激肉雞體增重、血清抗氧化和免疫指標(biāo)，降低料重比。因此，延胡索酸可以作為添加劑來減輕熱應(yīng)激對(duì)肉雞的負(fù)面影響，且添加量以1.0%為佳。