HPLC法測定化妝品原料2-羥乙基脲及雜質(zhì)尿素的含量

蔣亞奇，李啟艷，林鈺鎵，李俊婕，高天陽，胡德福，于海英

(山東省食品藥品檢驗研究院，國家藥品監(jiān)督管理局化妝品原料質(zhì)量控制重點實驗室，山東 濟(jì)南 250101)

2-羥乙基脲，又名β-羥乙基脲、羥乙基脲，由乙醇胺和尿素反應(yīng)合成[1]，收錄于2014年公布的《已使用化妝品原料名稱目錄》中，常作為保濕劑添加到化妝品中[2-3]。目前，化妝品原料2-羥乙基脲并無統(tǒng)一規(guī)范的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，造成了市場上該原料在品質(zhì)、含量等方面參差不齊，而尿素作為原料2-羥乙基脲中的常見雜質(zhì)，其含量也會影響原料的品質(zhì)，為化妝品原料的安全性和功效性帶來風(fēng)險隱患，因此，亟須制定化妝品原料2-羥乙基脲的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并控制其雜質(zhì)尿素的含量。經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研，國內(nèi)外對2-羥乙基脲的研究報道較少，尿素的測定方法主要有滴定法[4-6]、紅外光譜法[7]、高效液相色譜(HPLC)法[8-10]，滴定法不適用同時測定2-羥乙基脲和尿素，紅外光譜法更側(cè)重于鑒別，現(xiàn)有的HPLC法中尚未見2-羥乙基脲和尿素同時測定方面的研究，鑒于此，本文采用HPLC法，建立了化妝品原料2-羥乙基脲及雜質(zhì)尿素的含量測定方法，以實現(xiàn)對化妝品原料2-羥乙基脲的質(zhì)量控制。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑 LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)；Sartorius CP225D電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；TU-1901紫外可見分光光度計(北京普析通用公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

2-羥乙基脲(純度99.5%，TCI公司)；尿素(純度98.5%，上海安譜實驗科技股份有限公司)；3批樣品由無限極(中國)有限公司提供，樣品編號為S1～S3(自編)。甲醇(HPLC級，美國Fisher Scientific公司)；乙腈(HPLC級，美國Honeywell公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Capcell PAK ADME C18，4.6 mm×250 mm，5 μm；柱溫：30 ℃；流動相：水，流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：194 nm。

1.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取2-羥乙基脲11.74 mg、尿素20.96 mg，置于同一10 mL容量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度，搖勻，作為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 樣品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取樣品約0.2 g于100 mL容量瓶中，加乙腈適量，超聲提取15 min，用乙腈定容至刻度，搖勻，精密吸取1.0 mL，置25 mL容量瓶中，加乙腈定容至刻度，搖勻。經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，取續(xù)濾液，作為樣品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇 本文考察了以水、甲醇、乙腈作為提取溶劑的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2-羥乙基脲和尿素均易溶于水、甲醇、乙腈，但尿素在水中易發(fā)生水解反應(yīng)，穩(wěn)定性較差，甲醇的截止波長較大，對測定易產(chǎn)生干擾，故選擇截止波長較小的乙腈為提取溶劑。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 最大吸收波長的選擇 用乙腈配制適當(dāng)濃度的2-羥乙基脲標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果見圖1，由圖1可知，2-羥乙基脲的最大吸收波長為194 nm，在此波長下，尿素也有較強(qiáng)的紫外吸收，因此確定為測定波長。

圖1 2-羥乙基脲的光譜掃描圖譜

2.2.2 色譜柱的選擇 2-羥乙基脲和尿素均為強(qiáng)極性化合物，在常用的C18色譜柱中不易保留，出峰時間很短，本文分別考察了可耐純水相的Agilent Zorbax Extend C18、Thermo Hypersil GOLD aQ C18和Capcell PAK ADME C18色譜柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2-羥乙基脲和尿素在Capcell PAK ADME C18柱上分離效果較好，該色譜柱鍵合了籠狀金剛烷基，對強(qiáng)極性化合物具有良好的保留和分離能力，因此選為實驗用色譜柱。

2.2.3 流動相的考察 本研究分別考察了以甲醇、乙腈、水及不同比例的甲醇-水、乙腈-水為流動相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動相中添加有機(jī)相會直接造成2-羥乙基脲和尿素的保留時間太小，無法有效分離，故選擇以水為流動相，增大了保留時間，實現(xiàn)了待測成分的良好分離。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品溶液和空白溶劑(乙腈)各10 μL，按“1.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果見圖2。由圖2可知，在主峰附近無干擾，該色譜條件滿足測定要求。

1.尿素；2.2-羥乙基脲圖2 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗結(jié)果

2.4 線性和范圍 分別精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用乙腈稀釋成標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按“1.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1，由表1可知，2-羥乙基脲和尿素在各自的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 線性和范圍

2.5 精密度試驗 精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，按“1.2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。計算2-羥乙基脲和尿素的峰面積RSD分別為0.7%、0.5%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在放置0、2、6、12、24、48 h分別進(jìn)樣10 μL，按“1.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算2-羥乙基脲和尿素的峰面積RSD分別為1.3%、0.8%，表明2-羥乙基脲和尿素在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗 平行稱取同一樣品6份，按“1.2.2”項下制備樣品溶液，按“1.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，計算樣品中2-羥乙基脲和尿素的含量和6份平行結(jié)果的RSD，結(jié)果見表2，由表2可知，方法重復(fù)性良好。

表2 重復(fù)性試驗結(jié)果表(n=6)

2.9 檢出限(LOD)和定量限(LOQ) 精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈稀釋適當(dāng)倍數(shù)，按“1.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，計算信噪比(S/N)，以S/N≈3的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度作為檢出限，以S/N≈10的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度作為定量限。試驗結(jié)果：2-羥乙基脲和尿素的檢出限分別為0.12 μg·mL-1和0.21 μg·mL-1定量限分別為0.36 μg·mL-1和0.52 μg·mL-1。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的同一樣品約0.1 g，共9份，分別置于100 mL容量瓶中，加入低、中、高3個水平的2-羥乙基脲和尿素標(biāo)準(zhǔn)品各3份，按“1.2.2”項下制備樣品溶液，按“1.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，計算回收率和RSD，結(jié)果見表3和表4。由表3可知，2-羥乙基脲的平均回收率為98.0%，RSD為1.6%，由表4可知，尿素的平均回收率為97.1%，RSD為1.5%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

表3 2-羥乙基脲回收率試驗結(jié)果表(n=9)

表4 尿素回收率試驗結(jié)果表(n=9)

2.10 樣品測定 取3批樣品，分別按“1.2.2”項下制備樣品溶液，按“1.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，以外標(biāo)法計算樣品中2-羥乙基脲和尿素的含量，結(jié)果見表5。

表5 樣品含量測定結(jié)果(n=3)

3 結(jié)論

本研究建立了化妝品原料2-羥乙基脲及雜質(zhì)尿素的HPLC含量測定方法，該方法準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，檢測靈敏度符合檢測要求，色譜條件穩(wěn)定，可作為化妝品原料2-羥乙基脲的含量測定方法，也可為該原料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考。目前，有關(guān)2-羥乙基脲的研究較少，隨著該原料在化妝品中的普遍應(yīng)用，應(yīng)加強(qiáng)2-羥乙基脲的原料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、毒理學(xué)等方面的研究，為消費(fèi)者安全使用提供保障。