向日葵副產(chǎn)物微貯復(fù)合發(fā)酵條件的響應(yīng)曲面優(yōu)化分析

李 肖 陳永成 許平珠 張凡凡* 馬春暉*

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832000；2.新疆蓿之花草源生態(tài)有限公司，哈巴河 836700)

隨著畜牧業(yè)高速發(fā)展，為緩解人畜爭(zhēng)糧問題，新型動(dòng)物飼料資源的開發(fā)利用勢(shì)在必行。向日葵(Helianthusannuus)為菊科向日葵屬的一年生經(jīng)濟(jì)類作物，具有抗旱和耐寒的特性，且產(chǎn)量不受緯度、海拔高度和光照周期等的影響[1]，世界范圍內(nèi)均有廣泛種植，在我國(guó)主要分布在西北、華北和東北地區(qū)。目前，新疆地區(qū)向日葵種植面積達(dá)到140萬～150萬畝(1畝≈667 m2)[2]，每年產(chǎn)生大量的葵桿和葵盤等向日葵副產(chǎn)物，此類資源多被粉碎還田或直接焚燒，極大地危害了生態(tài)環(huán)境[3]。如將這些資源加以利用，能夠在一定程度上緩解新疆局部地區(qū)飼草短缺壓力，為該地區(qū)畜牧業(yè)穩(wěn)定發(fā)展開發(fā)新的飼草資源。

向日葵副產(chǎn)物不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，且具有藥用價(jià)值，若合理利用可作為反芻動(dòng)物的能量和蛋白質(zhì)飼料[4]。目前主要通過添加外源添加劑[5-7]或采用混貯的方式[7-9]，以提高向日葵副產(chǎn)物的利用效率，其中添加外源添加劑是最為經(jīng)濟(jì)的方式。研究發(fā)現(xiàn)，添加發(fā)酵劑可改善青貯過程中微生物的發(fā)酵效率，促進(jìn)植物細(xì)胞壁的降解，從而改善青貯發(fā)酵品質(zhì)并提高適口性[10]。其中，在類似的秸稈發(fā)酵(玉米秸稈、香蕉莖、小麥秸稈等)中添加纖維素酶類制劑，可將植物細(xì)胞壁降解為可溶性碳水化合物(WSC)，并使細(xì)胞內(nèi)容物充分釋放，促進(jìn)發(fā)酵[11-12]；在青貯玉米和紫花苜蓿青貯中添加尿素均能夠增加青貯飼料的粗蛋白質(zhì)(CP)含量，也可作為乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)生長(zhǎng)繁殖的氮源促進(jìn)乳酸(lactic acid，LA)發(fā)酵[13-14]；添加糖蜜能為乳酸菌發(fā)酵提供底物，產(chǎn)生的LA能抑制青貯中有害微生物的生長(zhǎng)和減少發(fā)酵體系營(yíng)養(yǎng)損失[15]；也有研究表明，在向日葵青貯中添加糖蜜可以顯著降低青貯中纖維的含量[16]。但是，目前針對(duì)向日葵副產(chǎn)物發(fā)酵劑的配方及劑量尚未形成明確定論。

響應(yīng)曲面優(yōu)化法(response surface methodology，RSM)通過建立連續(xù)變量曲面模型，評(píng)價(jià)影響生物過程的因子及其交互作用，確定最優(yōu)工藝參數(shù)，是目前解決生產(chǎn)實(shí)際問題并降低開發(fā)成本最為有效的方法之一[17]。鑒于此，本試驗(yàn)擬采用響應(yīng)曲面優(yōu)化法探究糖蜜、纖維素酶、尿素和乳酸菌4種發(fā)酵劑復(fù)合發(fā)酵的最優(yōu)添加量，為向日葵副產(chǎn)物的高效發(fā)酵提供理論基礎(chǔ)，并為當(dāng)?shù)刭Y源的有效利用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用向日葵副產(chǎn)物(包括葵桿、葵頭、葵葉)采自新疆蓿之花草源生態(tài)有限公司哈巴河縣試驗(yàn)基地(坐標(biāo)：48°4′50.77″ N，86°23′58.77″E；海拔530 m)，其中葵桿、葵頭和葵葉分別占總重的61.3%、21.4%和17.4%[干物質(zhì)(DM)基礎(chǔ)]，將收獲后的原料短切至1～2 cm備用。尿素購(gòu)自烏魯木齊石化分公司(總氮含量≥46%)；糖蜜購(gòu)自中糧屯河糖業(yè)股份有限公司昌吉糖業(yè)分公司，總糖(蔗糖和還原糖)含量≥45%；纖維素酶購(gòu)自龐博生物公司，酶活性為10 000 U/g，主要成分為纖維素酶和葡萄糖；乳酸菌采用產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的植物乳桿菌ACCC11016(LactobacillusplantarumACCC11016)，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(Agricultural Culture Collection of China，ACCC)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采取響應(yīng)曲面優(yōu)化法。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[11-15,18-19]，初步確定各添加劑的添加量[鮮重(FM)基礎(chǔ)]，乳酸菌添加量分別為1×105、5×105和1×106CFU/g，纖維素酶添加量分別為0.05%、0.10%、0.15%，糖蜜添加量分別為2%、3%、4%，尿素添加量分別為0.1%、0.3%、0.5%，所選擇的添加量范圍能夠涵蓋各添加劑的最優(yōu)添加量，進(jìn)行響應(yīng)曲面優(yōu)化分析可進(jìn)一步得到復(fù)合條件的添加量。

將乳酸菌復(fù)壯后采用MRS液體培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)股份有限公司)擴(kuò)繁至目標(biāo)劑量；然后進(jìn)行響應(yīng)曲面優(yōu)化，設(shè)計(jì)方法為框貝肯設(shè)計(jì)(box-Behnken design，BBD)，本試驗(yàn)中以LA和中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)含量為響應(yīng)值，自變量分別為乳酸菌(A)、糖蜜(B)、尿素(C)和纖維素分解酶(D)添加量，每個(gè)自變量的3個(gè)試驗(yàn)水平(低、中、高)編碼分別為-1、0、1(表1)。微貯采用真空袋法調(diào)制(真空帶規(guī)格為40 cm×50 cm)，每袋定量填裝1 kg，將4種發(fā)酵劑按照BBD設(shè)計(jì)的處理進(jìn)行添加(依照原料基礎(chǔ)含水量，將4種添加劑配制至純凈水中，最終使得所有處理發(fā)酵體系含水量為72%)，共29個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，填裝后立刻采用抽真空機(jī)進(jìn)行密封，共計(jì)87個(gè)樣品。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境(23～28 ℃)發(fā)酵30 d，30 d后開袋分析LA和NDF含量。在相同環(huán)境下，向日葵副產(chǎn)物不添加任何發(fā)酵劑，進(jìn)行發(fā)酵前后發(fā)酵品質(zhì)分析，共2個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

表1 試驗(yàn)因素與編碼水平

1.3 指標(biāo)測(cè)定及方法

營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)測(cè)定：向日葵副產(chǎn)物原料自然發(fā)酵前后(不做任何處理，僅用蒸餾水調(diào)配發(fā)酵體系含水量至72%)，分別稱200 g于65 ℃烘箱中烘干至恒重，粉碎后過40目篩并保存?zhèn)溆?。樣品中的DM含量采用冷凍干燥法檢測(cè)(DHG-9620A鼓風(fēng)干燥機(jī)，上海合恒儀器設(shè)備有限公司)，NDF、酸性洗滌纖維(ADF)含量采用范式洗滌纖維法測(cè)定(自制纖維袋，專利號(hào)：ZL201621382211.7和ZL201621382214.0)，CP含量采用凱氏定氮法測(cè)定(Kjeltec 8400 FOSS全自動(dòng)凱氏定氮儀，美國(guó)福斯公司)，WSC含量采用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定(722可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司)，粗脂肪(EE)含量采用石油醚浸提法測(cè)定(玻璃索氏提取器，上海壘固有限公司)，粗灰分(Ash)含量采用550 ℃灼燒法測(cè)定(XL-3000型高效節(jié)能智能一體馬弗爐，上海合恒儀器設(shè)備有限公司)[20]。

開袋后分別將各處理向日葵副產(chǎn)物青貯飼料混勻，準(zhǔn)確稱取20 g放入250 mL三角瓶中，并加入180 mL蒸餾水后封口，放入4 ℃冰箱浸提24 h后用4層紗布過濾，再用0.45 μm濾膜過濾，LA含量采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定[21]，色譜條件為：Waters Atlantis C18；流動(dòng)相20 mm磷酸二氫鈉(pH為2.7)；流速0.7 mL/min；紫外波長(zhǎng)210 nm，柱溫30 ℃，樣前過膜，測(cè)時(shí)間為45 min，壓力138 bar；進(jìn)樣20 μL；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)214 nm。同時(shí)測(cè)定各處理NDF含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理和統(tǒng)計(jì)。不添加發(fā)酵劑發(fā)酵前后所有指標(biāo)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，差異性比較采用Duncan氏多重比較法。Design Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面優(yōu)化分析，擬合的二次多項(xiàng)式模型為：

式中：Y為預(yù)測(cè)響應(yīng)值(標(biāo)注為R)，即LA和NDF含量的預(yù)測(cè)值；xi和xj為自變量的編碼值；n為因子數(shù)(n=4)；c0為常數(shù)項(xiàng)；ai為線性系數(shù)；bij為二次項(xiàng)系數(shù)。

采用BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)二次多項(xiàng)式模型中各試驗(yàn)進(jìn)行回歸擬合，并得到擬合后的回歸方程，然后運(yùn)用軟件中自帶功能，選取2個(gè)預(yù)測(cè)值R1(NDF含量)最小，R2(LA含量)最大，以此得到最優(yōu)的各水平編碼值，最終計(jì)算求得各個(gè)變量的最優(yōu)組合[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 向日葵副產(chǎn)物發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵指標(biāo)比較

由表2可知，與發(fā)酵前相比，發(fā)酵后向日葵副產(chǎn)物pH和DM、NDF和WSC含量顯著降低(P<0.05)，LA含量顯著提高(P<0.05)，而ADF、Ash、CP和EE含量差異不顯著(P>0.05)。

表2 向日葵副產(chǎn)物發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵指標(biāo)比較

2.2 模型建立及顯著性檢驗(yàn)分析

由表3可知，按照BBD設(shè)計(jì)得到的變量代碼進(jìn)行試驗(yàn)，NDF含量在代碼0(A)、0(B)、1(C)、-1(D)條件下，測(cè)得最大值(39.22%)；在代碼0(A)、0(B)、1(C)、1(D)條件下，測(cè)得最小值(27.72%)，總體平均值為33.78%，標(biāo)準(zhǔn)差(SD)為1.89，變異系數(shù)(CV)為5.58%。LA含量在代碼1(A)、1(B)、0(C)、0(D)條件下，測(cè)得最大值(9.34%)；在代碼0(A)、-1(B)、-1(C)、0(D)條件下，測(cè)得最小值(5.68%)，總體平均值為7.16%，SD為0.56，CV為7.88%。

表3 BBD設(shè)計(jì)及中性洗滌纖維和乳酸含量的實(shí)際值

通過Design Expert軟件，按照二次多項(xiàng)式模型對(duì)表2中R1、R2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到R1和R2對(duì)4個(gè)編碼自變量的二次多項(xiàng)回歸方程：R1=33.38-0.92A-2.43B-0.96C-3.08D-1.09AB-1.38AC+0.58AD+1.66BC+1.00BD-2.11CD+5.833E-004A2-0.57B2+3.15C2-1.60D2；R2=7.40+0.57A+0.48B+0.15C+0.029D+0.82AB+0.42AC+0.56AD-0.61BC+0.72BD-0.49CD+0.23A2+0.051B2-0.69C2+0.19D2。

表4 中性洗滌纖維和乳酸含量的回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗(yàn)

2.3 復(fù)合發(fā)酵條件NDF和LA含量的響應(yīng)曲面分析

通過對(duì)R1所繪制的響應(yīng)曲面圖及等高線圖可知(圖1)，對(duì)R1起主要作用的是因素D，在因素D和因素A、因素B和因素C的交互作用中，起主要作用的均為因素D。在因素B和因素A、因素C的交互作用中，對(duì)R1起主要作用的為因素B；而因素A和因素C的交互作用對(duì)R1的影響不顯著(P=0.167)。因素C和因素D的交互作用中，R1趨于最小(27.72%)?？傮w來看，僅因素C和因素D的交互作用對(duì)R1的影響顯著(P<0.05)，其余各因素之間的兩兩交互作用對(duì)R1的影響均不顯著(P>0.05)(表4)。

通過對(duì)R2所繪制的響應(yīng)曲面圖及等高線圖可知(圖2)，因素A和因素B的交互作用對(duì)R1的影響最大，因素A和因素B的代碼越接近于1，R2越趨于最大值(9.34%)。對(duì)R2起主要作用的是因素A，因素A和其他因素交互作用中也占主導(dǎo)作用。因素B和因素C、因素D的交互作用中起主要作用的為因素B，因素C和因素D的交互作用對(duì)R1的影響不顯著(P=0.106)。總體來看，除因素A和因素B、因素B和因素C、因素B和因素D的交互作用外，其余各因素之間的兩兩交互作用對(duì)R2的影響均不顯著(P>0.05)(表4)。

最終利用軟件求出R1為最小值，R2均為最大值的代碼解(最優(yōu)解)：A=0.950，B=0.810，C=0.000，D=0.790，將代碼解換算成實(shí)際自變量可得，乳酸菌添加量為9.5×105CFU/g，糖蜜添加量為3.81%，尿素添加量為0.3%，纖維素酶添加量為0.14%。將最優(yōu)解代入二次多項(xiàng)回歸方程進(jìn)行計(jì)算，得出R1=26.95(即NDF理論含量為26.95% DM)，其相比未添加發(fā)酵劑處理的NDF含量(36.13% DM)降低了9.18% DM(34.06%)；R2=10(即LA理論含量為10% FM)，其相比未添加發(fā)酵劑處理的LA含量(4.26% FM)提高了5.74% FM(134.74%)。

R1表示中性洗滌纖維含量；A為乳酸菌添加量代碼；B為糖蜜添加量代碼；C為尿素添加量代碼；D為纖維素酶添加量代碼。下圖同。

3 討 論

動(dòng)物飼糧中NDF含量能影響反芻動(dòng)物瘤胃正常發(fā)酵，在一定程度上能調(diào)節(jié)反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)[22]；LA含量則是反映青貯品質(zhì)的重要指標(biāo)，能使青貯中pH降低，進(jìn)而限制其有害微生物的生長(zhǎng)，減少發(fā)酵體系營(yíng)養(yǎng)損失，因此本研究主要選擇這2項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵條件的優(yōu)化。影響青貯品質(zhì)的指標(biāo)諸多，本研究之所以選擇較為主要的2項(xiàng)指標(biāo)，客觀原因是選取多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)曲面優(yōu)化，其操作性較差，且某些發(fā)酵指標(biāo)在發(fā)酵體系中不是嚴(yán)格按照高低水平判斷的，例如pH、乙酸含量、揮發(fā)性脂肪酸含量等。

3.1 發(fā)酵前后向日葵副產(chǎn)物青貯主要營(yíng)養(yǎng)成分

本研究中，向日葵副產(chǎn)物在青貯30 d后NDF、WSC和DM含量及pH顯著降低，LA含量顯著提高。在發(fā)酵前期，植物表面附著的纖維素分解菌及有害微生物的生長(zhǎng)繁殖促進(jìn)纖維了纖維類物質(zhì)的分解[23]，降低了WSC含量，并造成了發(fā)酵體系中的DM損失[16]，當(dāng)氧氣消耗完后，好氧微生物活動(dòng)得到抑制，乳酸菌開始迅速繁殖，產(chǎn)生了大量的LA，并使pH下降[24]。此外，發(fā)酵后形成的酸性環(huán)境也可能會(huì)造成纖維的酸解，使NDF和ADF含量下降[25-26]。

R2表示乳酸含量。

3.2 添加發(fā)酵劑對(duì)NDF含量的影響

3.3 添加發(fā)酵劑對(duì)LA含量的影響

本研究證實(shí)，在確定的4個(gè)發(fā)酵條件中，對(duì)青貯中LA含量影響最主要的因素為乳酸菌添加量，且糖蜜與乳酸菌添加量的交互作用對(duì)LA含量的影響也較為顯著。在青貯發(fā)酵過程中，添加乳酸菌在青貯前期增加了乳酸菌基數(shù)，添加糖蜜可作為乳酸菌發(fā)酵的底物，促進(jìn)LA發(fā)酵[16]，因此目前國(guó)內(nèi)外發(fā)酵劑的主要配方也均以乳酸菌為主。此外，大量研究發(fā)現(xiàn)青貯中LA含量與乳酸菌添加劑量成正比[18]，然而當(dāng)其添加量達(dá)到一定劑量時(shí)，對(duì)LA含量影響會(huì)逐漸降低[19]，這主要與乳酸菌屬的嗜酸能力及競(jìng)爭(zhēng)性作用有關(guān)。添加尿素對(duì)青貯中LA的含量影響不顯著，而尿素添加量與糖蜜添加量交作用對(duì)LA含量影響顯著，盡管添加尿素能抑制青貯中有害微生物(霉菌、酵母菌等)的活性，減少發(fā)酵體系中碳水化合物的損耗，但單獨(dú)添加尿素并不能有效促進(jìn)LA發(fā)酵，而尿素與糖蜜復(fù)合添加為青貯中乳酸菌發(fā)酵提供氮源與糖源，促進(jìn)乳酸菌產(chǎn)LA[30]。糖蜜和纖維素酶添加量的交互作用對(duì)青貯中LA含量影響顯著，主要因?yàn)槔w維素酶將纖維素降解為單糖，產(chǎn)生的單糖與糖蜜共同為青貯中的乳酸菌提供底物促進(jìn)LA的生成[31]。

以往對(duì)向日葵副產(chǎn)物青貯添加劑添加量?jī)?yōu)化的研究較少，本研究通過對(duì)向日葵副產(chǎn)物青貯中復(fù)合添加乳酸菌、尿素、糖蜜和纖維素酶的添加量進(jìn)行優(yōu)化，建立適宜的發(fā)酵條件，在后期實(shí)際生產(chǎn)中需進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究得到向日葵副產(chǎn)物的最佳發(fā)酵條件為：乳酸菌添加量為9.3×105CFU/g，糖蜜添加量為3.57%，尿素添加量為0.3%，纖維素酶添加量為0.14%。在此條件下厭氧發(fā)酵30 d，理論上可使NDF含量降低34.06%，LA含量提高134.74%。