菟絲子不同炮制品指紋圖譜及多指標(biāo)成分定量研究

李國(guó)衛(wèi)，孫冬梅，胡綺萍，索彩仙，何嘉瑩，童培珍，陳向東，曹斯瓊（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244）

菟絲子為旋花科植物南方菟絲子Cuscuta australisR.Br. 或菟絲子Cuscuta chinensisLam.的干燥成熟種子[1]，其性味甘、溫，歸肝、腎、脾經(jīng)，為常用補(bǔ)益中藥。文獻(xiàn)研究表明，菟絲子含有金絲桃苷、槲皮素、異槲皮苷等黃酮類化學(xué)成分，具有改善心肌缺血、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等多種功效[2-5]。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為菟絲子生品可養(yǎng)肝明目，多用于目暗不明；菟絲子經(jīng)鹽制后可以引藥入腎，能增強(qiáng)補(bǔ)腎固澀作用，常用于陽痿、遺精、胎動(dòng)不安等。

菟絲子臨床使用的飲片有菟絲子、鹽菟絲子、炒菟絲子，其中菟絲子、鹽菟絲子為2020年版《中國(guó)藥典》收載品種，炒菟絲子為地方習(xí)用炮制品。現(xiàn)菟絲子的文獻(xiàn)研究大部分集中在藥材的化學(xué)成分和質(zhì)量控制、真?zhèn)舞b別等方面[6-9]，缺乏對(duì)生品及炮制品的系統(tǒng)研究。本研究以菟絲子生品和鹽菟絲子、炒菟絲子兩種炮制品進(jìn)行比較研究，通過36 批樣品建立了菟絲子藥材的超高效液相色譜（UPLC）特征圖譜，結(jié)合相似度、主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（OPLSDA）探討影響菟絲子藥材和炮制品的差異成分，同時(shí)建立了菟絲子藥材中8 個(gè)指標(biāo)性成分的含量測(cè)定方法，以期控制菟絲子及其炮制品的質(zhì)量。

1 儀器與材料

Waters H-Class 超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；Agilent SB 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；XP-26 型百萬分之一天平、ME204E 型萬分之一天平（瑞士Mettler 公司）；KQ-500DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純（Merk）；水為純化水；其余試劑為分析純。

綠原酸（批號(hào)：110753-202018， 含量：96.10%）、金絲桃苷（批號(hào)：111521-201809，含量：94.90%）、異槲皮苷（批號(hào)：111809-201403，含量：92.90%）、槲皮素（批號(hào)：100081-201509，含量：96.80%）（對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；紫云英苷（批號(hào)：wkq17032404）、異綠原酸A（批號(hào)：wkq20020403）、新綠原酸（批號(hào)：wkq18030107）（對(duì)照品，含量均為98%，四川省維克奇生物科技有限公司）；隱綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：DSTDY003501，含量：98%，成都德斯特生物技術(shù)有限公司）。所用藥材經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為旋花科植物南方菟絲子Cuscuta australisR.Br.的干燥成熟種子，見表1。

表1 藥材信息來源Tab 1 Source of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品炮制

2.1.1 炒菟絲子 《山東省中藥飲片炮制規(guī)范》2012年版[10]：“取凈菟絲子置熱鍋內(nèi)，文火炒至微黃，有香氣逸出時(shí)，取出，放涼”。

2.1.2 鹽菟絲子 《中國(guó)藥典》2020年版[1]：“取凈菟絲子，照鹽炙法（加鹽水拌勻，悶透，置炒制容器內(nèi)，文火加熱，炒至微鼓起，取出，放涼）?！?/p>

2.2 色譜條件

以Agilent SB 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）為色譜柱；以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0 ～9 min，7%→11%A；9 ～15 min，11%→14%A；15 ～20 min，14%A；20 ～25 min，14%→25%A；25 ～30 min，25%→27%A；30 ～35 min，27%→93%A）；流速為0.3 mL·min-1；柱溫為40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。

2.3 混合對(duì)照品溶液制備

取新綠原酸、金絲桃苷、綠原酸、異槲皮苷、隱綠原酸、異綠原酸A、紫云英苷和槲皮素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為161.112、604.668、200.753、62.798、130.6536、210.834、60.449、100.128 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.4 供試品溶液制備

取樣品粉末（過四號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加70%甲醇50 mL，加熱回流30 min，放冷，補(bǔ)重，搖勻，過濾，即得。

2.5 指紋圖譜的建立及分析

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，以金絲桃苷為參照峰，計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均＜2.0%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)樣測(cè)定，以金絲桃苷為參照峰，計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均＜2.0%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品粉末約0.5 g，平行6份，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，以金絲桃苷為參照峰，計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均＜2.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 指紋圖譜的生成 取36 批樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，分別記錄UPLC 特征圖譜。采用指紋圖譜相似度軟件進(jìn)行結(jié)果分析，菟絲子共確定10 個(gè)共有峰（見圖1），炒菟絲子和鹽菟絲子共確定12 個(gè)共有峰（見圖2～3），其中峰11、峰12 為炮制后產(chǎn)生。5 號(hào)峰（金絲桃苷）分離度好，峰形對(duì)稱，2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定其為評(píng)價(jià)菟絲子質(zhì)量的指標(biāo)性成分，故以5 號(hào)峰（金絲桃苷）為參照峰（即為S 峰）。

圖1 12批菟絲子UPLC 指紋圖譜共有峰Fig 1 Common peaks in the UPLC fingerprints of 12 batches of Cuscuta australis R.Br.

圖2 12批炒菟絲子UPLC 指紋圖譜共有峰Fig 2 Common peaks in the UPLC fingerprints of 12 batches of friedprocessed Cuscuta australis R.Br.

2.5.5 色譜峰指認(rèn) 通過各對(duì)照品保留時(shí)間和紫外吸收光譜對(duì)共有峰的化學(xué)成分進(jìn)行歸屬，指認(rèn)了其中8 個(gè)特征峰，分別為峰2 綠原酸（最大吸收波長(zhǎng)325 nm），峰5（S）金絲桃苷（最大吸收波長(zhǎng)254 nm），峰6 異槲皮苷（最大吸收波長(zhǎng)255 nm），峰7 紫云英苷（最大吸收波長(zhǎng)264 nm），峰8 異綠原酸A（最大吸收波長(zhǎng)327 nm），峰10槲皮素（最大吸收波長(zhǎng)254 nm），峰11 新綠原酸（最大吸收波長(zhǎng)325 nm），峰12 隱綠原酸（最大吸收波長(zhǎng)323 nm）。結(jié)果見圖4。

圖4 菟絲子及其炮制品UPLC 色譜圖Fig 4 UPLC chromatograms of Cuscuta australis R.Br. and its processed product

2.5.6 相似度評(píng)價(jià) 采用指紋圖譜相似度軟件對(duì)36 批樣品進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果見表2。說明同一工藝的樣品之間相似度較高，炮制工藝較為穩(wěn)定。

2.6 多元統(tǒng)計(jì)分析

為研究菟絲子炮制前后指紋圖譜中總體化學(xué)成分的變化，統(tǒng)計(jì)36 批樣本中12 個(gè)色譜峰的峰面積，并將其除以每個(gè)樣品的稱樣量，以消除稱樣量差異造成的影響[11]。

2.6.1 PCA 將36 批樣品的色譜峰峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行分析。提取到兩個(gè)主成分，累積貢獻(xiàn)率達(dá)到70.50%，見表3。提取前兩個(gè)主成分做得分圖，見圖5。36 批樣品得到了較好的劃分，第一類（T1 ～T12）為菟絲子，主要分布在第一、四象限，第二類（CT1 ～CT12）為炒菟絲子，主要集中在第二、三象限，第三類（YT1 ～YT12）為鹽菟絲子，在第一、二、三象限中均有分布，其中YT6 散落在第四象限。PCA結(jié)果表明菟絲子生品與炮制品能較好區(qū)分，但兩種炮制品分布較為集中，為更好地考察化學(xué)計(jì)量學(xué)方法能否將菟絲子及兩種炮制品完全區(qū)分，進(jìn)一步采用OPLS-DA 法對(duì)樣品進(jìn)行分析。

圖5 主成分得分分布圖Fig 5 Principal component score distribution

表3 特征根、各主成分的貢獻(xiàn)率Tab 3 Contribution rates of characteristic roots and principal components

圖3 12批鹽菟絲子UPLC 指紋圖譜共有峰Fig 3 Common peaks in UPLC fingerprint of 12 batches of saltprocessed Cuscuta australis R.Br.

表236 批樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 2 Similarity evaluation of 36 batches of samples

2.6.2 OPLS-DA 將36 批樣品數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 14.0 軟件進(jìn)行分析，建立3 組OPLS-DA 模型，見圖6。結(jié)果顯示，菟絲子與炒菟絲子、菟絲子與鹽菟絲子、炒菟絲子與鹽菟絲子的R2X分別為：0.970、0.912、0.964，R2Y分別為：0.924、0.938、0.842，說明建立的3 組模型能有效解釋3 種菟絲子之間的差異；Q2分別為0.569、0.890、0.522，說明模型具有一定的預(yù)測(cè)能力。通過提取OPLS-DA 模型中12 個(gè)變量的VIP 值圖（見圖7），對(duì)12個(gè)色譜峰峰面積VIP 值大小進(jìn)行排列，結(jié)果顯示F12、F11、F1、F4 的VIP 值均大于1，其中F12為隱綠原酸，F(xiàn)11 為新綠原酸，F(xiàn)1 和F4 為未知成分，有待進(jìn)一步指認(rèn)。上述結(jié)果說明以上4 種化學(xué)成分對(duì)菟絲子生品與炮制品分類具有顯著的影響，是區(qū)分生品與炮制品質(zhì)量差異的主要標(biāo)志物。

圖6 OPLS-DA 得分圖Fig 6 Chart of OPLS-DA score

圖7 12個(gè)化學(xué)成分的VIP 值Fig 7 VIP values of 12 chemical components

2.7 多指標(biāo)含量測(cè)定

文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，菟絲子主要藥效成分除常見的黃酮類化合物外，還有酚酸類等化合物[12-13]，具有多種功效，如保肝、抗衰老、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用[14]，在進(jìn)行指紋圖譜研究的同時(shí)，選擇黃酮類成分中的金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素，以及具備抗炎作用的酚酸類物質(zhì)綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸和異綠原酸A 作為菟絲子的質(zhì)量控制指標(biāo)，為菟絲子藥材和不同炮制品的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

2.7.1 系統(tǒng)適用性考察 取“2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果新綠原酸、異槲皮苷、綠原酸、紫云英苷、隱綠原酸、金絲桃苷、異綠原酸A 和槲皮素與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，拖尾因子在1.00 ～1.05。

2.7.2 線性關(guān)系考察 取“2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，加甲醇稀釋制得6 個(gè)不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果各個(gè)對(duì)照品的線性關(guān)系良好，見表4。

表4 回歸方程及線性范圍Tab 4 Regression equation and linearity

2.7.3 精密度試驗(yàn) 取“2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，8 個(gè)成分的峰面積RSD分別為1.1%、0.98%、0.81%、1.1%、1.2%、1.2%、0.87%、1.1%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.7.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在室溫下放置0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。8 個(gè)成分的峰面積RSD分別為1.0%、1.1%、0.78%、0.98%、1.3%、1.2%、1.3%、1.8%（n＝6），表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品約0.5 g，平行6 份，按“2.4”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果8 個(gè)成分的含量RSD分別為0.87%、0.98%、1.0%、1.3%、1.4%、1.0%、1.9%、1.2%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.7.6 加樣回收率考察 精密稱取已知含量的炒菟絲子（CT10）0.25 g，平行6 份，加入與樣品中含量等量的對(duì)照品，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、異綠原酸A、槲皮素平均加樣回收率分別為95.52%、94.11%、97.24%、93.41%、93.90%、93.88%、93.92%、96.56%，RSD分別為1.5%、0.94%、1.2%、0.47%、2.3%、2.8%、1.3%、1.7%，符合方法學(xué)要求。

2.7.7 含量測(cè)定結(jié)果 精密稱取36 批樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見表5。菟絲子生品及兩種炮制品的8 個(gè)成分含量存在差異，RSD值在24.9%～92.6%。

表5 含量測(cè)定結(jié)果(mg·g-1)Tab 5 Content determination (mg·g-1)

2.7.8 方差分析 以上述8 個(gè)含量測(cè)定指標(biāo)為檢驗(yàn)變量，菟絲子、炒菟絲子和鹽菟絲子作為分組變量，通過Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)法對(duì)36 批藥材樣品的8 個(gè)成分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布驗(yàn)證，結(jié)果顯示金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷和異綠原酸A 的sig.值小于0.05，不服從正態(tài)分布，故采用非參數(shù)檢驗(yàn)法（秩和檢驗(yàn)）進(jìn)行分析。對(duì)菟絲子生品和兩種炮制品的8 個(gè)指標(biāo)進(jìn)行兩兩比較（Kruskal-Wallis 法）。新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸和槲皮素在菟絲子和炒菟絲子以及菟絲子和鹽菟絲子間均有顯著差異（P＜0.05），而在炒菟絲子和鹽菟絲子間則無顯著差異；金絲桃苷在菟絲子和炒菟絲子間具有顯著差異（P＜0.05）。上述結(jié)果說明菟絲子生品和炮制品含量存在一定差異。

3 分析與討論

3.1 指紋圖譜及多元統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析

菟絲子經(jīng)加熱炮制后特征峰F11、F12、F1和F4 產(chǎn)生了變化，其中，F(xiàn)11 和F12 為菟絲子炮制后產(chǎn)生的特有峰，經(jīng)指認(rèn)分別為新綠原酸和隱綠原酸，可作為區(qū)分菟絲子生品和炮制品的特征成分，而炒菟絲子與鹽菟絲子的指紋圖譜則無明顯差異，表明菟絲子生品與炮制品存在一定差異，建立的方法可對(duì)其進(jìn)行區(qū)分。

3.2 多指標(biāo)含量結(jié)果分析

新綠原酸和隱綠原酸為炒菟絲子和鹽菟絲子的特征峰，綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷和異綠原酸A 在三者中的含量大小排序?yàn)椋狠私z子＞鹽菟絲子＞炒菟絲子，而槲皮素則在炒菟絲子中占比最高，其次為鹽菟絲子、菟絲子。文獻(xiàn)研究表明，綠原酸在加熱情況下，容易生成新綠原酸和隱綠原酸[15]，這可能是導(dǎo)致炒菟絲子和鹽菟絲子中綠原酸含量降低的主要原因。加熱炮制亦對(duì)金絲桃苷含量有顯著影響，炮制溫度和時(shí)間是關(guān)鍵因素[16]。菟絲子經(jīng)炒黃、鹽炙后槲皮素增加，可能是由于以槲皮素為苷元的黃酮苷類受熱易分解生成槲皮素所致[17]。定量分析結(jié)果顯示，菟絲子生品與炮制品在化學(xué)成分的含量上存在較大的差異，這與肖嵐等[18]的研究結(jié)果一致。

3.3 炮制品間差異分析

在含量測(cè)定的8 個(gè)成分中，兩種炮制品間的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷以及異綠原酸A 含量數(shù)據(jù)差異較小，而槲皮素含量則相差一半。鹽菟絲子炮制方法比炒菟絲子多了鹽水悶潤(rùn)這個(gè)環(huán)節(jié)，炮制受熱溫度會(huì)存在一定差異，猜測(cè)這是導(dǎo)致兩者間槲皮素含量存在差異的主要原因。本研究結(jié)果表明炒菟絲子與鹽菟絲子在槲皮素成分上存在較大差異。

本研究從定性和定量?jī)蓚€(gè)方面對(duì)菟絲子、炒菟絲子和鹽菟絲子進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)價(jià)，通過多元統(tǒng)計(jì)分析手段研究菟絲子炮制前后指紋圖譜中特征成分的變化，明確區(qū)分炮制前后的特征峰，并測(cè)定了8 個(gè)主要藥效成分的含量，為優(yōu)選菟絲子炮制工藝提供參考。