孫愛玲,劉 葉
(壹諾(天津)檢測服務(wù)有限公司,天津 300383)
脫氫乙酸,一種典型的防腐化學(xué)藥品,對霉菌及酵母菌具有很強的抑制作用,是我國食品防腐行業(yè)不可缺少的重要化學(xué)品之一。盡管脫氫乙酸毒性低,但是短時間內(nèi)過量服用還是有一定風(fēng)險,會對人們的中樞神經(jīng)和肝腎造成傷害,在嚴重的情況下甚至可能具有一定的致癌風(fēng)險[1]。所以,對脫氫乙酸的監(jiān)督管理和日常檢測也是至關(guān)重要的。我國《食品安全國家標(biāo)準 食品添加劑使用標(biāo)準》(GB 2760—2014)中對此進行了嚴格的規(guī)定,在熟肉制品中脫氫乙酸的使用量最大不可超過0.5 g/kg(以脫氫乙酸計)。對不確定度進行評估是衡量檢驗結(jié)果是否準確的重要指標(biāo),在很大程度上體現(xiàn)了測定結(jié)果的可信度以及實驗室的檢測水平[2]。本文主要以《食品安全國家標(biāo)準 食品中脫氫乙酸的測定》(GB 5009.121—2016)[3]為依據(jù),使用其中的第二種方法,對火腿中脫氫乙酸含量進行測試,并對結(jié)果進行不確定評估。通過對不確定度來源及影響因素的論述,為結(jié)果的準確性提供依據(jù),并為未來的相關(guān)研究提供參考。
高效液相色譜儀:安捷倫1260(紫外檢測器)。
脫 氫 乙 酸 標(biāo) 準 物:N-11578-1G,CHEM SERVICE;甲醇、乙酸銨:Fisher Chemical,色譜純;硫酸鋅、氫氧化鈉:分析純,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。
根據(jù)GB 5009.121—2016 中所涉及的第二種方法對進行樣品前處理。首先準確稱取均勻樣品2.5 g,將其加入50 mL 離心管。再加入5 mL 硫酸鋅(120 g/L)、10 mL H2O, 用20 g/L NaOH 調(diào)節(jié)溶液pH 值為7.5。然后,準備一個25 mL 的容量瓶,并將上述混合溶液轉(zhuǎn)移至其中。再加入溶劑至刻度完成定容后,將混合液在超聲波機中進行超聲10 min,以使其進一步均勻混合。然后,使用一次性吸管將該混合溶液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中,并且在其中加入10 mL 的正己烷,搖勻此溶液后將其靜置。靜置過后的溶液分為兩層,丟棄上層正己烷層,并且在分液漏斗中再次添加10 mL 的正己烷溶液,再一次重復(fù)上述操作以得到較好的效果。最后,取出下層的水相溶液,將其置于提前準備好的干凈的離心管中進行離心10 min。然后在0.45 μm 濾膜上過濾上清液,并將其放在一旁備用。
色譜柱:ODS-3 C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇-0.02 mol/L 乙酸銨(10 ∶90);流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;進樣量:10 μL;檢測波長:293 nm。
在燒杯中準確稱取0.05 g 脫氫乙酸標(biāo)準品,在此標(biāo)準品中加入5 mL NaOH(20 g/L)溶液,攪拌使其充分溶解,并將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶,加入適量的水將其進行定容后便可以得到后續(xù)實驗所需要的標(biāo)準儲備液,其濃度為1 000 μg/mL。然后,分別移取儲備液0.01 mL、0.10 mL、0.50 mL、1.00 mL 和2.00 mL 于10 mL 容量瓶,按照操作規(guī)程加溶劑到所需要的刻度進行定容。定容后將溶液進行搖晃混合均勻,并將其配制成標(biāo)準溶液以待下一步的測定。
測量結(jié)果計算公式如下:
式中:X為脫氫乙酸的含量,g/kg;m為樣品質(zhì)量,g;C1為脫氫乙酸的濃度,μg/mL;C0為空白樣品的脫氫乙酸濃度,μg/mL;V為定容體積,mL。
根據(jù)筆者所建立的數(shù)學(xué)模型可以知道,結(jié)果的不確定性來源主要包括藥品的稱量、溶液的定容、標(biāo)準工作曲線溶液的配制與曲線擬合、儀器的精密度以及樣品的重復(fù)性測定。
(1)將樣品稱樣兩次,天平的最大允差為±0.000 1 g,區(qū)間半寬度為0.000 1 g,按均勻分布,那么由天平誤差引入的不確定度為:
(2)所用天平的分辨率為0.000 1 g,區(qū)間半寬度為0.000 05 g,按均勻分布,那么由天平分辨率引入的不確定度為:
則樣品稱量引入的合成不確定度為u(m)==8.7×10?5g,相對標(biāo)準不確定度為=3.5×10?5。
本研究中所使用的25 mL 的容量瓶所具有的最大允差是±0.03 mL, 按照均勻分布,則由容量瓶引入的相對不確定度為u(V25mL)==0.017。
實驗室的溫度為(20±5)℃,溫度的波動會影響容量瓶和溶劑的體積。20 ℃時容量瓶的膨脹系數(shù)為2.5×10-5/℃,遠小于水的膨脹系數(shù)2.1×10-4/℃,因此可忽略容量瓶的體積變化,按均勻分布,則由溫度變化引入的不確定度為:
則樣液定容時的合成不確定度為u(V)==0.023 mL,相對標(biāo)準不確定度為=9.2 ×10?4。
2.4.1 標(biāo)準物質(zhì)引入的不確定度
根據(jù)證書,脫氫乙酸(99.5%)的相對標(biāo)準不確定度為±0.5%,包含因子k=2, 則urel(c')==0.002 5。
2.4.2 標(biāo)準工作液配制產(chǎn)生的不確定度
(1)移液器引入的不確定度。依據(jù)計量證書提供的數(shù)據(jù),按均勻分布,計算各移液器引入的相對不確定度如表1 所示。
表1 移液器引入的相對標(biāo)準不確定度
移液器引入的合成相對標(biāo)準不確定度為:
(2)容量瓶引入的不確定度。根據(jù)器材臺賬,本論文所使用的10 mL 容量瓶允差是±0.02 mL,50 mL 容量瓶允差是±0.05 mL,按均勻分布,則容量瓶引入的相對不確定度為urel(V10mL)==0.001 2,urel(V50mL)==0.000 58。
20 ℃時水的膨脹系數(shù)2.1×10-4/℃,溫度(20±5)℃,按均勻分布,則u=00..000000 6611。
則標(biāo)準溶液定容時,10 mL 和50 mL 容量瓶引入的合成相對不確定度分別為:
標(biāo)準溶液配制過程中容量瓶引入的合成相對不確定度為:
因此,合成標(biāo)準物質(zhì)配制產(chǎn)生的相對不確定度為:
2.4.3 標(biāo)樣稱量引入的不確定度
則標(biāo)樣稱量導(dǎo)致的合成不確定度為:
相對標(biāo)準不確定度為:
因此,標(biāo)準工作溶液引入的相對標(biāo)準不確定度為:
樣品進樣量為10 μL,查得高效液相色譜的允許誤差為6.3%, 按均勻分布, 則urel(q)==0.003 6。
工作液濃度為1 mg/L、10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L 和200 mg/L 時,峰面積Y分別為7.068、70.068、345.800、711.150 和1 381.900。曲線回歸方程為Y=6.9483 4X,R=0.999 94。
標(biāo)準曲線擬合引入的標(biāo)準不確定度計算公式如下:
式中:S(Y)為標(biāo)準曲線的標(biāo)準差;P為樣品溶液的測定次數(shù);N為標(biāo)準溶液的測定次數(shù);b為標(biāo)準曲線的斜率;cx為樣品溶液中待測物的濃度,mg/L;為標(biāo)準溶液濃度的平均值,mg/L;ci為標(biāo)準溶液的濃度,mg/L;Yi為單次標(biāo)準溶液的響應(yīng)值。
對香腸中脫氫乙酸含量進行10 次重復(fù)測定,根據(jù)計算公式得出結(jié)果分別為0.151 g/kg、0.151 g/kg、0.156 g/kg、0.155 g/kg、0.154 g/kg、0.155 g/kg、0.154 g/kg、0.152 g/kg、0.156 g/kg 和0.150 g/kg。
將上述各分量合成相對標(biāo)準不確定度為:
合成標(biāo)準不確定度為:
u(Y)=0.153×0.103=0.016 g/kg
95%置信概率下取包含因子k=2,將合成標(biāo)準不確定度乘以包含因子計算得到脫氫乙酸測量結(jié)果的擴展不確定度為U=u(Y)×k=0.032 g/kg。
因此可以得出結(jié)論,香腸中脫氫乙酸的含量是(0.153±0.032)g/kg,k=2。
本文以國家標(biāo)準文件為理論依據(jù),使用液相色譜法對香腸中所含有的脫氫乙酸含量進行了準確的測量。與此同時,對測定結(jié)果可能出現(xiàn)的不確定度來源的主要因素進行了合理的考察,并基于數(shù)學(xué)模型進行了準確計算。研究發(fā)現(xiàn),標(biāo)準溶液的配制、曲線的擬合和樣品的重復(fù)測定是影響結(jié)果不確定度的主要因素,樣品前處理過程中的稱量、定容對不確定度的影響較小。因此,實驗中要嚴格遵守操作規(guī)程,使用有證標(biāo)準物質(zhì),對儀器設(shè)備進行定期檢定和期間核查,提升專業(yè)人員的技術(shù)水平,是提高檢測結(jié)果準確性的前提。