氣相色譜法測定腌蘿卜中甜蜜素不確定度分析報告

羅慈婷

（1.廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 511442；2.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東廣州 511442；3.廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，廣東廣州 511442）

甜蜜素是一種化學(xué)甜味劑，主要用于提高食品的甜度，其效果和口感良好，被應(yīng)用于我國的食品加工業(yè)。常用的食品甜蜜素檢測方法有色譜法[1]。適量的甜味劑能夠賦予食品更舒適的味道，但過量添加會對人體健康造成不良影響。甜蜜素在體內(nèi)不參與機(jī)體代謝，大劑量攝入會導(dǎo)致腹瀉，造成胃腸道損傷，加重人體肝臟負(fù)擔(dān)，并具有潛在致癌性[2]。甜蜜素根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）的規(guī)定，腌漬的蔬菜其最大使用量為1.0 g/kg。按照《測量不確定度評定與表示》分析不確定度的因素并統(tǒng)計相關(guān)結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料

腌蘿卜，購自番禺區(qū)超市。

1.2 試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

甜蜜素（純度≥99.4%，Dr.Ehrenstorfer）、正庚烷、亞硝酸鈉、硫酸與氯化鈉。

1.3 儀器設(shè)備

氣相色譜儀；天平；離心機(jī)；超聲機(jī)；旋渦混合器。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 試劑配制

（1）環(huán)己基氨基磺酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液（5.0 mg/mL）的配制。稱取141.53 mg 標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容至25.0 mL，混勻[3]。

（2）標(biāo) 準(zhǔn) 使 用 液（1.0 mg/mL）的 配 制。移 取20.0 mL 己基氨基磺酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用水定容至100 mL[3]。移取1.00 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)使用液0.50 mL、1.00 mL、2.50 mL、5.00 mL、10.00 mL 以及25.00 mL于50 mL 容量瓶中，加水定容，配成標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20 mg/mL 和0.50 mg/mL。環(huán)己基氨基磺酸標(biāo)準(zhǔn)使用液臨用時配制以備衍生化用。準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液10.0 mL，按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定》（GB 5009.97—2016）第一法衍生化操作[3]。

1.4.2 測定方法

按GB 5009.97—2016 第 一 法， 用Agilent 7890B氣相色譜儀測定腌蘿卜中甜蜜素的含量，經(jīng)過水提取定容，取10 mL 樣液衍生化操作后，取上清液供氣相色譜測定[3]。

1.4.3 色譜條件

升溫程序：按GB 5009.97—2016 要求，初始溫度為55 ℃，以10 ℃/min 的速率升溫至95 ℃后保持0.5 min，再以30 ℃/min 升溫至200 ℃后保持3 min；進(jìn)樣口溫度：240 ℃；檢測器溫度：280 ℃；流速：5.0 mL/min；氫氣流量：40 mL/min；空氣流量：350 mL/min[3]。

1.4.4 數(shù)學(xué)模型

甜蜜素的數(shù)學(xué)模型為：

式中：X為甜蜜素含量，g/kg；C為甜蜜素的濃度，mg/mL；V3為正庚烷定容體積，mL；m樣為待測樣品的取樣量，g；V1為樣品處理后定容體積，mL；V2為萃取甜蜜素所取試樣液體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源分析

根據(jù)測定方法的主要步驟，不確定度主要來源于：①標(biāo)準(zhǔn)品；②天平使用過程；③定容及移取過程；④擬合曲線；⑤儀器及多次測量重復(fù)性等引入。具體見圖1。

圖1 甜蜜素不確定度來源

2.2 不確定度計算過程

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度

甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的提供商為Dr.Ehrenstorfer，該標(biāo)物證書純度99.12%，擴(kuò)展不確定度為4.48%，為正態(tài)分布，包含因子k=2，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=2.24%， 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.0226。

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲備液引入的不確定度。使用天平稱取甜蜜素141.53 mg 的標(biāo)準(zhǔn)品，用水定容至25 mL 容量瓶，查驗(yàn)其證書得知擴(kuò)展不確度U=0.04 mg（k=2），其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.02mg ，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.000142；查閱《常用玻璃量器》（JJG 196—2006），A 級25 mL容量瓶的容量允許差為±0.030 mL[4]，，則引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.0174mL ，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.000696；玻璃器皿使用過程中引起的不確定性用計算溫度范圍和體積膨脹系數(shù)來評估。玻璃器皿的體積膨脹明顯小于液體，因此只考慮溫度變化即可。水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4 ℃-1，由溫度起 伏 引 起 體 積 偏 差 為V×10 ℃×2.1×10-4℃-1，，此過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.00122；于是由儲備液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（2）標(biāo)準(zhǔn)使用液引入的不確定度。使用10 mL移液槍移取5.0 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲備液10 mL，用水定 容 至50 mL 容 量 瓶， 得1.000 mg/mL 標(biāo) 準(zhǔn) 中間 液。 按JJG 646—2006 規(guī) 定， 使 用1 ～10 mL移液槍時，其中10 mL 規(guī)格容量允許誤差為±0.6%[5]，，此過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.00347；在20 ℃校準(zhǔn)移液槍時， 溫 度 在（20±5） ℃起 伏， 此 過 程 引 起 的不確定度用該溫度范圍系數(shù)來評定，水的體 積 膨 脹 系 數(shù) 為2.1×10-4℃-1， 當(dāng) 溫 度 起 伏時 引 起 體 積 偏 差 為V×10 ℃×2.1×10-4℃-1，，此過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.00122；根據(jù)JJG 196—2006，容量瓶為A 級50 mL 的容量允許差為±0.05 mL[4]，，此過程引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.0289mL ，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.000578；在20 ℃校準(zhǔn)玻璃器皿，溫度在（20±5） ℃起伏。此過程引起的不確定度用溫度范圍和體積膨脹系數(shù)來評定。玻璃器皿的體積膨脹明顯小于液體，因此只考慮溫度變化即可。水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，由于溫度起伏引起體積偏差為V×10 ℃×2.1×10-4℃-1，，溫度變化引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(P2D)==0.00122；溶液稀釋配制過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（3）合成標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度。合成的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度由物質(zhì)純度、儲備液配制和中間液配制過程中引入，則合成標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2 樣品稱量

依據(jù)GB 5009.97—2016，使用天平稱取樣品5.00 g，該天平檢定證書給出的0～50 g（0～50 000e，e=10 d，d=1 mg）稱量范圍的允許誤差MPE=±0.5 mg，用5 g砝碼校正天平，由檢定證書給出的擴(kuò)展不確定度為Us=0.03 mg(k2=2)，用天平分別稱取腌蘿卜6 次，結(jié)果數(shù)據(jù)分別為5.002 4 g、5.002 1 g、5.002 4 g、5.002 3 g、5.002 3 g 和5.001 8 g，均值為5.002 2 g，方差S2=0.000 000 053 7。算得其合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3 前處理萃取和定容試液

（1）樣品處理后容量瓶定容體積引入的不確定度。用樣液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，加水定容。按JJG 196—2006 規(guī)定，（A 級）50 mL 容量瓶的容量允許差為±0.05 mL[4]，，此過程的引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.0289mL ，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.000578；在20 ℃校準(zhǔn)玻璃器皿，實(shí)驗(yàn)室的溫度在（20±5） ℃起伏。玻璃器皿的體積膨脹明顯小于液體，因此只考慮溫度變化即可。水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，由溫度起伏引起體積偏差為V1×10 ℃×2.1×10-4℃-1，，由溫度起伏引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

樣品合成處理后容量瓶定容體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（2）衍生化試液引入的不確定度。用10 mL 移液槍移取10 mL 上清液進(jìn)行衍生化。按JJG 646—2006規(guī)定，使用1 ～10 mL 移液器時，其中10 mL 規(guī)格檢定點(diǎn)的容量允許誤差為±0.6%[5]，，此過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.00347；在20 ℃校準(zhǔn)移液槍，溫度在（20±5） ℃起伏，此過程引起的不確定度可用溫度范圍系數(shù)來評定，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，由溫度起伏引起的體積偏差為V2×10 ℃×2.1×10-4℃-1，，由溫度起伏引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(V2B)==0.00122，合成甜蜜素衍生化所取試樣液體積引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（3）正庚烷試液引入的不確定度。用10 mL 移液器移取5 mL 正庚烷定容，按JJG 196—2006[4]規(guī)定，使用1 ～10 mL 移液器時，5 mL 規(guī)格檢定點(diǎn)的容量允許誤差為±0.6%，，此過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.00347。在20 ℃校準(zhǔn)移液槍，溫度在（20±5） ℃起伏。此過程的不確定度用溫度范圍和體積膨脹系數(shù)來評定。正庚烷的體積膨脹系數(shù)為1.24×10-3℃-1，由溫度起伏引起體積偏差為V3×10 ℃×1.24×10-3℃-1，，此過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(V2B)==0.00716；正庚烷定容體積引起的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（4）樣品前處理試液引入的不確定度。樣品前處理的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度由樣品處理后定容、甜蜜素衍生化所取試樣液、正庚烷定容體積引入，則合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.4 樣品濃度試液引入的不確定度利用校準(zhǔn)曲線來表示甜蜜素的濃度，配制6 個校準(zhǔn)溶液的濃度分別為0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20 mg/mL 和0.50 mg/mL。根據(jù)以上數(shù)據(jù)得到平均值為=0.1467mg/mL，每個點(diǎn)各測量3 次，峰面積和濃度測定結(jié)果見表1，根據(jù)表1 進(jìn)行線性回歸方程式擬合，結(jié)果見表2。

表1 峰面積和濃度測定結(jié)果

表2 檢出限和線性范圍結(jié)果

由最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線產(chǎn)生的確定度為：

式中：S為標(biāo)準(zhǔn)偏差；Aj為對應(yīng)峰面積；a為曲線截距；b為曲線斜率；cj為甜蜜素濃度點(diǎn)；n為測定次數(shù)；p為測定次數(shù)。

提取樣品溶液，濃度分別為0.304 0 mg/mL 和0.291 9 mg/mL，即平均值為c=0.298 mg/mL，最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求樣品濃度時產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.00544。

2.2.5 重復(fù)性引入的不確定度

（1）儀器重復(fù)性引入的不確定度。用混合均勻的同一個樣品連續(xù)進(jìn)樣6 次，得出甜蜜素的含量分別為2.88 g/kg、2.83 g/kg、2.85 g/kg、2.84 g/kg、2.89 g/kg和2.86 g/kg，均值為2.86 g/kg。測量的重復(fù)性以標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，此工程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確度為：

（2）其他因素引入的不確定度。影響檢測結(jié)果重復(fù)性的因素主要有人員操作、讀數(shù)差異、測量儀器的變動性和樣品不均勻等[5-6]。檢驗(yàn)員用相同的一臺儀器進(jìn)樣，對混勻的同一批次腌蘿卜進(jìn)行了6 次重復(fù)試驗(yàn)，甜蜜素含量分別為2.82 g/kg、2.90 g/kg、2.69 g/kg、2.78 g/kg、2.91 g/kg 和2.73 g/kg。 測量的重復(fù)性以標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，。本次測量2=0.0892g/kg個樣品，平均值為2.86 g/kg，本次測量的平均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.0631g/kg ，此過程的平均值的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

重復(fù)性測量引入的合成相對不確定度為：

2.2.6 合成相對標(biāo)準(zhǔn)

由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、樣品稱量、樣品萃取和定容、最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求樣品濃度以及重復(fù)性試驗(yàn)5個方面的操作引入的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.7 相對擴(kuò)展

置信概率為95%時，取包含因子k=2，則相對擴(kuò)展不確定度為Urel=k×ucrel(W)=2×0.033 8=6.8%。

樣品甜蜜素為2.86 g/kg,則其拓展不確定度U=2.86 g/kg×6.8%=0.19 g/kg。

3 結(jié)論

根據(jù)不確定度評估后，甜蜜素測定結(jié)果為2.86 g/kg，U=0.19 g/kg，k=2。由此得出，每個環(huán)節(jié)操作都對結(jié)果產(chǎn)生影響，所以應(yīng)避免檢驗(yàn)過程中人為造成的誤差，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度。