綠茶、橘皮、大豆中酚類物質(zhì)體外消化前后穩(wěn)定性及抗氧化活性的研究

謝樂(lè)怡，張 兵，李紅艷

（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330047）

酚類化合物廣泛存在于水果、蔬菜、谷物以及茶葉中。研究表明，酚類化合物具有抗癌、抗腫瘤、清除自由基、降血脂等多種生物活性[1]。酚類化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多，主要包括黃烷醇類、黃烷酮類、異黃酮類、花色素類等。其中，異黃酮類化合物包括染料木素、大豆苷等；黃烷醇類化合物包括（+）-兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素等；黃烷酮類化合物包括柚皮素、橙皮苷等[2]。

酚類化合物發(fā)揮其生物活性作用的重要途徑是經(jīng)過(guò)人體口胃腸的消化，因此，研究酚類化合物消化穩(wěn)定性成為食品相關(guān)領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。模擬體外消化是通過(guò)模擬人體口腔、胃和小腸的消化環(huán)境來(lái)還原人體實(shí)際消化的過(guò)程，相對(duì)于體內(nèi)研究更加快速、簡(jiǎn)易、易于控制，成為研究食物在模擬體外消化中變化的重要途徑。朱秀靈等[3]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)模擬胃消化后，蘋(píng)果提取物中兒茶素、表兒茶素、咖啡酸含量大幅度降解，僅有綠原酸經(jīng)腸道消化后被檢測(cè)到，說(shuō)明經(jīng)胃腸消化提取物中的酚類物質(zhì)發(fā)生降解或轉(zhuǎn)化。Su 等[4]研究發(fā)現(xiàn)，胃蛋白酶和胰蛋白酶處理對(duì)柑橘果皮的TPC 和TFC 沒(méi)有顯著提高效果，但模擬體外消化提高了柑橘皮FRAP 和ABTS 的抗氧化能力。Guo 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，體外模擬胃腸消化（包括透析）后，未消化豆?jié){的TPC、FRAP 和DPPH 自由基清除活性顯著低于胃消化后的豆?jié){，而高于透析部位的豆?jié){。胃消化顯著增加了豆?jié){中生物活性物質(zhì)的釋放。

黃烷醇、黃烷酮、異黃酮類化合物廣泛存在日常膳食中，是三類具有代表性的酚類化合物。其中，茶葉中單體黃烷醇含量最高，柑橘皮中黃烷酮類化合物含量豐富，豆科植物尤其是大豆中異黃酮含量特別豐富。目前，少有研究比較黃烷醇、黃烷酮、異黃酮類化合物經(jīng)過(guò)體外消化前后穩(wěn)定性的變化及抗氧化活性的變化，因此，本研究選擇綠茶、橘皮、大豆作為黃烷醇、黃烷酮、異黃酮類化合物的食物代表，模擬體外消化過(guò)程，運(yùn)用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器/電噴霧-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)器（HPLCDAD/ESI-Q-TOF-MS）檢測(cè)消化前后綠茶、橘皮、大豆三種提取物酚類物質(zhì)變化，采用福林酚法、比色法、ABTS、DPPH、FRAP、ORAC 等方法檢測(cè)總酚、總黃酮含量以及抗氧化活性的變化。通過(guò)研究綠茶、橘皮、大豆中酚類物質(zhì)體外消化前后穩(wěn)定性及抗氧化活性的變化，為功能性食品研制及綜合開(kāi)發(fā)活性物質(zhì)提供一定的理論依據(jù)和科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

廬山云霧茶、云南蜜橘、南昌大豆 南昌市天虹超市；福林酚試劑、沒(méi)食子酸（純度≥98.0%，HPLC級(jí)）、蘆丁（純度≥98.0%，HPLC 級(jí)）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、α-淀粉酶（酶活為1500 U/mL）、胃蛋白酶（酶活為25000 U/mL）、胰蛋白酶（酶活為1500 U/mL）、水溶性維生素E（6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）、2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）、2,2-偶氮雙（2-甲基丙脒）二鹽酸鹽（AAPH）、熒光素鈉、2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA） 美國(guó)阿拉丁公司；豬膽鹽（160 mmol/L）北京索萊寶科技有限公司。

SHZ-A 型水浴恒溫振蕩器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；ELX800 型全自動(dòng)酶標(biāo)儀 Biotek 儀器股份有限公司；SK3310HP 型超聲波清洗器 上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；FD-1 型冷凍干燥機(jī) 北京德天佑科技發(fā)展有限公司；RE-85Z 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市英峪予華儀器廠；1200N 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、UPLC-ESIQ-TOF-MS 6538 型三重串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）儀 美國(guó)安捷倫公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 3 種物質(zhì)中酚類物質(zhì)的提取 取綠茶適量，粉碎，過(guò)60 目篩。稱取1 g 粉末于離心管中，加入20 mL的沸水，置于85 ℃恒溫水浴鍋中以60 r/min 轉(zhuǎn)速磁力攪拌避光提取10 min。提取完后冷卻至室溫，以5000 r/min 轉(zhuǎn)速4 ℃離心10 min，上清液濃縮后定容到10 mL。置于?20 ℃冰箱，密封避光保存。

柑橘去肉留皮，45 ℃烘干24 h，粉碎，過(guò)60 目篩。稱取1 g 橘皮粉末，加入20 mL 80%甲醇于40 ℃下，功率為60 W 超聲波清洗器中提取30 min，以4500 r/min 離心10 min，殘?jiān)偌?0 mL 相同提取劑重復(fù)提取兩次，合并上清液，濃縮后定容到50 mL。置于?20 ℃冰箱，密封避光保存。

大豆研磨成粉后過(guò)60 目篩，稱取1 g 大豆粉末，加入20 mL 的80%甲醇于功率為60 W 的超聲波清洗器中60 ℃提取30 min，以4500 r/min 離心10 min，殘?jiān)偌?0 mL 相同的提取劑重復(fù)提取兩次，合并上清液并轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器60 ℃下濃縮，再定容到50 mL。置于?20 ℃冰箱，密封避光保存。

1.2.2 模擬體外消化 采用Minekus 等[6]所描述的標(biāo)準(zhǔn)化模擬體外消化模型，并稍作修改。提前配制模擬唾液（SSF）、模擬胃液（SGF）和模擬腸液（SIF）。模擬唾液（SSF）、模擬胃液（SGF）和模擬腸液（SIF）由相應(yīng)的電解質(zhì)儲(chǔ)備液（如表1 所示）、酶、CaCl2和水組成，用6 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)SSF、SGF、SIF 的pH 分別為7、3、7。

表1 模擬消化液儲(chǔ)備液的制備Table 1 Preparation of stock solutions of simulated digestion fluids

在模擬口腔消化階段，吸取1.2.1 制成的三種提取物溶液各1 mL 與0.7 mL 模擬口腔消化電解質(zhì)儲(chǔ)備液混合。加入0.1 mLα-淀粉酶溶液（1500 U/mL），再加入5 μL 0.3 mol/L CaCl2和195 μL H2O。渦旋混合后置于恒溫水浴搖床中，在100 r/min 和37 ℃中避光振蕩2 min。

在模擬胃消化階段，將口腔階段的2 mL 混合物溶液不滅酶處理，與1.5 mL 模擬胃液消化電解質(zhì)儲(chǔ)備液混合，再添加0.32 mL 胃蛋白酶（25000 U/mL），1 μL CaCl2（0.3 mol/L），139 μL H2O，通過(guò)加入40 μL HCl（1 mol/L）使pH 達(dá)到3.0。將混合物渦旋后置于37 ℃水浴搖床（100 r/min）中避光振蕩2 h。

在模擬腸消化階段，將胃階段的4 mL 混合物不滅酶處理，加入模擬腸液消化電解質(zhì)儲(chǔ)備液（2.2 mL）、胰蛋白酶（800 U/mL）1 mL、膽汁鹽（160 mmol/L）0.5 mL、CaCl2（0.3 mol/L）8 μL、0.262 mL H2O、NaOH（1 mol/L）30 μL 混合至pH 7.0。將混合物混合均勻后在37 ℃、100 r/min 的水浴搖床中避光震蕩2 h。

每個(gè)消化階段結(jié)束后，用1 mol/L HCl 將消化樣品迅速酸化至pH2.0，以確保酶的失活和酚類化合物的穩(wěn)定性。收集各階段消化液，冷凍干燥置于?80℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 HPLC-DAD/ESI-Q-TOF-MS 對(duì)三種提取物消化前后酚類物質(zhì)的成分分析 取方法1.2.1 和1.2.2制成的樣品溶液及各階段消化液經(jīng)0.22 μm 有機(jī)相濾膜過(guò)濾，按以下色譜和質(zhì)譜條件，通過(guò)HPLCDAD/ESI-Q-TOF-MS 根據(jù)保留時(shí)間及掃描光譜對(duì)樣品中的酚類物質(zhì)進(jìn)行定性分析。根據(jù)色譜圖峰面積對(duì)樣品模擬體外消化過(guò)程中的酚類物質(zhì)進(jìn)行定量分析。

色譜條件（如表2 所示）：色譜柱：C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：流動(dòng)相A（0.1%甲酸水溶液）、流動(dòng)相B（0.1%甲酸乙腈溶液）。

表2 綠茶、橘皮、大豆高效液相色譜條件Table 2 High performance liquid chromatography of green tea,citrus peel and soybean

質(zhì)譜條件：全掃描模式：負(fù)離子，正離子；離子源：電噴霧離子源；離子源溫度：350 ℃；全質(zhì)譜數(shù)據(jù)的質(zhì)量范圍：（m/z）0～2000；ESI 噴霧電壓：5 kV；光電倍增器電壓：?1030 V。

消化過(guò)程中各階段酚類物質(zhì)的損失率（%）

1.2.4 總酚和總黃酮含量的測(cè)定 總酚含量測(cè)定：采用福林酚[7?8]法。25 μL 質(zhì)量濃度為31.25、62.5、125、250、500 μg/mL 的沒(méi)食子酸（Gallic acid，GAE）標(biāo)品或三種樣品提取液中加入125 μL 福林酚試劑于室溫條件在96 孔板中反應(yīng)10 min，再加入125 μL 飽和碳酸鈉溶液，室溫反應(yīng)30 min 后用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)765 nm 處測(cè)定吸光度。以吸光值為縱坐標(biāo)，沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.006x+0.1737（R2=0.9945）計(jì)算樣品中總酚含量?？偡雍恳訥AE 毫克數(shù)等量每克干質(zhì)量樣品原料（mg GAE/g DW）表示。所有樣品均測(cè)定3 次。

總黃酮含量的測(cè)定：采用王麗麗等[9]改良的比色法。25 μL 質(zhì)量濃度為12.5、25、50、100、125、250 和500 μg/mL 的蘆?。≧utin，RT）標(biāo)品或三種樣品提取液與110 μL 0.066 mmol/L NaNO2溶液在96 孔板中混合反應(yīng)5 min，再加入15 μL 0.75 mmol/L AlCl3·6H2O 溶液混合反應(yīng)6 min，最后加入100 μL 0.5 mmol/L NaOH 溶液混勻充分，15 min 后于波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)定吸光度。以吸光值為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0005x+0.0071（R2=0.9990）計(jì)算樣品中總黃酮含量。總黃酮含量以RT 當(dāng)量毫克數(shù)等量每克干質(zhì)量樣品原料（mg RT/g DW）表示。所有樣品均測(cè)定3 次。

1.2.5 抗氧化活性測(cè)定 取方法1.2.1 和1.2.2 制成的樣品溶液及各階段消化液。用無(wú)水甲醇溶液配制成不同質(zhì)量濃度的Trolox 標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.5.1 DPPH 自由基清除能力測(cè)定 稱取一定量DPPH 粉末，用無(wú)水甲醇配成0.26 mmol/L DPPH 溶液，超聲使粉末完全溶解。取20 μL 樣品提取液或Trolox 標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入96 孔板中，加入100 μL DPPH 溶液，室溫避光震蕩反應(yīng)30 min 后，用酶標(biāo)儀在517 nm 下測(cè)定吸光值[10]。

式中，Ai為樣品溶液加DPPH 溶液的樣品吸光值；Aj為樣品溶液加甲醇的底板吸光值；A0為樣品的溶劑加DPPH 溶液的空白吸光值；測(cè)定結(jié)果以Trolox 為參考標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表示為μmol Trolox（TE）/g干重（μmol Trolox（TE）/g DW）。

1.2.5.2 ABTS 自由基清除能力測(cè)定 取7.4 mmol/L ABTS 儲(chǔ)備液5 mL 和88 μL 140 mmol/L K2S2O8儲(chǔ)備液混勻，避光靜置12～14 h，制成ABTS+·工作液。測(cè)定前，80%乙醇稀釋ABTS+·工作液到吸光值在734 nm 下為0.7 左右，配成ABTS+·稀釋液。取20 μL樣品提取液或Trolox 標(biāo)準(zhǔn)品溶液在96 孔板中與200 μL ABTS+·稀釋液避光震蕩反應(yīng)6 min，用酶標(biāo)儀在734 nm 下測(cè)定吸光值[11?12]。

式中，Ai為樣品溶液加ABTS+·稀釋液的樣品吸光值；Aj為樣品溶液加80%乙醇的底板吸光值；A0為樣品的溶劑加ABTS+·稀釋液的空白吸光值。

1.2.5.3 FRAP 鐵離子還原能力測(cè)定 將300 mmol/L醋酸緩沖液、10 mmol/L TPTZ 在40 mmol/L HCl 溶液和20 mmol/L FeCl3·6H2O 中按10:1:1（v/v/v）比例混合制成FRAP 工作液。向96 孔板中加入10 μL樣品提取液或Trolox 標(biāo)準(zhǔn)品溶液與300 μL FRAP工作液室溫避光反應(yīng)6 min。然后在波長(zhǎng)593 nm 處測(cè)定吸光度[13]。測(cè)定結(jié)果以Trolox 為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表示同上。

1.2.5.4 ORAC 氧化自由基吸收能力測(cè)定 25 μL 樣品提取液或Trolox 標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于黑色96 孔板中，加入150 μL FL（Fluorescein sodium，熒光素鈉）溶液（8×10?5mmol/L）震蕩5 min 后，在37 ℃下孵育30 min，全程避光。孵育完成后迅速加入25 μL AAPH 溶液（153 mmol/L）啟動(dòng)反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在37 ℃下以激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)528 nm 記錄熒光值，持續(xù)120 min，每分鐘記錄1 次，直到熒光值達(dá)到零。將測(cè)得的熒光強(qiáng)度折合成初始熒光強(qiáng)度的相對(duì)值，把熒光曲線下的面積積分，用樣品熒光面積減去空白熒光面積得到凈面積，將樣品溶液的凈面積同Trolox 參照的凈面積做比較來(lái)評(píng)價(jià)抗氧化活性[14]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件的單因素方差分析（ANOVA）和Duncan 多重比較法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)（P<0.05），Origin 9.1 軟件作圖，所有測(cè)定重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC-DAD/ESI-Q-TOF-MS 對(duì)三種提取物消化前后酚類物質(zhì)的組成成分分析

利用HPLC-DAD/ESI-Q-TOF-MS 方法對(duì)體外消化前后綠茶提取物中含量較高的酚類化合物進(jìn)行分析。根據(jù)圖1 和表3，確定了表沒(méi)食子兒茶素（EGC）、（+）-兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）以及表兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）共4 種酚類化合物?；衔?（保留時(shí)間17.859 min）的母離子[M-H]-m/z 305.0670 分子式推定為C15H14O7，特征碎片離子包括m/z 167.0947[M-H-C7H6O3]-、m/z 125.0246[M-HC9H10O4]-，根據(jù)文獻(xiàn)[15]判斷為EGC?；衔?（保留時(shí)間18.558 min）的母離子[M-H]-m/z 289.0725 分子式推定為C15H14O6，特征碎片離子為m/z 205.0500[M-H-C4H2O2]-，根據(jù)文獻(xiàn)[15]鑒定為（+）-兒茶素。化合物3（保留時(shí)間20.639 min）的母離子[M-H]-m/z 457.0786 分子式推定為C22H18O11，特征碎片離子有m/z 306.0201[M-H-C7H4O4]-、m/z 169.0146[M-HC15H12O6]-、m/z 193.0141[M-H-C13H12O6]-，該化合物為EGCG[15]?；衔?（保留時(shí)間23.156 min）的母離子[M-H]-m/z 441.0837 分子式推定為C22H18O10，特征碎片離子有m/z 289.0714[M-H-C7H4O4]-、m/z 125.0240[M-H-C16H12O7]-，該化合物為ECG。

圖1 模擬體外消化過(guò)程中綠茶提取物中酚類物質(zhì)的HPLC 圖譜變化Fig.1 HPLC chromatogram changes of polyphenols in green tea extract during simulated in vitro digestion

表3 模擬體外消化過(guò)程中綠茶提取物中酚類物質(zhì)的組分變化Table 3 Component changes of polyphenols in green tea extract during simulated in vitro digestion

根據(jù)色譜圖峰面積對(duì)綠茶提取物模擬體外消化過(guò)程中的酚類物質(zhì)進(jìn)行定量分析，從而得到模擬體外消化中多酚類化合物含量的變化。模擬體外消化過(guò)程中各階段損失率的計(jì)算公式見(jiàn)1.2.3。其中，口消化損失率是指經(jīng)過(guò)口腔模擬消化后，酚類物質(zhì)的損失率，胃消化損失率是指經(jīng)過(guò)口腔和胃模擬消化后，酚類物質(zhì)的損失率，腸消化損失率是指經(jīng)過(guò)口腔、胃和小腸模擬消化后，酚類物質(zhì)的損失率。

由表3 可知，與未消化相比，4 種酚類物質(zhì)在模擬口腔消化階段含量均降低，損失率大小為：EGCG（52.87%）>ECG（52.33%）>EGC（21.43%）>（+）-兒茶素（7.75%）；經(jīng)過(guò)胃消化階段，相比消化前，4 個(gè)酚類物質(zhì)含量有所降低，其中，EGC 和（+）-兒茶素的損失率相較于其它兩個(gè)酚類物質(zhì)較低，這與Wu 等[16]研究綠茶多酚在體外消化過(guò)程兒茶素含量的變化結(jié)果一致。說(shuō)明EGC 和（+）-兒茶素比EGCG、ECG 更穩(wěn)定，Neilson 等[17]也得出相似的結(jié)論。在模擬腸液消化階段，（+）-兒茶素?fù)p失率達(dá)89.11%，其余三種酚類物質(zhì)幾乎完全降解，這是因?yàn)槟c道的堿性條件使茶多酚降解，pH 升高、殘余溶解氧以及正常消化功能中可能存在的活性氧可能會(huì)促進(jìn)多種反應(yīng)，包括腸腔中的差向異構(gòu)化和自氧化。但由于（+）-兒茶素不具有酯基，酚羥基較少，故較其余三種酚類物質(zhì)更穩(wěn)定[18]。

由圖2 和表4 可知，對(duì)橘皮提取物中含量較高的酚類物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，確定了柚皮苷、橙皮苷2 種酚類物質(zhì)?；衔?（保留時(shí)間8.926 min）母離子[M-H]-m/z 579.1753 分子式推定為C27H32O14，特征碎片離子有[M-H]-m/z 272.0654，丟失了分子量為308 Da（鼠李糖-葡萄糖苷）的碎片。根據(jù)文獻(xiàn)[19]判斷該化合物為柚皮苷?；衔?（保留時(shí)間10.106 min）母離子[M-H]-m/z 609.1863 分子式推定為C28H34O15，特征碎片離子有[M-H]-m/z 302.0760，在二級(jí)質(zhì)譜中丟失了鼠李糖-葡萄糖苷雙糖部分。根據(jù)文獻(xiàn)[17]判斷該化合物為橙皮苷。

圖2 模擬體外消化過(guò)程中橘皮提取物中酚類物質(zhì)的HPLC 圖譜變化Fig.2 HPLC chromatogram changes of polyphenols in citrus peel extract during simulated in vitro digestion

由表4 可知，與未經(jīng)消化階段相比，橘皮提取物中柚皮苷和橙皮苷在模擬口腔消化階段含量降低，損失率分別為5.39%和15.05%。與口腔消化階段相比，柚皮苷和橙皮苷在經(jīng)過(guò)胃液模擬消化階段后，損失率降低，峰面積增大，含量升高。這可能是因?yàn)樵谒嵝原h(huán)境和消化酶的作用下酚類物質(zhì)從基質(zhì)中釋放出來(lái)。在腸液消化階段，柚皮苷腸液消化階段損失率比口腔階段損失率增加1 倍，橙皮苷經(jīng)過(guò)口腔、胃、腸消化后穩(wěn)定性比柚皮苷更差[20]。有研究表明，橘子果汁在體外腸道消化的堿性條件下，55%～65%的黃烷酮會(huì)轉(zhuǎn)化成另一種具有不同化學(xué)和物理性質(zhì)的化合物，如查爾酮[20]。

表4 模擬體外消化過(guò)程中橘皮提取物中酚類物質(zhì)的組分變化Table 4 Component changes of polyphenols in citrus peel extract during simulated in vitro digestion

由圖3 和表5 可知，參考文獻(xiàn)[21]和數(shù)據(jù)庫(kù)等，對(duì)大豆提取物中含量較高的酚類物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，確定了大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素。

圖3 模擬體外消化過(guò)程中大豆提取物中酚類物質(zhì)的 HPLC圖譜變化Fig.3 HPLC chromatogram changes of polyphenols in soybean extract during simulated in vitro digestion

化合物1（保留時(shí)間7.137 min）的母離子[M+HCOO]-為461.1116，分子式推定C21H20O9。母離子失去葡萄糖分子產(chǎn)生m/z 為[M-H-glc]-253.0503的碎片離子，結(jié)合保留時(shí)間、數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)[21]等信息，該化合物鑒定為大豆苷。化合物2（保留時(shí)間11.863 min）的母離子[M-H]-為431.0997，分子式推定為C21H20O10，特征碎片離子m/z 為269.0463 為染料木素的結(jié)構(gòu)，根據(jù)文獻(xiàn)[22]，該化合物鑒定為染料木苷?；衔? 保留時(shí)間為13.368 min，母離子[M-H]-為253.0518，分子式推定為C15H10O4，特征碎片離子為m/z 180.0585[M-H-C7H4O2]-、m/z 133.0296[M-H-C2H1O1]-，根據(jù)文獻(xiàn)[22]，化合物3 為大豆苷元?；衔? 保留時(shí)間為18.940 min，m/z 269.0466[M-H]-，分子式C15H10O5，碎裂分別產(chǎn)生2 個(gè)主要的二級(jí)離子m/z 133.0300[M-H-C8H6O2]-和107.0141[M-H-C9H6O3]-，根據(jù)文獻(xiàn)[22]，化合物4 為染料木素。

由表5 可知，與未經(jīng)消化階段相比，4 個(gè)酚類物質(zhì)的含量經(jīng)過(guò)體外消化均發(fā)生不同程度的降低。經(jīng)過(guò)口腔消化階段，大豆苷元損失率最低（5.45%），染料木苷損失率最高（29.79%），經(jīng)過(guò)胃液消化后，大豆苷元和染料木素較口消化階段損失率降低，而大豆苷和染料木苷較口消化階段損失率增加，說(shuō)明可能在消化過(guò)程中大豆苷和染料木苷糖苷鍵斷裂轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的苷元[23]。在模擬腸液消化階段，4 個(gè)酚類物質(zhì)含量均有所降低，損失率大?。捍蠖管赵?9.74%）>染料木苷（49.13%）>染料木素（44.94%）>大豆苷（31.22%）。由于異黃酮苷元在水基質(zhì)中的溶解性差，在腸消化階段，一部分異黃酮化合物在消化液的水部分膠束化，形成沉淀，導(dǎo)致含量降低。經(jīng)過(guò)模擬體外消化，大豆苷與其余3 個(gè)異黃酮相比損失更少，更穩(wěn)定。這與Walsh 等[24]得到的結(jié)論一致。

表5 模擬體外消化過(guò)程中大豆提取物中酚類物質(zhì)的組分變化Table 5 Component changes of polyphenols in soybean extract during simulated in vitro digestion

2.2 模擬體外消化對(duì)三種提取物總酚含量的影響

體外消化前后，三種樣品總酚含量變化如圖4所示。由圖4 可知，三種提取物的總酚含量在口腔、胃、腸道消化階段呈現(xiàn)先降低再升高再降低的趨勢(shì)。在消化前綠茶提取物總酚含量為（81.84±1.62）mg GAE/g DW；口腔消化后，總酚含量降低為（69.45±2.78）mg GAE/g DW；經(jīng)胃消化后，總酚含量顯著增加（P<0.05），含量達(dá)到（96.31±1.37）mg GAE/g DW，較消化前提高了17.68%。在腸消化階段，總酚含量顯著降低（P<0.05），為（33.25±0.55）mg GAE/g DW，較胃消化階段降低了65.48%（P<0.05），較未消化時(shí)降低了59.37%（P<0.05）。茶葉中的主要多酚物質(zhì)是茶多酚，胃的酸性環(huán)境有利于茶多酚的穩(wěn)定，Record等[25]研究消化對(duì)不同品種茶葉的變化發(fā)現(xiàn)，在胃消化的酸性條件下，茶葉中兒茶素穩(wěn)定，而小腸堿性環(huán)境下兒茶素含量快速下降。橘皮的總酚含量變化趨勢(shì)與綠茶一致，在口腔消化階段下降，經(jīng)胃腸消化階段呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，徐洪宇等[26]研究石榴皮提取物在體外消化過(guò)程中總酚釋放量也呈現(xiàn)與本研究相似的趨勢(shì)。與未消化組相比，大豆提取物經(jīng)口腔消化后總酚含量顯著降低（P<0.05），經(jīng)胃消化后，大豆提取物的總酚含量顯著增加（P<0.05），相比口腔消化階段升高了1.64 倍。腸消化后總酚含量顯著降低（P<0.05）。這與劉國(guó)艷等[27]研究芹菜汁在體外消化過(guò)程中總酚含量的變化結(jié)果一致。

圖4 大豆、綠茶、橘皮三種提取物體外消化前后總酚含量變化Fig.4 Changes of total phenolic content of soybean,green tea and citrus peel extracts during simulated in vitro digestion

在胃消化過(guò)程中酚類化合物顯著增加（P<0.05），主要是由于胃消化過(guò)程中的酸性條件和相關(guān)的酶導(dǎo)致酚類物質(zhì)的水解，從而導(dǎo)致酚類含量升高。此外，酸性pH 可能會(huì)促進(jìn)一些多酚-蛋白質(zhì)絡(luò)合物從食物中釋放出來(lái)，從而釋放更多的游離多酚。大豆在口、腸消化階段中總酚含量降低可能是由于異黃酮的溶解度較低，在消化過(guò)程中與某些成分結(jié)合，形成分子量較大的絡(luò)合物。這些絡(luò)合物形成沉淀經(jīng)離心步驟后棄去，因此酚類含量降低[20]。

2.3 模擬體外消化對(duì)三種提取物總黃酮含量的影響

如圖5 所示，三種提取物總黃酮含量均在胃消化階段顯著增加（P<0.05），除橘皮在腸消化階段沒(méi)有顯著變化外，綠茶、大豆在腸消化階段總黃酮含量顯著降低（P<0.05），與總酚含量變化規(guī)律一致。經(jīng)過(guò)口腔、胃消化，綠茶總黃酮含量分別增加了14.40%、70.55%；與口腔消化階段相比，橘皮提取物經(jīng)過(guò)胃消化后，總黃酮含量增加了28.73%；與口腔消化階段相比，大豆提取物經(jīng)過(guò)胃消化中總黃酮含量增加了1.48 倍；在胃消化過(guò)程黃酮含量增加，一方面可能是低pH 降低了分子間的作用力，結(jié)合型黃酮發(fā)生水解，水解過(guò)程中增大物質(zhì)的溶解性[28]。另一方面，酸性pH 會(huì)促進(jìn)一些與蛋白質(zhì)絡(luò)合的黃酮化合物釋放出來(lái)，黃酮含量增加。在腸消化過(guò)程黃酮含量減少是由于大部分黃酮在水解過(guò)程中易與O2結(jié)合，發(fā)生氧化反應(yīng)。腸道中pH 較高，酚類物質(zhì)會(huì)發(fā)生降解，且異黃酮的溶解度較低，與酶等其他成分形成膠束體沉淀后被離心過(guò)濾掉，也可能是含量降低的原因之一。

圖5 大豆、綠茶、橘皮三種提取物體外消化前后總黃酮含量變化Fig.5 Changes of total flavonoids content of soybean,green tea and citrus peel extracts during simulated in vitro digestion

Neilson 等[17]發(fā)現(xiàn)，在體外消化實(shí)驗(yàn)中，酸性環(huán)境對(duì)兒茶素幾乎沒(méi)影響，而中性或堿性環(huán)境下極不穩(wěn)定，在小腸環(huán)境中，兒茶素類衍生物發(fā)生降解，損失量是胃環(huán)境中的10～20 倍。柑橘黃酮多以糖苷的形式存在在腸消化階段，糖苷中的酯鍵可能在腸消化階段被胰酶水解，因而黃酮含量在腸消化過(guò)程中降低。經(jīng)過(guò)腸消化，三種提取物的總黃酮含量顯著降低，黃酮物質(zhì)的含量降幅達(dá)70%以上，這與從彥麗等[29]研究體外模擬胃腸消化過(guò)程中柑橘總黃酮含量變化的結(jié)果一致。

2.4 模擬體外消化對(duì)三種提取物抗氧化活性的影響

本研究選擇ABTS、DPPH、FRAP、ORAC 四種基于不同機(jī)理的抗氧化能力分析方法，通過(guò)不同評(píng)價(jià)方法全面地評(píng)估三種提取物的抗氧化能力水平。

如表6 所示，在四種抗氧化評(píng)價(jià)方法中，綠茶表現(xiàn)出較高的抗氧化活性。ABTS+·的清除能力表現(xiàn)為未消化>胃>口腔>小腸。FRAP 抗氧化方法和ORAC抗氧化方法與ABTS+·的清除能力規(guī)律一致。Rusak等[30]在研究抹茶和綠茶提取物在體外消化過(guò)程中的抗氧化活性變化時(shí)，也發(fā)現(xiàn)與本實(shí)驗(yàn)一致的規(guī)律。綠茶的抗氧化能力與其總酚含量之間強(qiáng)相關(guān)，說(shuō)明綠茶中的酚類物質(zhì)是影響其抗氧化能力的主要成分。從大豆提取物消化前后抗氧化能力的變化可見(jiàn)，除了ABTS+·清除能力和FRAP 抗氧化能力在口腔階段顯著降低（P<0.05）外，其DPPH、ORAC 抗氧化能力在口腔和胃消化階段顯著升高（P<0.05），在腸消化階段顯著降低（P<0.05）。這可能是因?yàn)榇蠖怪械挠坞x酚在口腔消化過(guò)程中溶出而釋放，所以在口腔消化階段抗氧化活性升高。結(jié)合酚經(jīng)胃消化酶的作用后釋放，導(dǎo)致抗氧化能力升高。此外，在消化過(guò)程中，帶有糖苷的酚類物質(zhì)會(huì)水解為苷元部分，后者抗氧化能力更高，這也可能是經(jīng)消化后抗氧化能力提高的原因之一[31]。從橘皮提取液消化前后抗氧化能力變化可見(jiàn)，除在腸消化階段ORAC 值顯著升高（P<0.05），ABTS、FRAP 值在體外消化階段和總酚含量變化一致。有研究發(fā)現(xiàn)[32]，柚皮苷和橙皮苷的結(jié)構(gòu)會(huì)隨pH 變化發(fā)生改變，導(dǎo)致腸消化階段抗氧化能力下降。

表6 三種提取物體外消化前后的抗氧化活性變化Table 6 Changes of antioxidant activities of three extracts during simulated in vitro digestion

化合物的抗氧化能力與其所含酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性是密切相關(guān)的。綠茶多酚的抗氧化活性主要?dú)w功于芳香環(huán)和羥基的結(jié)合，這些羥基組成了它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并通過(guò)這些羥基與脂質(zhì)自由基結(jié)合和中和。一般情況下，直接連接到苯環(huán)碳原子（3,5,7 和3',4'-二羥基取代形式）的-OH 基團(tuán)的存在決定了酚類物質(zhì)的抗氧化作用。羥基基團(tuán)在黃酮化合物中的數(shù)量和位置對(duì)其抗氧化活性會(huì)產(chǎn)生較大影響[33]。黃烷醇類化合物中C 環(huán)上的3-OH 在抗氧化活性中起著重要的作用，3-OH 的存在顯著提高了抗氧化活性，這是黃烷醇抗氧化活性強(qiáng)的重要原因之一。異黃酮由于C 環(huán)2,3 雙鍵及B 環(huán)上缺乏鄰苯二酚結(jié)構(gòu)降低了抗氧化活性[34]。此外，低溶解度也是影響其抗氧化活性的原因之一。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用模擬體外消化模型，研究了黃烷醇、黃酮醇、異黃酮類化合物中具有代表性的食物（綠茶、橘皮、大豆）在口腔、胃、小腸消化過(guò)程中主要酚類物質(zhì)含量、總酚含量、總黃酮含量及抗氧化活性的變化規(guī)律。發(fā)現(xiàn)綠茶提取物中酚類化合物經(jīng)過(guò)模擬體外消化后最不穩(wěn)定，除了 (+)-兒茶素之外其余酚類物質(zhì)幾乎降解完全。橘皮提取物中酚類化合物相較于綠茶和大豆提取物更穩(wěn)定，大豆提取物中酚類化合物穩(wěn)定性較差。在抗氧化能力方面，綠茶的抗氧化能力最強(qiáng)，其次是柑橘皮，大豆的抗氧化能力最弱。本研究結(jié)果為研究富含黃烷醇、黃酮醇、異黃酮類化合物的食品研究提供一定的理論依據(jù)和科學(xué)指導(dǎo)。同時(shí)也為綠茶、橘皮、大豆提取物在保健食品等領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)及綜合開(kāi)發(fā)活性物質(zhì)應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。但綠茶、橘皮、大豆提取物中的化學(xué)成分因其自身性質(zhì)差異在模擬口胃腸道環(huán)境中表現(xiàn)出不同的穩(wěn)定性，其結(jié)構(gòu)變化、降解途徑、代謝產(chǎn)物及各成分之間是否存在相互作用仍值得進(jìn)一步探究。