仿生消化模擬雜粕在生長豬結(jié)腸消化程度的研究

杜中原 王鈺明 曾述禮 高理想 趙江濤 張 虎 趙 峰*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，云浮 527400)

在生長豬消化道各段中，結(jié)腸對飼糧可消化纖維的貢獻(xiàn)是回腸末端前消化道的1.86倍(以可消化中性洗滌纖維計(jì))，而盲腸因食糜停留時(shí)間短而對纖維消化的貢獻(xiàn)較少[1]。因此，準(zhǔn)確地模擬飼料原料在生長豬結(jié)腸段的消化對完善胃-小腸-大腸三階段仿生消化法測定豬飼料的有效能非常關(guān)鍵。從生長豬后腸的生理特性看，結(jié)腸重量約為盲腸的5.8倍[2]，雖然其微生物群體和盲腸相似[3-4]，但液相中總厭氧菌、淀粉分解菌數(shù)量高于盲腸[5]，且食糜中纖維素酶和木聚糖酶活性也高于盲腸[6]。上述生理特性導(dǎo)致了生長豬盲腸對飼糧能量消化率不超過2.2%，而結(jié)腸和直腸合計(jì)高達(dá)21.9%[7]。因此，對生長豬后腸消化的研究重點(diǎn)在結(jié)腸的消化。目前，營養(yǎng)學(xué)家對生長豬后腸的模擬消化主要采用酶水解法和發(fā)酵法?，F(xiàn)有方法主要存在模擬消化程度與體內(nèi)消化程度相差較大、變異較高等缺陷[8-11]。關(guān)鍵問題在于模擬大腸消化液及相應(yīng)的消化條件可能與生長豬大腸的消化環(huán)境尚存在一定差距。考慮到盲腸食糜比結(jié)腸食糜的固液比低，結(jié)腸消化的水解酶主要來自于食糜流經(jīng)小腸及盲腸微生物發(fā)酵后帶入。本試驗(yàn)嘗試在提取生長豬盲腸液水解酶的基礎(chǔ)上，根據(jù)主要水解酶的活性與盲腸液相應(yīng)水解酶一致的原則制備模擬大腸液，試圖縮小生長豬大腸模擬消化與體內(nèi)結(jié)腸消化的差異。由于雜粕類飼料原料含有較高的粗蛋白質(zhì)和粗纖維，且不同的雜粕在纖維含量及消化程度上差異大。因此，以雜粕為代表探討生長豬結(jié)腸的模擬消化與體內(nèi)消化程度的相似性，有利于闡明模擬消化的有效性。為此，本研究以菜籽粕、棉籽粕、葵花粕和花生粕為研究對象，首先探討不同雜粕類原料在生長豬結(jié)腸的消化程度，然后，比較結(jié)腸仿生消化與體內(nèi)結(jié)腸消化程度的差異，為建立更接近體內(nèi)消化的生長豬全消化道仿生消化方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及飼糧

選擇體重為(19.3±2.2) kg的杜×長×大三元雜交去勢公豬5頭，單籠飼養(yǎng)于代謝籠中。代謝籠含有低壓壓嘴式飲水器、食槽、全噴塑漏縫地板以及兩側(cè)可滑動(dòng)的亞歷克板。代謝室溫度保持在23～25 ℃。試驗(yàn)豬在代謝籠中適應(yīng)2周后，在試驗(yàn)豬盲腸末端安裝T型瘺管(專利號：ZL201520207381.0)，術(shù)后轉(zhuǎn)入代謝籠中護(hù)理2周，再適應(yīng)2周后開始試驗(yàn)。

選擇4種常用的雜粕類原料，分別為菜籽粕、棉籽粕、葵花粕和花生粕。配制5種試驗(yàn)飼糧，以玉米-豆粕型飼糧為基礎(chǔ)飼糧，然后將菜籽粕、棉籽粕、葵花粕和花生粕分別與基礎(chǔ)飼糧按18.75∶81.25的比例混合，配制成菜籽粕飼糧、棉籽粕飼糧、葵花粕飼糧和花生粕飼糧。所有試驗(yàn)飼糧中玉米與豆粕的比例一致，維生素和微量元素的含量滿足或超過NRC(2012)的推薦值。試驗(yàn)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集

體內(nèi)法測定生長豬結(jié)腸對飼糧的干物質(zhì)和能量消化率采用5×5拉丁方設(shè)計(jì)，即5頭初始體重為(39.4±2.9) kg安裝有盲腸末端T型瘺管的去勢公豬，5種試驗(yàn)飼糧，共進(jìn)行5期消化試驗(yàn)，每期每頭豬飼喂1種飼糧。每期試驗(yàn)包括7 d的預(yù)試期，第8～9天收集所有糞便，第10～11天、第13～14天每天09:00開始連續(xù)10 h收集盲腸食糜，且每次收集袋收集的食糜超過1/2體積后轉(zhuǎn)移至-20 ℃儲存。將每日內(nèi)每次收集的食糜取樣混勻后分裝在50 mL離心管中，儲存于-80 ℃冰箱中，用于水解酶活性測定。第10～11天收集的食糜離心后用于制備盲腸液凍干粉劑。第13～14天收集的盲腸食糜用于仿生消化法測定飼糧在結(jié)腸的干物質(zhì)和能量消化率。根據(jù)Urriola等[12]的公式計(jì)算4種雜粕在生長豬結(jié)腸前、全消化道、結(jié)腸的能量消化率和消化能。

仿生消化法測定生長豬結(jié)腸對飼糧干物質(zhì)和能量消化率采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，將5種飼糧對應(yīng)的盲腸末端食糜在仿生消化系統(tǒng)中進(jìn)行大(結(jié))腸階段模擬消化，設(shè)2個(gè)處理，分別為盲腸液凍干粉劑制備的模擬結(jié)腸液和模擬大腸液粉劑(來源：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所)制備的模擬結(jié)腸液。仿生消化法測定雜粕的結(jié)腸能量消化率采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，通過單胃動(dòng)物仿生消化系統(tǒng)分別進(jìn)行胃-小腸[胃-小腸結(jié)束之后加入1 mL氫氧化鈉(4 mol/L)進(jìn)行消化酶活性的滅活]、胃-小腸-大(結(jié))腸的模擬消化，測定4種雜粕的酶水解物能值(enzymatic hydrolysate gross energy,EHGE)和能量消化率，其中結(jié)腸消化所用消化液以模擬大腸液粉劑配制，具體上機(jī)操作參考《單胃動(dòng)物仿生消化系統(tǒng)操作手冊(第4版)》[13]。

1.3 樣品處理及化學(xué)分析

食糜樣品解凍后同一期內(nèi)同一頭豬的樣品混合。用于測定水解酶活性的盲腸液制備方法如下：食糜先進(jìn)行流水解凍，然后4 ℃下進(jìn)行低溫解凍，混合均勻后于4 ℃、7 000×g離心3 min，將上清液混合均勻后分裝于5 mL離心管中，-20 ℃保存待測酶活性。生長豬盲腸液、盲腸液凍干粉劑、模擬大腸液粉劑中淀粉酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、纖維素酶活性分別參考Dahlqvist[14]、Rick[15]、Rick[16]、NY/T 912—2004的方法測定。

盲腸液凍干粉劑的制備方法：生長豬盲腸食糜經(jīng)流水解凍后，同一期內(nèi)同一頭豬的樣品混合均勻后于4 ℃、3 000×g離心5 min，取上清液放置于凍干盤，-20 ℃冷凍后按照食糜凍干程序進(jìn)行凍干。將5期飼喂同一飼糧的生長豬盲腸液凍干粉劑合并作為大腸消化酶源，本試驗(yàn)共獲得5種盲腸液凍干粉劑。模擬大腸液粉劑來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，具體操作參考《單胃動(dòng)物仿生消化系統(tǒng)操作手冊(第4版)》[13]。

食糜樣品-20 ℃冷凍12 h后，按照如下凍干程序進(jìn)行凍干：-50 ℃，2 h；-30 ℃，1 h；-10 ℃，1 h；0 ℃，1 h；5 ℃，1 h；10 ℃，1 h；15 ℃，1 h；20 ℃，1 h；25 ℃，1 h；30 ℃，1 h；35 ℃，10～30 h。凍干后將食糜樣品放入10號自封袋中，-20 ℃儲存?zhèn)溆?。盲腸末端食糜用做仿生消化底物的制備方法：5期飼喂同一飼糧的生長豬盲腸末端食糜，按照2 d內(nèi)收集的盲腸末端食糜的重量等比例進(jìn)行混合，最終得到的混合食糜為底物(混合重量約200 g)。

參考GB/T 6435—2006的方法測定樣品的水分含量。參考ISO9831∶1998的方法，使用氧彈熱量計(jì)(型號：Parr-6400)測定樣品的總能。飼糧、食糜及糞便中三氧化二鉻含量參考GB/T 5009.123—2014測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用SAS 9.4的MEANS模塊對基本統(tǒng)計(jì)量進(jìn)行分析，并使用“四分位法”剔除異常值[17]。采用GLM模塊對不同飼糧在生長豬結(jié)腸前、結(jié)腸、全消化道干物質(zhì)和能量消化率及消化能的差異進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，采用GLM模塊對仿生消化法與體內(nèi)法測定的飼糧在生長豬結(jié)腸的干物質(zhì)和能量消化率及能值的差異進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，采用T-TSET模塊對雜粕的仿生消化法和體內(nèi)法測定值進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種試驗(yàn)飼糧在生長豬結(jié)腸前、全消化道、結(jié)腸的干物質(zhì)和能量消化率及消化能的差異

由表2可知，基礎(chǔ)飼糧在生長豬結(jié)腸前、全消化道的干物質(zhì)、能量消化率及消化能均顯著高于其余4種飼糧(P<0.05)。菜籽粕飼糧和棉籽粕飼糧在結(jié)腸前的干物質(zhì)和能量消化率及消化能相對接近(P>0.05)，且二者與葵花粕飼糧、花生粕飼糧無顯著差異(P>0.05)?？ㄆ娠暭Z在結(jié)腸前的干物質(zhì)和能量消化率及消化能顯著低于花生粕飼糧(P<0.05)。棉籽粕飼糧在全消化道的干物質(zhì)和能量消化率及消化能與葵花粕飼糧無顯著差異(P>0.05)，但顯著低于菜籽粕飼糧和花生粕飼糧(P<0.05)。菜籽粕飼糧在全消化道的干物質(zhì)和能量消化率及消化能與葵花粕飼糧無顯著差異(P>0.05)，但干物質(zhì)和能量消化率顯著低于花生粕飼糧(P<0.05)，而消化能與花生粕飼糧無顯著差異(P>0.05)。5種飼糧在生長豬結(jié)腸的干物質(zhì)和能量消化率及消化能均沒有顯著差異(P>0.05)。5種飼糧在生長豬結(jié)腸前和結(jié)腸的干物質(zhì)消化率分別占全消化道干物質(zhì)消化率的81.46%～85.41%和14.59%～18.54%；能量消化率分別占全消化道能量消化率的82.93%～86.40%和13.60%～17.07%。

表2 5種試驗(yàn)飼糧在生長豬結(jié)腸前、全消化道、結(jié)腸的干物質(zhì)和能量消化率及消化能

2.2 4種雜粕在生長豬結(jié)腸前、全消化道、結(jié)腸的能量消化率和消化能的差異

由表3可知，花生粕在生長豬全消化道的能量消化率和消化能顯著高于菜籽粕、棉籽粕和葵花粕(P<0.05)。4種雜粕在生長豬結(jié)腸前和結(jié)腸的能量消化率和消化能均無顯著差異(P>0.05)。4種雜粕在生長豬結(jié)腸前和結(jié)腸的能量消化率分別占全消化道能量消化率的64.05%～74.74%和25.26%～35.95%。

表3 4種雜粕在生長豬結(jié)腸前、全消化道、結(jié)腸的能量消化率和消化能

2.3 仿生消化法和體內(nèi)法測定的5種試驗(yàn)飼糧在生長豬結(jié)腸的干物質(zhì)和能量消化率的差異

由表4可知，仿生消化法1、2測定的5種試驗(yàn)飼糧在生長豬結(jié)腸的干物質(zhì)消化率與體內(nèi)法均無顯著差異(P>0.05)。仿生消化法1、2測定的基礎(chǔ)飼糧、菜籽粕飼糧、棉籽粕飼糧和花生粕飼糧在生長豬結(jié)腸的能量消化率及能值(仿生消化法1、2測定所得能值為EHGE，體內(nèi)法測定所得能值為消化能)與體內(nèi)法測定值無顯著差異(P>0.05)。仿生消化法1測定的葵花粕飼糧在生長豬結(jié)腸的能量消化率和能值與體內(nèi)法無顯著差異(P>0.05)。而仿生消化法2測定的葵花粕飼糧在生長豬結(jié)腸的能量消化率和能值顯著高于仿生消化法1和體內(nèi)法(P<0.05)。

表4 仿生消化法和體內(nèi)法測定的5種試驗(yàn)飼糧在生長豬結(jié)腸的干物質(zhì)和能量消化率及能值

續(xù)表4項(xiàng)目 Items基礎(chǔ)飼糧Basal diet菜籽粕飼糧Rapeseed meal diet棉籽粕飼糧Cottonseed meal diet葵花粕飼糧Sunflower meal diet花生粕飼糧Peanut meal diet P值 P-value0.600.480.060.090.72能值 Energetic value/(MJ/kg DM)仿生消化法1 Simulated digestion method 12)2.102.492.532.66b2.52仿生消化法2 Simulated digestion method 23)2.232.622.553.05a2.88體內(nèi)法 In vivo method2.202.432.142.62b2.37SEM0.210.280.280.150.42P值 P-value0.580.550.09<0.010.19能量消化率 Energy digestibility/%仿生消化法1 Simulated digestion method 12)11.5813.5713.7914.56b13.91仿生消化法2 Simulated digestion method 23)12.3314.3013.8916.69a15.86體內(nèi)法 In vivo method12.1113.2511.6514.31b13.05SEM1.161.491.520.812.33P值 P-value0.590.540.09<0.010.19

2.4 仿生消化法2和體內(nèi)法測定的4種雜粕在生長豬結(jié)腸的能值和能量消化率的差異

由表5可知，仿生消化法2測定的菜籽粕、棉籽粕、花生粕在生長豬結(jié)腸的能量消化率及能值(仿生消化法2測定所得能值為EHGE，體內(nèi)法測定所得能值為消化能)與體內(nèi)法無顯著差異(P>0.05)，但仿生消化法2測定的葵花粕在生長豬結(jié)腸的能量消化率顯著低于體內(nèi)法(P<0.05)。

表5 仿生消化法2和體內(nèi)法測定的4種雜粕在生長豬結(jié)腸的能值和能量消化率

3 討 論

雜粕類原料作為一種高蛋白質(zhì)、較高纖維含量的原料在生長豬不同消化位點(diǎn)的消化程度各不相同。我們前期測定的4種雜粕在生長豬回腸末端的能量消化率與本試驗(yàn)測定的4種雜粕在結(jié)腸前的能量消化率差異不大，這表明，在后腸消化中主要為結(jié)腸消化，這一現(xiàn)象和Jaworski等[7]的研究結(jié)果相似。本研究測定生長豬對菜籽粕的消化能為13.36 MJ/kg DM，高于Zhang等[18]的測定值，低于Liu等[19]的測定值。然而，本試驗(yàn)中菜籽粕在結(jié)腸前的消化率低于Woyengo等[11]和Pérez de Nanclares等[20]測定的回腸消化率，但本試驗(yàn)中菜籽粕在結(jié)腸的消化率相對較高。由此可見，菜籽粕的來源不同，在豬消化道各位點(diǎn)的消化程度也不同。Li等[21]研究表明，生長豬對棉籽粕的消化能與粗蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)。本試驗(yàn)中棉籽粕的粗蛋白質(zhì)含量為48.3%，消化能測定值為11.89 MJ/kg DM，與馬曉康[22]測定的棉籽粕(粗蛋白質(zhì)含量為49.1%)的消化能接近。劉君地[23]測得生長豬對10種葵花粕的消化能在10.51～12.46 MJ/kg DM，其與粗蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)，與纖維含量呈負(fù)相關(guān)。本研究測得的生長豬對葵花粕的消化能為12.36 MJ/kg DM，高于Li等[24]和Adeola等[25]的測定值，這可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)葵花粕粗蛋白質(zhì)含量較高，且中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量較低造成的。李青云[26]測得生長豬對12種花生粕的消化能在14.50～16.40 MJ/kg DM，其與粗蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)，與中性洗滌纖維含量呈負(fù)相相關(guān)。本試驗(yàn)測定生長豬對花生粕的消化能為15.09 MJ/kg DM，低于Li等[24]的測定值。本試驗(yàn)測定的4種雜粕在生長豬結(jié)腸的消化率雖然數(shù)值上差異較大，但無顯著差異，這一方面可能是不同飼糧在生長豬結(jié)腸的消化程度變異較大，另一方面可能是“套算法”會明顯放大飼糧消化能在結(jié)腸的變異。

當(dāng)前，對生長豬大腸消化酶的模擬多采用纖維素酶或碳水化合物復(fù)合酶[27-31]。孟麗輝[32]使用碳水化合物復(fù)合酶模擬生長豬后腸的消化，測得7種纖維飼糧的干物質(zhì)和能量消化率分別在0.4%～1.9%、0.1%～3.5%。然而，本研究發(fā)現(xiàn)生長豬盲腸液中即存在大量的碳水化合物酶，也存在活性較高的淀粉酶和胰蛋白酶、糜蛋白酶。本試驗(yàn)使用盲腸液凍干粉劑作為大腸消化酶時(shí)，仿生消化法測定的5種飼糧在生長豬結(jié)腸的干物質(zhì)和能量消化率同體內(nèi)法較為接近。由此表明，盲腸液來源的水解酶適合用于對結(jié)腸的模擬消化。而使用大腸消化酶粉劑作為大腸消化酶時(shí)，仿生消化法測定的葵花粕飼糧及葵花粕的能量消化率與體內(nèi)法存在顯著差異，但差值不大。這也表明水解酶的來源對結(jié)腸的模擬消化程度有一定影響。

Park等[33]使用碳水化合物酶和微生物酶模擬菜籽粕和棉籽粕在生長豬大腸的消化，所得干物質(zhì)消化率分別為13.7%、8.0%，其中菜籽粕與本試驗(yàn)結(jié)果(12.60%)相似，棉籽粕低于本研究結(jié)果(15.04%)。而Kong等[34]使用碳水化合物復(fù)合酶模擬菜籽粕和棉籽粕在生長豬大腸的消化，兩者的干物質(zhì)消化率(菜籽粕：3.7%；棉籽粕：4.1%)均低于本試驗(yàn)結(jié)果。這可能是由于本試驗(yàn)在模擬大(結(jié))腸消化酶時(shí)額外添加了蛋白酶。Ha等[35]在模擬生長豬大腸消化時(shí)，在碳水化合物酶的基礎(chǔ)上加入蛋白酶也進(jìn)一步提高了羽毛粉和椰子粕的干物質(zhì)消化率。然而，當(dāng)前酶法模擬雜粕在生長豬大腸的干物質(zhì)、能量消化率在數(shù)值上仍低于體內(nèi)的實(shí)測值。王亞[36]在豬仿生消化過程中發(fā)現(xiàn)，小腸階段存在消化酶失活的現(xiàn)象，通過補(bǔ)酶可準(zhǔn)確評定豬對谷實(shí)類飼料原料中蛋白質(zhì)及氨基酸的消化率。仿生消化過程中豬大(結(jié))腸消化時(shí)間設(shè)置為21 h，因此，大腸消化酶是否存在失活的現(xiàn)象以及這一現(xiàn)象是否是導(dǎo)致當(dāng)前評價(jià)雜粕類飼料原料的結(jié)腸消化率偏低的原因也有待進(jìn)一步的研究。此外，Hernandez-Hernandez等[37]研究也指出，體外模擬人類對碳水化合物的消化需要考慮除淀粉酶和微生物酶之外的酶。因此，需要進(jìn)一步探討除碳水化合物酶和蛋白酶之外是否存在其他制約性消化酶影響生長豬大(結(jié))腸消化。

4 結(jié) 論

① 菜籽粕、棉籽粕、葵花粕和花生粕在生長豬結(jié)腸的能量消化率分別為17.63%、15.55%、22.77%和22.02%。

② 仿生消化法1(結(jié)腸消化酶來源于盲腸液凍干粉劑)模擬生長豬結(jié)腸對菜籽粕、棉籽粕、葵花粕和花生粕的消化程度與體內(nèi)法無顯著差異，但仿生消化法2(結(jié)腸消化酶來源于模擬大腸液粉劑)模擬生長豬結(jié)腸對葵花粕的消化程度與體內(nèi)法存在顯著差異。這表明仿生消化法模擬生長豬結(jié)腸對雜粕的消化程度與體內(nèi)消化程度的差異受模擬消化液水解酶來源的影響。