保健食品葉藍(lán)明目膠囊制劑工藝及功效成分含量測(cè)定研究

李 想，孫思琪，劉曉云，任雪陽(yáng)，王 宇，董 英，宋若蘭，魏勝利，王秀環(huán)，折改梅

（北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488）

視屏終端設(shè)備的普及和生活節(jié)奏的加快使視疲勞人群的范圍不斷擴(kuò)大[1]。視疲勞即由于各種病因使得人眼視物時(shí)超過(guò)其正常的視覺(jué)功能所承載的負(fù)荷，導(dǎo)致用眼后出現(xiàn)視覺(jué)障礙、眼部不適或伴有全身癥狀等，以至于不能進(jìn)行正常視作業(yè)的癥候群[2]，導(dǎo)致的原因可能與眼部因素、神經(jīng)因素和環(huán)境因素有關(guān)[3]。針對(duì)視疲勞發(fā)病率日益上升的趨勢(shì)，本研究開(kāi)發(fā)了具有緩解視疲勞功能的保健食品葉藍(lán)明目膠囊。其由葉黃素、藍(lán)莓、五味子組成，具有緩解視疲勞功能。

葉藍(lán)明目膠囊中的葉黃素（xanthophyll）主要包括葉黃素（lutein）和玉米黃質(zhì)（zeaxanthin），二者為同分異構(gòu)體[4]。二者均是組成人眼視網(wǎng)膜黃斑區(qū)域的重要色素[5-6]，具有緩解視疲勞的功能[7]，為葉藍(lán)明目膠囊的功效成分。GB5009.246-2016《食品中葉黃素的含量測(cè)定》[8]要求對(duì)葉黃素（lutein）和玉米黃質(zhì)（zeaxanthin）同分異構(gòu)體采用手性柱分別測(cè)定含量，但因葉黃素分子結(jié)構(gòu)中含共軛雙鍵，易氧化變質(zhì)，檢測(cè)樣品時(shí)常需臨時(shí)新制，對(duì)照品價(jià)格昂貴，因此檢測(cè)成本較高。為降低檢測(cè)成本，有研究者嘗試對(duì)保健食品中的葉黃素整體含量建立測(cè)定方法[9-10]；或采用對(duì)照品替代法，即采用價(jià)格低廉、性質(zhì)穩(wěn)定的蘇丹I代替葉黃素對(duì)照品建立含量測(cè)定方法[11]。綜上，結(jié)合對(duì)照品替代法，采用快速、高效、穩(wěn)定的方法對(duì)兩成分的總含量進(jìn)行檢測(cè)，是比較可行的辦法。

本研究以休止角、堆密度、吸濕性、臨界相對(duì)濕度為考察指標(biāo)，篩選了最佳輔料和制劑工藝，并建立了功效成分葉黃素的含量測(cè)定方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

S6000高效液相色譜儀（北京華譜）；安捷倫Eclipse Pluse C18色譜柱（北京綠百草）；1901PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海棱光）；JY02S型紫外分析儀（北京君意東方）；BT25S型分析天平（北京賽多利斯）；ASTM D1895型休止角測(cè)定儀（奧祥儀器）；YG-3KG小型干粉混合機(jī)（進(jìn)杰工業(yè)設(shè)備）；BJ-2型崩解時(shí)限測(cè)定儀（天津天光）；S-400膠囊填充板（惠普金膠囊設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

葉黃素粉，藍(lán)莓提取物（漢中天然谷）；五味子提取物（陜西嘉禾）；預(yù)膠化淀粉（上海麥克林）；藥用糊精（上海麥克林）；玉米淀粉（上海麥克林）；麥芽糊精（上海麥克林）；微晶纖維素（北京惠康源）；硬脂酸鎂（上海麥克林）；二氧化硅（西安晉湘藥用輔料有限公司）；滑石粉（上海麥克林）；甲醇，鹽酸（分析純，北京化工廠）；甲醇（色譜級(jí)，F(xiàn)isher Chemical公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 葉黃素含量測(cè)定色譜條件[12]

色譜柱：Eclipse Plus C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（95:5，v/v），等度洗脫；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：445 nm；進(jìn)樣量：10 μl；流速：0.8 ml/min。

2.2 制劑工藝研究

以休止角、吸濕率和臨界相對(duì)濕度為考察指標(biāo)，篩選填充劑和潤(rùn)滑劑的種類及用量，手工灌裝并檢查膠囊質(zhì)量，優(yōu)化制劑工藝。

2.2.1 填充劑考察 將原料混合粉（葉黃素粉、藍(lán)莓提取物、五味子提取物）與不同填充劑按表1方案混合均勻，用乙醇制軟材并制粒，測(cè)定顆粒休止角和臨界相對(duì)濕度。使用休止角測(cè)定儀測(cè)定顆粒的流動(dòng)性。采用固定漏斗法：將漏斗固定于水平放置的帶刻度的底盤上適宜高度處，使漏斗下口距底盤的距離為H，小心地將混合粉沿漏斗壁倒入漏斗中，直至漏斗下面總混合物料的圓錐體尖端接觸到漏斗口為止，此時(shí)用坐標(biāo)紙測(cè)出圓錐體底部的直徑R，測(cè)定5次，計(jì)算休止角。吸濕率測(cè)定：各稱取2 g混合粉，分別置于恒溫25 ℃、不同相對(duì)濕度（33 %，43 %，57 %，75 %，84 %，92 %）的環(huán)境中，放置7 d后取出，稱定質(zhì)量并計(jì)算吸濕率。以相對(duì)濕度為橫坐標(biāo)，吸濕率為縱坐標(biāo)，繪制臨界相對(duì)濕度曲線。結(jié)果見(jiàn)圖1。由表1可見(jiàn)，以藥用糊精為填充劑時(shí)，流動(dòng)性相對(duì)較好；不同填充劑與原料混合粉混合后的臨界相對(duì)濕度無(wú)顯著差別，結(jié)果見(jiàn)圖1。最終確定藥用糊精為填充劑。

表1 不同填充劑與原料混合粉混合后的流動(dòng)性和臨界相對(duì)濕度測(cè)定結(jié)果

圖1 不同填充劑與原料混合粉混合后的臨界相對(duì)濕度

2.2.2 潤(rùn)滑劑考察 首先考察潤(rùn)滑劑的種類。取原料混合粉，按表2分別在原料混合粉中加入0.4 %硬脂酸鎂、滑石粉、二氧化硅，將原料混合粉與各輔料混合均勻，用乙醇制軟材并制粒，分別測(cè)定休止角并計(jì)算RSD值。結(jié)果表明，加入0.4 %二氧化硅時(shí)休止角為36.50°，RSD為1.43 %，對(duì)流動(dòng)性的改善最明顯，因此選用二氧化硅為潤(rùn)滑劑。

表2 不同潤(rùn)滑劑與原料混合粉混合后的流動(dòng)性

進(jìn)一步考察二氧化硅的用量。按表3取原料混合粉及輔料，混合均勻，分別測(cè)定休止角，并計(jì)算RSD值。結(jié)果見(jiàn)表3。由表3 可見(jiàn)，藥用糊精用量16.5 g，二氧化硅用量0.5 g時(shí)，休止角為33.90°，流動(dòng)性達(dá)標(biāo)。最終確定配方量中藥用糊精用量為原料粉重的22 %，二氧化硅為原料粉重的0.66 %。

表3 二氧化硅用量考察結(jié)果

2.2.3 混合時(shí)間考察 將原料混合粉與輔料按比例置于混合機(jī)中，分別混合5，10，20，25 min，制成總混合粉。觀察總混合粉色澤和均勻度，并抽取5個(gè)點(diǎn)（左上、右上、左下、右下、中間），按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定葉黃素含量，驗(yàn)證混合均一性。根據(jù)表4，混合20 min與混合25 min后粉末色澤均勻度均較好?；旌?0 min的總混合粉，抽取5個(gè)點(diǎn)（左上、右上、左下、右下、中間），測(cè)定葉黃素的含量，驗(yàn)證混合均勻度，并計(jì)算RSD。葉黃素的含量平均值為18.96 mg/g，RSD為1.44 %（＜5 %），表明混合均勻，結(jié)果見(jiàn)表5。最終確定混合時(shí)間為20 min。

表4 混合時(shí)間考察結(jié)果

表5 混合結(jié)果驗(yàn)證

2.2.4 膠囊灌裝 采用量筒法測(cè)定堆密度[13]。測(cè)得顆粒堆密度為0.497 g/ml，計(jì)算得0號(hào)膠囊的理論裝量為0.34 g，1號(hào)膠囊的理論裝量為0.27 g。

分別取0號(hào)空心膠囊和1號(hào)空心膠囊100粒于膠囊板中，稱取粉末，進(jìn)行手工試裝至滿，隨機(jī)測(cè)定5粒膠囊實(shí)際裝入的粉末量。測(cè)得0號(hào)膠囊實(shí)際平均裝量為0.307 g，故選擇0號(hào)膠囊。最終確定裝量規(guī)格為每粒裝0.3 g。

2.2.5 膠囊檢查

2.2.5.1 裝量差異檢查 按以上工藝制備3批顆粒并灌裝，考察成品率與裝量差異，并測(cè)定葉黃素含量。結(jié)果見(jiàn)表6。經(jīng)檢查，裝量差異符合要求。

表6 膠囊裝量差異檢查和含量測(cè)定結(jié)果

2.2.5.2 崩解時(shí)限檢查 按《中國(guó)藥典》2020年版崩解時(shí)限檢查法膠囊劑檢查方法[14]進(jìn)行。結(jié)果顯示，6次測(cè)定，膠囊均在30 min內(nèi)全部崩解并通過(guò)篩網(wǎng)，符合要求。

根據(jù)上述研究，最終確立制劑工藝為：藥用糊精添加用量為原料粉重的22 %，二氧化硅添加用量為原料粉重的0.66 %，混合20 min。灌裝0號(hào)膠囊，裝量規(guī)格為每粒0.3 g。

2.3 葉黃素含量測(cè)定方法學(xué)考察

本品中葉黃素為主要功效成分。參考相關(guān)文獻(xiàn)和法規(guī)[15-17]，建立葉黃素檢測(cè)方法，并進(jìn)行方法學(xué)考察。

2.3.1 溶液制備

2.3.1.1 對(duì)照品溶液制備 取葉黃素粉40 mg，精密稱定，置入100 ml量瓶，加甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.1.2 供試品溶液制備 取膠囊內(nèi)容物約0.1 g，精密稱定，置入具塞錐形瓶，加甲醇100 ml，搖勻，超聲5 min，補(bǔ)足失重，濾過(guò)，即得。

2.3.1.3 陰性樣品溶液制備 除葉黃素粉外，按處方比例稱取其他原輔料，按供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液。

2.3.2 專屬性實(shí)驗(yàn) 按2.3.1項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液，供試品溶液和陰性樣品溶液，精密吸取10 μl進(jìn)樣，對(duì)比出峰時(shí)間。在與葉黃素相應(yīng)的保留時(shí)間處陰性樣品溶液無(wú)色譜峰，其他成分對(duì)葉黃素的含量測(cè)定無(wú)干擾，表明本方法具有專屬性。

圖2 專屬性實(shí)驗(yàn)HPLC圖譜

2.3.3 檢出限 按2.3.1.1項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液，稀釋后精密吸取10 μl進(jìn)樣。以信噪比（S/N）為3:1時(shí)濃度為檢出限（1.13 μg/ml）。

2.3.4 線性關(guān)系考察 按2.3.1.1項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液，吸取適量對(duì)照品溶液并稀釋成40，20，10，5，2 μg/ml的溶液。精密吸取10 μl，注入液相色譜儀，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=30124X-32104（R2=0.9997），表明在2～80 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度 按2.3.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其峰面積。計(jì)算得峰面積RSD為0.60 %，表明儀器精密度良好。

2.3.6 加樣回收試驗(yàn) 按2.3.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別加入相當(dāng)于成品含量50 %，100 %，150 %的對(duì)照品溶液，平行3份，測(cè)得平均加樣回收率為99.13 %，RSD為2.84 %，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 葉黃素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.3.7 樣品含量測(cè)定 結(jié)果見(jiàn)表6。3批葉藍(lán)明目膠囊中葉黃素的平均含量為18.87 mg/g。

3 討論

本研究嘗試使用葉黃素粉替代葉黃素對(duì)照品建立含量測(cè)定方法，可解決葉黃素對(duì)照品昂貴、不易保存的問(wèn)題，從源頭和生產(chǎn)過(guò)程控制膠囊質(zhì)量，并節(jié)約成本，克服企業(yè)難以進(jìn)行常態(tài)化檢測(cè)的困難。本研究建立的含量測(cè)定方法可同時(shí)測(cè)定保健食品中葉黃素和玉米黃質(zhì)。本研究建立了葉藍(lán)明目膠囊的制劑工藝。在輔料選擇方面，常見(jiàn)的填充劑有藥用糊精、淀粉、微晶纖維素、麥芽糊精、預(yù)膠化淀粉等，常用的潤(rùn)滑劑有硬脂酸鎂、滑石粉、二氧化硅等。由于膠囊劑要求填充物料有良好的抗吸濕性和流動(dòng)性，最終確定以藥用糊精為膠囊填充劑，二氧化硅為潤(rùn)滑劑。通常要求混合粉末休止角小于40°時(shí)才符合生產(chǎn)需求。本研究中添加相當(dāng)于原料粉重0.66 %的二氧化硅時(shí)，休止角為33.90°，符合生產(chǎn)要求，因此無(wú)需制粒，可節(jié)約制粒成本，避免物料損失。