液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測水發(fā)產(chǎn)品中氨基脲

◎ 白亞敏，陳世奇，唐韻熙，江 生，蘭玉坤

（1.重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401121；2.國家市場監(jiān)管重點實驗室（調味品監(jiān)管技術），重慶 401121）

氨基脲是呋喃西林在動物體內的代謝物，同時也是甲殼類水產(chǎn)品中的內源性物質及發(fā)泡劑偶氮二甲酰胺的高溫分解產(chǎn)物[1-4]。大量研究結果表明，氨基脲對實驗動物的生殖系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)有多效性影響和改變，具有致畸性、致突變性和致癌性。氨基脲可通過食物鏈進入人體，影響人體健康，造成嚴重后果。因此，歐盟、美國、加拿大和日本等國家和組織均將呋喃西林列為動物食品中的禁用藥物[5]。我國農業(yè)農村部發(fā)布的《食品動物禁用獸藥及其他化合物清單》也規(guī)定動物性食品中不得檢出呋喃西林[6]。

毛肚、鴨腸、黃喉等水發(fā)食品在我國西南地區(qū)深受消費者喜愛，是火鍋食品中消費量較大的幾個品種，但其中檢出氨基脲的事件時有發(fā)生。部分養(yǎng)殖戶反映，動物食品養(yǎng)殖過程中并未使用呋喃西林藥物，氨基脲還可能來源于水發(fā)產(chǎn)品的加工過程[7-8]。次氯酸鹽廣泛用于水發(fā)產(chǎn)品衛(wèi)生處理和消毒，使用含次氯酸鹽的消毒液處理毛肚等水發(fā)產(chǎn)品后，富含蛋白質的水發(fā)產(chǎn)品會分解出游離的氨基酸，部分氨基酸自身能分解產(chǎn)生氨基脲；氨基酸經(jīng)次氯酸鹽處理后易水解成脲基并游離出氨，氨與次氯酸鹽可生成氯胺，氯胺與尿素反應生成氨基脲；氯胺與氨還能作用生成聯(lián)氨，同時帶酰胺基團物質與次氯酸鹽作用能生成異氰酸鹽，聯(lián)胺與異氰酸鹽反應也能產(chǎn)生氨基脲[9]。

近年來，氨基脲的檢測方法多運用于動物食品，對生產(chǎn)加工中導致的污染關注較少，本文通過建立水發(fā)產(chǎn)品中氨基脲的高效液相色譜串聯(lián)質譜（High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）檢測方法，為監(jiān)控并掌握水發(fā)產(chǎn)品養(yǎng)殖及加工過程中氨基脲污染情況，保障食品質量安全提供了分析方法和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

1290超高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；AB5500三重四極桿質譜儀（美國AB SCIEX公司）；ML-886漩渦混合器（海門市其林貝爾公司）；TD16-WS型臺式高速離心機（長沙湘儀公司）；Millipore超純水儀（美國密理博公司）。

1.2 材料與試劑

毛肚、鴨腸及黃喉樣品購于重慶超市及農貿市場；氨基脲標準品（德國Dr. Ehrenstorfer公司，純度：99.80%，批號：G151417）；氨基脲-13C-15N2標準品（WITEGA公司，純度：99.9%，批號：31223603）；水為經(jīng)處理過的超純水；鄰硝基苯甲醛（日本TGI公司，含量：＞99%）；二甲基亞砜（Sigma公司，純 度：≥99.5%）；乙腈、甲酸為色譜純；乙酸銨、乙酸乙酯、正己烷和磷酸氫二鉀均為分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity BEH C18（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm）；流 動 相：A 乙 腈（含0.1%甲 酸）， B 10 mmol·L-1乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）；梯度洗脫程序：0～0.6 min，15%A，0.6～3.0 min，15%→85%A，3.0～4.5 min，85%A，4.5～4.6 min， 85%→15%A，4.6～6.1 min，15%A；流速：0.3 mL·min-1，柱溫：40 ℃，進樣體積：2 μL。

1.3.2 質譜條件

電噴霧離子源（ESI）：正離子模式；噴霧電壓：5 000 V；離子源溫度：550 ℃；氣簾氣：270 kPa；GAS1：380 kPa，GAS2：380 kPa；質譜參數(shù)見表1。標準溶液和樣品的質量色譜圖見圖1、圖2。

表1 氨基脲衍生物和同位素內標衍生物的質譜參數(shù)表

圖1 標準溶液質量色譜圖

圖2 樣品質量色譜圖

1.3.3 溶液的制備

（1）標準溶液的制備。精密稱取氨基脲約10 mg，置入100 mL容量瓶，乙腈定容，搖勻，制成100 μg·mL-1的氨基脲標準儲備溶液。準確移取200 μL氨基脲儲備溶液于100 mL容量瓶中，乙腈定容，搖勻，制成 200 ng·mL-1的氨基脲標準工作溶液。

（2）內標溶液的制備。精密稱取氨基脲-13C-15N2標準品約10 mg，置入100 mL容量瓶，乙腈定容，搖勻，配制成100 μg·mL-1的氨基脲內標儲備溶液。準確移取100 μL氨基脲內標儲備溶液于100 mL容量瓶中，乙腈定容，搖勻，制成100 ng·mL-1的氨基脲內標溶液。

（3）供試品溶液的制備。將毛肚、鴨腸及黃喉樣品分別均質制樣備用。稱取2.0 g（精確至0.01 g）樣品置于50 mL離心管中，分別用10 mL水洗滌兩次，加入100 μL氨基脲內標溶液，渦旋混合50 s，再加入1 moL·L-1鹽酸溶液20 mL和0.3 mL鄰硝基苯甲醛衍生溶液，振蕩渦旋1 min，37 ℃條件下置于恒溫水浴中避光振蕩反應。16 h后取出樣品，冷卻至室溫，用1.0 moL·L-1磷酸氫二鉀溶液調節(jié)pH至7.0～7.5，再加入5 mL乙酸乙酯，振蕩渦旋2 min，移取上清液至離心管中，殘留液中再加入5 mL乙酸乙酯，振蕩渦旋后取上清液，合并上清液，40 ℃氮吹近干。準確加入1.0 mL水和2 mL正己烷，振蕩渦旋溶解殘余物， 6 000 r·min-1離心8 min，取下層清液過0.22 μm濾膜，待HPLC-MS/MS檢測。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

毛肚等水發(fā)產(chǎn)品中通常含有偏磷酸鹽、焦磷酸鹽等磷酸鹽類保水劑，樣品溶解于水后會形成一種緩沖鹽體系，影響樣品溶液的pH值調節(jié)，因此先將樣品用水洗滌兩次以除去其中的部分磷酸鹽，但仍有部分磷酸鹽不能完全去除。動物源性樣品通常用0.2 moL·L-1的鹽酸調節(jié)樣品溶液的pH值，在酸性環(huán)境中水解蛋白質，提取其中呈結合態(tài)的氨基脲，用0.2 moL·L-1的鹽酸調節(jié)水發(fā)產(chǎn)品樣品溶液時，pH值并無太大變化。因此，將鹽酸溶液的濃度調整為1 moL·L-1， 可使樣品溶液的pH值調節(jié)至0～0.5，實驗結果表明，使用1 moL·L-1鹽酸能達到水解需要的酸性環(huán)境，檢測結果較好。

2.2 色譜條件及質譜條件的優(yōu)化

氨基脲分子量較小，用鄰硝基苯甲醛與氨基脲進行衍生反應，將待測物分子量增加至209，可大幅提升檢測靈敏度。氨基脲衍生物為氨基脲縮對醛基苯甲酸，呈弱堿性，適用于正離子監(jiān)測模式。流動相采用含0.1%甲酸的乙腈-乙酸銨溶液進行梯度洗脫，甲酸和乙酸銨有助于形成待測物分子離子，提高離子化效率，增強質譜的靈敏度，同時還可改善質量色譜圖峰形。由于大多數(shù)色譜柱不耐受強酸，流動相選擇0.1%甲酸濃度。流動相中的離子也會抑制待測物在離子源內形成分子離子，降低氨基脲衍生物的響應，因此只采用10 mmoL·L-1乙酸銨濃度。

采用50 ng·mL-1的氨基脲衍生物進行母離子掃描，確定質荷比209.2的氨基脲衍生物分子離子，再進行子離子全掃描，選出響應強度最高的兩個子離子m/z192.1和m/z166.2，其中m/z166.2作為定量離子。最后以多反應監(jiān)測模式對碰撞電壓和去簇電壓進行參數(shù)優(yōu)化，優(yōu)化結果見表1。

2.3 方法學考察

2.3.1 檢出限及線性關系

為減少樣品基質對質譜靈敏度的影響，選用與樣品相同基質的陰性樣品提取液作為溶劑，準確配制氨基脲衍生物系列標準溶液。分別稱取不同基質陰性樣品6份，每份約2.0 g，分別置于50 mL離心管中，均加入適量1 moL·L-1鹽酸溶液，渦旋30 s后，分別加入氨基脲標準工作溶液5 μL、10 μL、20 μL、 50 μL、100 μL和200 μL，添加濃度分別為0.5 μg·kg-1、 1.0 μg·kg-1、2.0 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1和20.0 μg·kg-1，再加入氨基脲內標工作溶液100 μL（即內標含量為5.0 μg·kg-1），渦旋混合50 s，余下操作同1.3.2。以氨基脲衍生物的定量離子對的峰面積對濃度作圖，繪制標準曲線，經(jīng)實際加標確定方法檢出限，結果見表2。

表2 線性關系、回歸方程和檢出限表

2.3.2 回收率

均質后的毛肚、鴨腸、黃喉陰性樣品，分別稱取18份，高、中、低3個濃度各6份，添加不同濃度的氨基脲標準溶液，按上述方法處理樣品并測定，進行回收率試驗，3種基質氨基脲的回收率為73.9%～88.0%，RSD為3.2%～8.6%，見表3。

表3 水發(fā)產(chǎn)品中氨基脲的回收率表

2.4 樣品測定

利用本文建立的方法，對市場上100余批毛肚、鴨腸和黃喉等水發(fā)產(chǎn)品進行了測定。其中有13批為陽性樣品，氨基脲檢出含量為2.35～18.41 μg·kg-1。

3 結論

本文利用液相色譜-串聯(lián)質譜技術建立了快速、準確的水發(fā)食品中氨基脲的檢測方法，其準確度和重復性均滿足痕量分析的需求。毛肚等水發(fā)食品中的氨基脲殘留不僅是養(yǎng)殖過程中使用了呋喃西林，還與生產(chǎn)加工過程中使用的次氯酸鹽消毒有關。水發(fā)產(chǎn)品生產(chǎn)企業(yè)需加強原料進貨查驗和生產(chǎn)過程控制，盡量減少氨基脲污染給人體健康帶來的安全隱患。