HPLC測定黃芩不同部位、不同炮制品中4種黃酮類成分的含量

張文新，楊翠玲

（山西衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，山西 太原 030006）

黃芩為唇形科植物黃芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）的干燥根，有效成分主要為黃酮類化合物，主要包括黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素4種成分[1]。這4種成分雖然均屬黃酮類成分，但其藥理活性并不完全一致，如黃芩苷和黃芩素均具有解熱、保肝、利膽、抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗抑郁、抗氧化等藥理作用[2]，黃芩苷還有安胎、抗抑郁、抗癲癇等作用[3]，漢黃芩苷具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗氧化、心血管保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理活性[4]，漢黃芩素具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗腫瘤增殖、治療急性腎損傷等作用[5]。2020年版《中國藥典》以黃芩苷含量作為評價(jià)黃芩質(zhì)量的指標(biāo)，評價(jià)指標(biāo)單一，不能綜合反映黃芩中有效成分的含量。因此，應(yīng)建立更全面的多指標(biāo)方法評價(jià)黃芩藥材的質(zhì)量。

已有文獻(xiàn)報(bào)道了黃芩中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的含量測定方法，但方法各有欠缺，高效液相色譜（HPLC）法[6-7]存在分析時(shí)間較長或流動(dòng)相的配制較復(fù)雜[8]等缺點(diǎn)，超高效液相色譜（UPLC）法[9-10]雖然分析時(shí)間短，但儀器價(jià)格昂貴，應(yīng)用不普遍，方法的推廣有一定的局限性。本研究建立了HPLC法測定黃芩中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的含量，并研究了黃芩藥材不同部位、不同炮制品中4種成分含量的差異，為黃芩的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升、提取加工及臨床應(yīng)用提供一定的參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260 Infinity II型高效液相色譜儀（美國Agilent公司，配置四元梯度泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測器）；AS3120型超聲清洗儀（德國Autoscience公司）；XPE 105型十萬分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司）；BSA224S型萬分之一天平（德國Sartorius公司）。

1.2 試藥

黃芩苷對照品（成都克洛瑪生物科技有限公司，純度：≥98 %，批號：CHB190115）；黃芩素對照品（成都克洛瑪生物科技有限公司，純度：≥98 %，批號：CHB190116）；漢黃芩苷對照品（成都克洛瑪生物科技有限公司，純度：≥98 %，批號：CHB190115）；漢黃芩素對照品（成都克洛瑪生物科技有限公司，純度：HPLC≥98 %，批號：CHB190116）；黃芩藥材采集于山西運(yùn)城，經(jīng)山西衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院楊翠玲副教授鑒定為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi的根；黃芩生藥為將采集的黃芩根部輕輕刷去表面的泥沙，室溫放至干燥；生黃芩為取黃芩生藥，洗凈，蒸20 min，取出，切薄片，置烘箱中，60 ℃烘30 min；酒黃芩為取生黃芩片，加10 %黃酒拌勻，悶透，用文火炒至深黃色，取出放涼；乙腈（色譜純，梯度級，HiPure Chem公司，批號：16200801）；甲酸（色譜純，Honeywell Fluka，批號：H1250）；甲醇（色譜純，天津大茂化學(xué)試劑廠）；乙醇（分析純，天津市北辰方正試劑廠）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芩中4種黃酮類成分的含量測定

2.1.1 色譜條件 Waters XSelect HSS C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1 %甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min，25 %～30 %B；10～30 min，30 %～50 %B；30～35 min，50 %～100 %B）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：275 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取黃芩苷，漢黃芩苷，黃芩素和漢黃芩素26.34，15.53，5.29，2.16 mg，分別置于25 ml量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻；分別精密量取上述對照品溶液12.5，5，1.25，0.5 ml，置同一25 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取已干燥的黃芩樣品中粉約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70 %乙醇100 ml，稱定重量，超聲（120 W，40 kHz）提取30 min，冷卻至室溫，稱定，用70 %乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，上清經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取混合對照品溶液和黃芩供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。供試品溶液色譜圖中，在與對照品溶液色譜圖相應(yīng)的位置上，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素均有相同保留時(shí)間的色譜峰，且供試品中4種成分與其他組分均能完全分離，無干擾。

圖1 黃芩4種黃酮成分的HPLC圖譜

2.1.5 線性關(guān)系考察 分別精密量取混合對照品溶液2，4，6，8，10 ml，置于5個(gè)10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜過濾，備用；分別精密吸取上述不同濃度的溶液各10 μl，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以對應(yīng)組分峰面積積分值（Y）對其質(zhì)量濃度（X，μg/ml） 進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1?？芍鹘M分在其對應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各組分的線性關(guān)系

2.1.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一混合對照品溶液10 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定，計(jì)算各成分峰面積的RSD值，結(jié)果分別為黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積的RSD分別為0.97 %，1.00 %，0.90 %，0.98 %，表明儀器精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批黃芩樣品6份，各0.2 g，精密稱定，分別按2.1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析測定，測得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的平均含量分別為16.74 %，3.58 %，0.12 %，0.04 %，RSD分別為1.16 %，1.34 %，1.83 %，1.63 %（n=6）。結(jié)果表明，該方法的重復(fù)性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取新制備的同一供試品溶液，分別于配制后在室溫下放置0，2.5，5，7.5，12，24 h，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算各組分峰面積的RSD值，結(jié)果黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積RSD分別為0.30 %，0.31 %，1.32 %，0.65 %，表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的樣品6份，分別精密加入一定量黃芩苷，漢黃芩苷，黃芩素，漢黃芩素的對照品，按2.1.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算平均回收率和RSD值，結(jié)果見表2。由表2可見，各被測組分的加樣回收率良好。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.2 黃芩不同部位、不同炮制品中4種黃酮成分的含量

2.2.1 黃芩不同部位中4種黃酮成分的含量 取黃芩生藥，輕輕刷去表面的泥沙，然后分離出黃芩的栓皮、韌皮部和木質(zhì)部，干燥，分別打成中粉，按2.1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，并用外標(biāo)法計(jì)算樣品中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的含量，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，黃芩木質(zhì)部中僅含黃芩苷和漢黃芩苷，幾乎不含黃芩素和漢黃芩素；韌皮部含4種黃酮成分；栓皮中黃芩素和漢黃芩素含量較高，且含少量黃芩苷和漢黃芩苷。

表3 黃芩藥材不同組織部位中4種成分的含量（n=3）

因此，黃芩中的黃芩苷和漢黃芩苷主要來源于木質(zhì)部和韌皮部，對應(yīng)的苷元黃芩素和漢黃芩素主要來源于韌皮部和栓皮?？蒈擞捎谀举|(zhì)部中空，黃芩苷含量降低，黃芩素的含量較高；子芩為新根，中部堅(jiān)實(shí)，黃芩苷含量高。黃芩苷和黃芩素都有清熱、抗菌、抗病毒功效，不同的是黃芩素吸收較快，生物利用度優(yōu)于黃芩苷，而黃芩苷需經(jīng)腸內(nèi)微生物水解，產(chǎn)生其苷元后才被吸收[7]。這也就解釋了傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為的枯芩善清肺熱，主治熱痰咳喘；子芩善清胃腸火邪，主治胃腸濕熱瀉痢及血痢。

2.2.2 不同加工方法對4種黃酮成分含量的影響 按《中國藥典》2020年版一部黃芩的加工方法，考察生藥的干燥方式、生黃芩的殺酶軟化方式、酒黃芩10 %黃酒浸潤后的干燥方式對4種成分的影響，見表4。結(jié)果顯示，黃芩生藥中4種成分總含量最高，洗、蒸、煮、烘、炒的加工方式都會(huì)引起含量的降低，生黃芩的煮制軟化方式易引起黃酮成分的流失，原因可能是煮制會(huì)使藥材與水大面積接觸，使有效成分溶于水中或煮的時(shí)間短，不能使酶完全滅活，引起苷類的降解，從而降低藥材中黃酮的含量。酒黃芩經(jīng)酒浸潤后，采用了烘干與炒干兩種方式干燥，發(fā)現(xiàn)炒干的4種成分的含量均高于烘干，酒黃芩與生黃芩相比，雖然苷類成分含量降低，但苷元含量增加。

表4 黃芩不同加工方法對4種黃酮成分含量的影響（n=3）

2.2.3 支根與主根中4種黃酮類成分含量的差異 同一批生黃芩，分出主根與支根，考察主根與支根中4種成分含量差異，見表5。結(jié)果表明，4種成分在黃芩支根和主根中的含量基本相同。

表5 黃芩支根與主根中4種成分的含量（n=3）

3 討論

3.1 超聲提取條件的選擇

3.1.1 提取溶劑的選擇 前期通過單因素實(shí)驗(yàn)考察了甲醇和70 %乙醇對4種成分提取率的影響，發(fā)現(xiàn)同等條件下，70 %乙醇對4種成分的提取率，尤其是苷類成分黃芩苷和漢黃芩苷的提取率都高于甲醇，故選擇70 %乙醇作為超聲提取的溶劑。

3.1.2 超聲時(shí)間的選擇 通過查閱文獻(xiàn)[11-12]，考察了超聲提取15，30，45 min對4種成分提出率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲不同時(shí)間，4種成分的溶出率沒有明顯差異，超聲30 min時(shí)4種成分的含量略高于超聲15 min，為保證所有成分能全部溶出，本課題采用30 min作為超聲提取的時(shí)間。

3.2 檢測條件的選擇

3.2.1 檢測波長的選擇 采用二極管陣列檢測器，分別對4個(gè)成分的對照品溶液在200～400 nm進(jìn)行全波長掃描，4種成分在275 nm處都有最大吸收，因此選擇275 nm作為檢測波長。

3.2.2 柱溫、流動(dòng)相及進(jìn)樣量的選擇 其他條件不變的情況下，進(jìn)樣量、柱溫及流動(dòng)相都會(huì)影響分離效果。其他條件不變的情況下，進(jìn)樣量主要影響黃芩苷的分離效果：進(jìn)樣量為20 μl時(shí)，黃芩苷的色譜峰有明顯拖尾，與其他組分不能分離，進(jìn)樣量≤10 μl時(shí)，黃芩苷色譜峰對稱、分離度高；檢測溫度為25 ℃時(shí)，漢黃芩苷與其他組分不能完全分離；將流動(dòng)相的乙腈換為甲醇時(shí)，黃芩苷和漢黃芩苷不能完全分離。

3.3 本文建立檢測方法的優(yōu)點(diǎn)

本文建立方法分析時(shí)間短，操作簡單，同時(shí)測定4個(gè)指標(biāo)成分來評價(jià)黃芩的質(zhì)量。另外，本文首次研究了黃芩中4種黃酮類（黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素）在木質(zhì)部、韌皮部和栓皮中含量的不同，發(fā)現(xiàn)黃芩苷和漢黃芩苷主要存在于韌皮部和木質(zhì)部，栓皮中含量較少；栓皮中黃芩素和漢黃芩素含量最高，其次為韌皮部，木質(zhì)部則幾乎不含黃芩素和漢黃芩素。因此，在黃芩含量測定中，樣品打粉要完全，粉末混合要均勻，否則黃芩素和漢黃芩素的含量測定誤差較大。