鮮毛肚和鹽漬毛肚膠原蛋白的結(jié)構(gòu)表征

趙鸞，夏楊毅, 2*，王立宇，吳佳

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400700)2(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400700)

牛胃包含瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃，瓣胃內(nèi)層的葉片被稱作毛肚，別稱牛百葉、百葉肚等[1-3]。在國外，由于毛肚的色值和黏結(jié)度的分值較低，一般不會用于重組肉產(chǎn)品原料。在國內(nèi)，毛肚作為火鍋菜品的主力軍，以其脆嫩化渣的口感和豐富充足的營養(yǎng)獲得了消費者的喜愛，消費地區(qū)也從川渝地區(qū)拓展到全國范圍，消費量與日俱增，發(fā)展?jié)摿薮骩4]。根據(jù)加工貯藏方式不同，毛肚可分為鮮毛肚、鹽漬毛肚、干制毛肚、凍干毛肚、漲發(fā)毛肚等。毛肚含有多種營養(yǎng)成分，其中蛋白質(zhì)含量占比約為14.5%，易被人體消化吸收[3]。目前關(guān)于毛肚的研究主要集中在嫩化保水[5]、漲發(fā)工藝優(yōu)化[2, 6-8]、保鮮[4, 9]、品質(zhì)控制[4, 10]等方面，但有關(guān)毛肚蛋白的研究寥寥無幾。

膠原蛋白是毛肚內(nèi)部最主要的蛋白成分。膠原蛋白具有由3個α多肽鏈構(gòu)成的右三螺旋結(jié)構(gòu)。毛肚膠原蛋白的特征主要由其內(nèi)部多肽鏈的周期性配置決定[11-12]。不同來源膠原的類型也不同，據(jù)報道，牛瘤胃平滑肌中有7種類型的膠原：I型、III型、IV型、V型、VI型、VIII型和XII型[13]。膠原蛋白的提取方式重點有酶法、酸法和堿法，都是依據(jù)原料膠原蛋白的性質(zhì)改變膠原蛋白所處的外部環(huán)境，將膠原蛋白與其他蛋白分離從而將膠原蛋白提取出來[13]。在實踐中，為了更有效地提取膠原蛋白，通常使用復合方法提取，例如，前人利用酸酶復合法提取了羊屠宰副產(chǎn)物[14]、耗牛瘤胃平滑肌[13]、烏鱧皮[15]、海參[16]等原料未變性的酶促溶性膠原蛋白。膠原蛋白結(jié)構(gòu)對毛肚的加工性能和品質(zhì)變化影響重大，因此研究毛肚膠原蛋白的結(jié)構(gòu)特點十分必要。但有關(guān)毛肚膠原蛋白方面的研究至今尚未見報道。鮮毛肚和鹽漬毛肚是制作漲發(fā)毛肚的主要原料，而鹽漬過程會導致蛋白變性，蛋白分子發(fā)生交聯(lián)，暴露疏水集團，蛋白不斷降解，故而2種毛肚的膠原結(jié)構(gòu)可能存在差異，在毛肚漲發(fā)過程中膠原的變化機理也不盡相同。故本研究以黃牛鮮毛肚和鹽漬毛肚為原料，提取酶促溶性膠原蛋白，并對毛肚的膠原蛋白結(jié)構(gòu)進行表征，以期為毛肚加工提供理論和科研依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：黃牛鮮毛肚、鹽漬毛肚購于重慶市南岸區(qū)水產(chǎn)批發(fā)市場，低溫保藏運輸至實驗室后立即處理。其中，鹽漬毛肚是由黃牛鮮毛肚經(jīng)干鹽鹽漬加工制成。

試劑：十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,簡稱SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；蛋白Marker(10～200 kDa)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；胃蛋白酶，范德生物科技有限公司；鹽酸、氯化鈉、檸檬酸、正丁醇(分析純)，重慶市鈦新化工有限公司；冰醋酸、氫氧化鈉(分析純)，重慶市躍翔化工有限公司；重蒸酚(分析純)，博美生物科技有限公司。

1.2 儀器和設備

FA2004分析天平，上海精密科學儀器有限公司；TGL-16醫(yī)用冷凍離心機，四川蜀科儀器有限公司；SYNERGYH1MG全波長酶標儀，美國基因公司；LGJ-10真空冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫攪拌水浴鍋，常州鴻澤實驗科技有限公司；UV-1900紫外分光光度儀，上海菁華科技儀器有限公司；L-8800全自動氨基酸分析儀，日本Hitachi公司；Spectrun l00紅外光譜儀，美國PerkinElmer公司；Bio-Rad基礎電泳儀，美國Bio-Rad公司；G-BOX EF凝膠成像系統(tǒng)，美國Syngene公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 毛肚膠原蛋白的提取

參考LI等[13]的做法，并略作修改。去除鮮毛肚和鹽漬毛肚的表面異物后清洗干凈。毛肚切碎后按照1∶10(g∶mL)的固液比添加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液，浸泡72 h除去色素和雜質(zhì)蛋白。用超純水洗至中性pH值。按照1∶10(g∶mL)的固液比添加10%的正丁醇溶液，浸泡48 h除去多余的脂肪。用超純水洗至中性pH值。按照1∶10(g∶mL)的固液比添加含有胃蛋白酶的0.1 mol/L醋酸溶液，胃蛋白酶的添加量為1%，攪拌72 h。將濾液收集起來，進行鹽析、離心、透析、真空冷凍干燥、封口包裝，并將樣品置于-20 ℃的冰箱中，供測定指標使用。以上所有操作均在低溫下進行。

1.3.2 SDS-PAGE分析

參考NAN等[17]的方法，并略作修改。配制2 mg/mL毛肚膠原蛋白溶液，按照4∶1(體積比)溶解于SDS-PAGE樣品緩沖液中，一組加入5%(體積分數(shù)) β-巰基乙醇，一組不加β-巰基乙醇。在100 ℃水浴中放置5 min后，用10%的分離膠和5%的濃縮膠對溶解后的膠原樣品進行分析。

1.3.3 紫外光譜分析

采用0.1 mol/L冰醋酸溶液溶解鮮毛肚與鹽漬毛肚的膠原蛋白，制備質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的鮮毛肚和鹽漬毛肚膠原蛋白溶液，掃描了鮮毛肚與鹽漬毛肚的膠原蛋白紫外吸收光譜(400～190 nm)。

1.3.4 氨基酸組成分析

參考LI等[16]的方法，并略作修改。分別稱取毛肚的膠原蛋白樣品約10 mg，并在110 ℃下水解22 h，檢測鮮毛肚與鹽漬毛肚的膠原蛋白氨基酸組成及含量占比。

1.3.5 熒光光譜分析

采用0.1 mol/L冰醋酸溶液溶解鮮毛肚與鹽漬毛肚的膠原蛋白，制備質(zhì)量濃度0.5 mg/mL的鮮毛肚和鹽漬毛肚膠原蛋白溶液，掃描了鮮毛肚與鹽漬毛肚的膠原蛋白熒光光譜(400～300 nm)。其中，激發(fā)波長設定為280 nm，縫隙寬度是5 nm[18]。

1.3.6 紅外光譜分析

參考NOORZAI等[19]的方法，略作修改。即采用傅里葉變換紅外光譜儀進行測定，取1 mg經(jīng)過冷凍干燥后的樣品，加入100 mg KBr于研缽中研磨均勻，在全波長400～4 000 cm-1下掃描。利用測試軟件對毛肚膠原蛋白的紅外光譜進行自動基線校正、平滑、標準化處理后，導出原數(shù)據(jù)。再利用Peakfit 4.12處理毛肚膠原蛋白酰胺I區(qū)(1 600～1 700 cm-1)，依次進行相關(guān)基線校正、Gaussian去卷積、二階導數(shù)擬合，分別匯總鮮毛肚和鹽漬毛肚的膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)組成在其二級結(jié)構(gòu)中的占比。

1.3.7 掃描電鏡分析

分別將凍干的毛肚膠原蛋白固定噴金，設置加速電壓為10 kV，使用掃描電鏡觀察鮮毛肚和鹽漬毛肚的膠原蛋白微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)由Microsoft Excel 2010和Origin 8.0分析和處理，每組數(shù)據(jù)設定3個平行，采用表示數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛肚膠原蛋白的SDS-PAGE圖譜分析

毛肚膠原蛋白的電泳圖譜如圖1所示。鮮毛肚和鹽漬毛肚的膠原蛋白主要包含α1鏈、α2鏈、β鏈，其中α鏈的亞基分子質(zhì)量約為115 kDa，與中華鱉裙邊膠原蛋白[20]、草魚魚鱗膠原蛋白[21]、水母[12]及豹紋翼甲鯰皮膚[22]等蛋白譜型保持一致，與I型膠原蛋白特征相符，表明毛肚的膠原蛋白主要是由I型膠原蛋白構(gòu)成的。相較于鮮毛肚，鹽漬毛肚的膠原蛋白具有相同的蛋白譜型，但其亞基條帶強度較弱。同時，對比添加β-巰基乙醇前后的膠原蛋白電泳條帶，發(fā)現(xiàn)并無雜帶，蛋白圖譜保持一致，說明毛肚的膠原蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)不含二硫鍵，且純度較高。

M-次高分子質(zhì)量標準蛋白Marker；1-鮮毛肚膠原 蛋白(未加β-巰基乙醇)；2-鹽漬毛肚膠原蛋白 (未加β-巰基乙醇)；3-鮮毛肚膠原蛋白(添加β-巰基 乙醇)；4-鹽漬毛肚膠原蛋白(添加β-巰基乙醇)圖1 毛肚膠原蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig.1 SDS-PAGE patterns of collagen of tripe

2.2 毛肚膠原蛋白的紫外光譜分析

毛肚膠原蛋白的紫外光譜如圖2所示，膠原多肽鏈含有羰基、羧基和酰胺基等官能團，在230 nm處產(chǎn)生明顯的吸收峰[16, 23]。由圖2可知，鮮毛肚0.5 mg/mL 膠原蛋白溶液的最大吸收波長是226 nm，而鹽漬毛肚0.5 mg/mL膠原蛋白溶液的最大吸收波長是228 nm，最大吸收波長發(fā)生紅移，紫外吸收峰強度增大，說明2種毛肚的膠原蛋白結(jié)構(gòu)存在一定差異，鹽漬過程可能改變了膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)，使其暴露出更多的發(fā)色基團。鮮毛肚和鹽漬毛肚的膠原蛋白在280 nm附近存在寬鈍的微弱吸收峰，表明毛肚的膠原蛋白內(nèi)部包含少量酪氨酸、苯丙氨酸等，與表1中氨基酸組成的分析結(jié)果一致[24]。

a-0.5 mg/mL鮮毛肚膠原蛋白；b-0.5 mg/mL 鹽漬毛肚膠原蛋白圖2 毛肚膠原蛋白的紫外光譜Fig.2 UV absorbance spectrum of collagen of tripe

2.3 毛肚膠原蛋白的氨基酸組成及含量分析

表1列出了鮮毛肚和鹽漬毛肚的膠原蛋白氨基酸組成及含量。通常而言，膠原蛋白的結(jié)構(gòu)內(nèi)每3個氨基酸序列中包含1個甘氨酸，其殘基對1 000個氨基酸總殘基占比約為1/3[16, 25]。鮮毛肚和鹽漬毛肚的膠原蛋白中Glu、Gly、Ala、Pro、Asp、Arg等氨基酸含量較高，而Tyr、Met、His、Cys、Phe等氨基酸質(zhì)量分數(shù)占比較低，符合膠原蛋白的一般特征。其中，Gly占比最高，前者Gly含量占質(zhì)量總分數(shù)的26.45%，測定結(jié)果與海蜇Gly含量25.99%[26]，魷魚皮Gly含量26.89%[27]，馬面魚皮Gly含量24.12%[28]相似。后者Gly含量明顯低于前者，但Phe、Tyr、Leu以及Asp等氨基酸含量高于前者，說明2種毛肚的膠原蛋白氨基酸組成存在一定差異。

表1 毛肚膠原蛋白的氨基酸組成及含量Table 1 Amino acid composion of collagen of tripe

2.4 毛肚膠原蛋白的熒光光譜分析

毛肚膠原蛋白的熒光光譜如圖3所示，能夠反映膠原蛋白的三級結(jié)構(gòu)變化情況。毛肚膠原蛋白含有少量的芳香族氨基酸，內(nèi)部含有的共軛雙鍵和苯環(huán)結(jié)構(gòu)在特定的激發(fā)波長內(nèi)可生成熒光，故可通過分析2種毛肚的膠原蛋白發(fā)射熒光光譜研究鮮毛肚和鹽漬毛肚的膠原蛋白變化情況[18]。由圖3可知，鮮毛肚0.5 mg/mL膠原蛋白溶液在336 nm處的熒光強度最強，鹽漬毛肚0.5 mg/mL膠原蛋白溶液在334 nm處的熒光強度最強。因此，與鮮毛肚相比，鹽漬毛肚膠原蛋白的熒光強度明顯降低，并由336 nm藍移至334 nm處，說明2種毛肚膠原蛋白結(jié)構(gòu)存在差異，鹽漬過程可能會導致芳香族氨基酸的微環(huán)境發(fā)生改變，膠原結(jié)構(gòu)不斷伸展，膠原蛋白發(fā)生變性聚集生成大膠原分子，致使能量傳遞減弱，故鹽漬毛肚膠原蛋白的熒光強度明顯降低。

a-0.5 mg/mL鮮毛肚膠原蛋白；b-0.5 mg/mL 鹽漬毛肚膠原蛋白圖3 毛肚膠原蛋白的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectrum of collagen of tripe

2.5 毛肚膠原蛋白的傅里葉紅外光譜分析

圖4為毛肚膠原蛋白的紅外光譜。酰胺化合物A、B、I、II和III區(qū)的吸收峰決定了膠原蛋白性質(zhì)的主要特征。已知酰胺類化合物A、B、I、II和III區(qū)的吸收峰通常出現(xiàn)在3 400 cm-1、3 000 cm-1、1 700～1 600 cm-1、1 600～1 500 cm-1以及1 300～1 200 cm-1處[29]。酰胺A區(qū)與N—H的伸縮振動相關(guān)，當N—H參與生成氫鍵時，吸收峰藍移，往往出現(xiàn)在3 300 cm-1處[14]。酰胺B區(qū)和—CH2的不對稱彈性振動有關(guān)[12]。酰胺I、II和III區(qū)的范圍能夠影響蛋白質(zhì)的形狀，酰胺I區(qū)與肽鏈內(nèi)羰基的拉伸振動相關(guān)，是研究蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的重要區(qū)帶[30]。酰胺II區(qū)與C—N拉伸耦合及N—H伸縮振動相關(guān)，酰胺III區(qū)反映了膠原蛋白特性，參與生成膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)[19]。從鮮毛肚中提取的膠原蛋白在3 339.00、2 923.70、1 659.55、1 552.25、1 238.34 cm-1處分別發(fā)現(xiàn)了酰胺類化合物A、B、I、II、III的吸收峰，從鹽漬毛肚中提取的膠原蛋白在3 330.50、2 923.36、1 657.71、1 546.06、1 237.42 cm-1處分別發(fā)現(xiàn)了酰胺類化合物A、B、I、II、III的吸收峰，與瘤胃平滑肌[13]、歐洲鰻魚[31]等膠原蛋白的吸收峰相似，證明所提取產(chǎn)物是膠原蛋白。

a-鮮毛肚膠原蛋白；b-鹽漬毛肚膠原蛋白圖4 毛肚膠原蛋白的紅外光譜Fig.4 FTIR spectrum of collagen of tripe

由表2可知，鮮毛肚中β-折疊、無規(guī)則卷曲、α-螺旋及β-轉(zhuǎn)角等部分含量占膠原蛋白總蛋白二級結(jié)構(gòu)的27.21%、24.39%、13.07%、35.32%，而鹽漬毛肚中β-折疊、無規(guī)則卷曲、α-螺旋及β-轉(zhuǎn)角等部分含量占膠原蛋白總蛋白二級結(jié)構(gòu)的24.86%、25.54%、13.90%、35.69%，這說明鮮毛肚和鹽漬毛肚的膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)存在差異，與鮮毛肚相比，鹽漬毛肚膠原蛋白內(nèi)部β-折疊的相對含量降低，而不規(guī)則卷曲、α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的相對含量增加，原因可能是鹽漬過程破壞了膠原蛋白和其他分子交互作用，導致膠原蛋白結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[32]。

表2 毛肚膠原蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成Table 2 Secondary structrure composition of collagen of tripe

2.6 毛肚膠原蛋白的微觀結(jié)構(gòu)分析

毛肚膠原蛋白的電鏡掃描圖像如圖5所示。鮮毛肚和鹽漬毛肚的膠原蛋白微觀結(jié)構(gòu)存在差異，與鮮毛肚相比，鹽漬毛肚的膠原蛋白折疊結(jié)構(gòu)減少，孔洞增加，破碎效果明顯，無序化程度加深，可能是因為鹽漬過程膠原結(jié)構(gòu)不斷伸展，部分膠原蛋白發(fā)生變性，破壞了膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)，膠原破碎成小分子結(jié)構(gòu)并開始聚集。

a-新鮮毛肚(×500)；b-新鮮毛肚(×2 000)； c-鹽漬毛肚(×500)；d-鹽漬毛肚(×2 000)圖5 毛肚膠原蛋白的掃描電鏡圖Fig.5 Scanning electron micrograph of collagen of tripe

3 結(jié)論與討論

研究以黃牛鮮毛肚和鹽漬毛肚為原料，提取酶促溶性膠原蛋白，對毛肚的膠原蛋白結(jié)構(gòu)進行表征。SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果顯示，毛肚的膠原蛋白含有3條條帶，分別是β鏈、α1鏈、α2鏈，無外源蛋白帶，純度較高，與I型膠原蛋白譜型相符。紫外光譜、傅里葉紅外光譜和熒光光譜表明，鮮毛肚和鹽漬毛肚的提取產(chǎn)物屬于膠原蛋白，不同的是，2種毛肚的膠原蛋白結(jié)構(gòu)存在差異，與鹽漬毛肚相比，鮮毛肚的膠原蛋白保留了更完整的三螺旋結(jié)構(gòu)。二級結(jié)構(gòu)擬算結(jié)果表明，毛肚的β-轉(zhuǎn)角相對含量占比最高，與鮮毛肚相比，鹽漬毛肚的β-折疊的相對含量降低，而不規(guī)則卷曲、α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的相對含量增加。掃描電鏡結(jié)果再次顯示2種毛肚膠原蛋白的結(jié)構(gòu)存在差異，鹽漬毛肚膠原蛋白折疊結(jié)構(gòu)減少，孔洞增加，破碎效果明顯，無序化程度加深。綜上所述，對鮮毛肚和鹽漬毛肚的膠原蛋白結(jié)構(gòu)進行表征，為毛肚加工提供理論和科研依據(jù)，可也為后續(xù)研究毛肚原料的加工條件、保藏方式對其膠原蛋白的影響提供參考依據(jù)。