UPLC-MS-MS 檢測豬肉中的甲硝唑原藥及其代謝產(chǎn)物羥基甲硝唑

黃 霞，張光前，朱貴平

（宜賓市敘州區(qū)食品檢驗(yàn)檢測中心，四川宜賓 644699）

畜禽養(yǎng)殖中常用各類抗生素作為畜禽疾病常用藥，有些藥物間隔期還未到期就上市銷售，長久食用會產(chǎn)生抗藥性，危害消費(fèi)者的身體健康。硝基咪唑類抗生素是畜禽飼料中常用的抗原蟲感染及抗菌藥，具有促生長作用，可與其他抗生素聯(lián)合用于治療厭氧菌感染[1-6]。

目前測定硝基咪唑類藥物的方法主要有氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[7-10]等。其中色譜檢測因?yàn)槎ㄐ湍芰θ酰讬z出假陽性。而氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法適用面窄，且其處理復(fù)雜。高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法選擇特征離子掃描，抗干擾能力強(qiáng)，且檢出靈敏度高，具有檢出使用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于各類獸藥殘留的檢測中。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所）；羥基甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)品（WITEGA 99.4%）；二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、甲醇、甲酸及丙酮均為色譜純（山東大禹）；氯化鈉為分析純（成都科?。?；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（舒活泉）。

AB4500Q 液質(zhì)聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源和大氣壓化學(xué)源 美國AB 公司)；CP225D 電子天平（賽多利斯）；LD4-2C 離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對照品溶液的配制

精密稱取待測組分甲硝唑及其代謝產(chǎn)物羥基甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg，甲醇溶解為1 000 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別精密吸取甲硝唑、羥基甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.010 mL 于同一個100 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到1 000 ng/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。分別精密吸取0.010 mL、0.020 mL、0.050 mL、0.100 mL和0.500 mL 于進(jìn)樣瓶中，陰性樣品提取液定容至1.00 mL，得到濃度為10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL 和500 ng/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 樣品前處理方法

準(zhǔn)確稱取均勻樣品約10.0 g 于50 mL 離心管中，加入5 g 硅藻土與樣品充分混勻后在加入2.5 mL 飽和氯化鈉水溶液，20 mL 甲醇+丙酮（3+1）。充分振蕩混勻，超聲30 min，離心，取上清液于蒸發(fā)皿中(重復(fù)提取一次）。將兩次提取的上清液60 ℃電熱板蒸干只剩水相，將水相全部轉(zhuǎn)移至另一50 mL 離心管中，加入氯化鈉飽和溶液5 mL，10 mL 乙酸乙酯，無水硫酸鈉3 g，離心，取有機(jī)相于25 mL比色管中（重復(fù)提取一次），60 ℃氮吹至近干，用1.0 mL 甲醇溶解，上機(jī)。

1.2.3 色譜檢測條件

色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；進(jìn)樣體積：5 μL；流速：1.0 mL/min；流動相：0.1%甲酸/水（A）和甲醇（B）；梯度洗脫程序：0 ～5.0 min，95%～5%A，5.1 ～10.0 min，5%A；10.1 ～15.0 min，95%A。

1.2.4 質(zhì)譜檢測條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；采集模式：多 反 應(yīng) 離 子 監(jiān) 測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；掃描模式：正離子掃描；離子源溫度：600 ℃；電噴霧電壓：5 500 V；氣簾氣壓力：35 psi；噴霧氣壓力：60 psi；輔助氣壓力：70 psi；其余質(zhì)譜條件如表1 所示。

表1 待測組分質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

樣品中加入硅藻土能更好地提取待測組分。硅藻土主要有3 個作用：粒間偶極作用；絮凝作用，能將待測組分形成絮凝物；吸附作用。這3 點(diǎn)都能促使待測組分更好地從動物組織中分離，吸附于硅藻土上。飽和食鹽水則能更好地將動物組織分散開，使待測組分更易析出。

文獻(xiàn)[6,8,10-12]中常用乙腈、酸性乙腈（含0.1%甲酸）、甲醇+丙酮（3+1）、二氯甲烷來作為萃取溶劑，提取動物組織中的獸藥殘留。本試驗(yàn)對這4 種提取溶劑的提取效果做了單因素實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，當(dāng)加標(biāo)量為1 μg/kg 時，4 種萃取劑的回收率都較低，為40%～55%，當(dāng)加標(biāo)量為5 μg/kg、20 μg/kg 時，乙腈、酸性乙腈（含0.1%甲酸）回收率在45%～60%，回收率較低。二氯甲烷回收率在70%～80%。甲醇+丙酮（3+1）回收率在75%～85%，回收率最高?？紤]到甲醇+丙酮（3+1）的毒性較乙腈和二氯甲烷低，且回收率較高，故選擇甲醇+丙酮（3+1）為提取溶劑。提取溶液再經(jīng)乙酸乙酯液液分配，能有效去除樣品中的雜質(zhì)，減少基質(zhì)干擾。

文獻(xiàn)中[6,8,10,12]還提到用凝膠滲透色譜，固相萃取小柱進(jìn)行凈化。凝膠滲透色譜溶劑用量大，儀器價格貴，未采用。采用C18固相萃取小柱凈化，甲硝唑和羥基甲硝唑的回收率都較低，為50%～65%。在小柱凈化的過程中，有一部分待測組分被C18顆粒吸附，未被洗脫，造成回收率偏低。

本實(shí)驗(yàn)采用液質(zhì)聯(lián)用的多反應(yīng)離子監(jiān)測模式進(jìn)行采集，離子碎片的選擇性高，能有效降低樣品中的雜質(zhì)干擾。因此，本實(shí)驗(yàn)通過乙酸乙酯液液萃取后，直接氮吹甲醇定容上機(jī)，能滿足檢測需要。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將1.0 μg/mL 待測化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液在正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，確定待測組分的母離子，再分別以待測化合物母離子，對其子離子進(jìn)行全掃描，選擇兩個響應(yīng)值較高，干擾較小的特征子離子作為子離子[11]。一般將響應(yīng)值最高的作為定量離子，次之的作為定性離子（離子對見表1）。

將母離子的去簇電壓（DP）設(shè)置為60 V，掃描5 ～180 V 的碰撞能量（CE），選擇響應(yīng)值最高的CE 值（具體值見表1），確定響應(yīng)值最高時的CE 值后將DP 范圍設(shè)置為5 ～300 V 掃描，得到響應(yīng)值最高的DP 值（具體值見表1）。建立MRM 方法。

2.3 流動相的優(yōu)化

流動相對化合物的出峰時間、峰形、響應(yīng)值有直接影響。甲硝唑和羥基甲硝唑均為正離子采集模式，故采用含有0.1%甲酸的水溶液作為水相，酸性環(huán)境下，物質(zhì)更容易電離成帶正電荷的母離子。本實(shí)驗(yàn)比較了乙腈甲酸水與甲醇甲酸水的兩種流動相對待測組分峰形的影響，實(shí)驗(yàn)表明，兩者均有較好的峰形，且響應(yīng)值差異較小。考慮到乙腈價格是甲醇的三倍以及乙腈毒性較甲醇更強(qiáng)，因此采用甲醇作為流動相。

2.4 線性范圍、檢出限及定量限

本實(shí)驗(yàn)以待測組分的濃度和色譜峰面積作為X、Y軸繪制線性回歸方程。本實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為10 ～500 ng/mL，甲硝唑、羥基甲硝唑的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999 9，通過向陰性豬肉樣品中添加1 μg/kg待測組分，測定信噪比為3（S/N=3）時方法的檢出限，信噪比為10（S/N=10）時方法的定量限。線性方程、線性相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限，見表2，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1 和圖2。

表2 回歸方程、檢出限、定量限

圖1 甲硝唑定量離子標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 羥基甲硝唑定量離子標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 方法回收率、精密度

選用陰性鮮豬肉樣品，分別在1 μg/kg、5 μg/kg、20 μg/kg 低中高3 個加標(biāo)水平對待測組分進(jìn)行加標(biāo)回收，高中低3 個濃度各測定6 次，結(jié)果見表3。5 μg/kg加標(biāo)回收色譜圖、陰性樣品的色譜圖見圖3、圖4。由此說明該方法的回收率基本滿足檢測需要。

圖3 5 μg/kg 加標(biāo)回收色譜圖

圖4 陰性樣品色譜圖

表3 回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.6 實(shí)際樣品分析

采用本方法對12 批鮮豬肉中的甲硝唑及羥基甲硝唑進(jìn)行測定。每批樣品從稱樣到檢測完畢只需1 h。與傳統(tǒng)固相萃取、凝膠滲透色譜法相比，樣品分析時間縮減，且成本降低。實(shí)際檢測結(jié)果顯示，12 批鮮豬肉中的甲硝唑及羥基甲硝唑均未檢出[13]。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過對前處理和儀器檢測條件的優(yōu)化，基本滿足檢測需要。但是在含量較低時，回收率還有較大提高空間。如果能采用內(nèi)標(biāo)法定量，消除前處理中的損失及儀器檢測時的基質(zhì)效應(yīng)，能有效提高方法的準(zhǔn)確性，特別是樣品含量較低時的定量準(zhǔn)確性。